Name: Extractie van Venom en Venom Gland Microdissections van Spinnen voor proteoom en transcriptoom Analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer gifextractie en klierdissectie bij spinnen voor transcriptoom- en proteoomanalyses met elektrische stimulatie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar gifcompositie en genexpressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ik dank de volgende personen voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier en Mays Imad. Massaspectrometrie en proteomics data werden verworven door de Arizona Proteomics Consortium ondersteund door NIEHS subsidie ​​ES06694 de SWEHSC, NIH / NCI subsidie ​​CA023074 de AZCC en door de BIO5 Instituut van de Universiteit van Arizona. De financiering van dit werk werd geleverd door de National Institutes of Health (Nationaal Instituut voor Algemene Geneeskunde) uit subsidies 1F32GM83661-01 en 1R15GM097714-01 aan Jessica E. Garb.

1. Voorbereiding van de Electro-stimulator Apparatus <ol><li> Sluit elektro-stimulator netsnoer in het stopcontact en sluit de externe voetpedaal om het externe ingangssignaal. Opmerking: Elektrische draden zijn goed geïsoleerd en blootgestelde metalen leveren van stroom mag niet worden aangeraakt. Draag latex of nitril handschoenen voor bescherming. Elektro-stimulator stroomschakelaar moet in OFF positie wanneer het bevestigen netsnoer en bevestigen van kabels. </li><li> Sluit de positieve elektrode naar rood-uitgang op elektro-stimulator (wanneer polariteitsschakelaar is in de normale modus) en sluit de negatieve elektrode naar de zwarte uitgang. Opmerking: Elke elektrode draad moet eindigen in een alligator clip. </li><li> Stel stimulator aan de volgende aanbevolen initiële instellingen: spanning = 7 V, Frequentie = 1 pulsen per seconde, delay = 0 milliseconden, duur = 200 milliseconden, twee pulsen schakelen = reguliere en mode switch = off. </li><li> Test output van de elektroden door het aanbrengen van krokodillenklemmen aan voltmeter positieve en negatieve test leads. Schakel de stimulator uit-schakelaar en leveren stroom met voetpedaal. </li></ol> 2. Voorbereiding voor het immobiliseren van tang en andere materialen <ol><li> Dompel een riek van vedergewicht pincet in vloeibare kunststof coating en wacht vier uur aan coating te laten drogen. Wikkel 15 mm van het uiteinde van de tegenpartij riek met een enkele laag van katoen naaigaren, en veilig draad door koppelverkoop het einde in een knoop. : De draad wordt gebruikt om een ​​toegepaste zoutoplossing die elektrische geleidbaarheid bevordert absorberen, terwijl de kunststof coating isolatie vertragen stroom. </li><li> Snijd puntje van stompe injectienaald met een scherpe schaar en glad de opening met schuurpapier. Bevestig de naald aan een vacuüm sifon (bijvoorbeeld vacuüm filtreerkolf) via buizen. Opmerking: De naald weg zal zuigen water en braken, en zal dienen om het circuit gecreëerd door de stimulator elektrodes te voltooien. De naald opening must zijn klein genoeg om de spin niet schadelijk, maar toch groot genoeg om vacuüm oplossing zonder verstopping (bijvoorbeeld, 25 G x 1 ½ in gauge, zie Materials List). </li><li> Positie vedergewicht forceps horizontaal in een goed gesloten positie met een vinyl tweeledige klem bevestigd aan een magnetische basis of vaste stand apparaat onder gezichtsveld een dissectie microscoop met kunststof beklede prong pincet boven en draad bekleed uitsteeksel onder. Opmerking: De tweeledige klem wordt gehandhaafd in een stilstaande positie om de magnetische voet door een klem houder (zie Materials List). Een rubberen band kan stevig worden vastgemaakt rond tanden van de tang vedergewicht, naast de klemhouder, om extra druk aan het vedergewicht forceps in een gesloten positie rond de spin eenmaal ingevoerd add. </li><li> Bevestig positieve elektrode alligator clip naar beneden tand tang &#39;stroomopwaarts van draad en bevestig negatieve alligator clip op metalen vacuüm naald stomp. </li&gt; <li> Testcircuit stroom met voltmeter door het plaatsen van positieve draad op een tang tand tussen de draad en de alligator clip en het plaatsen van negatieve draad op botte vacuüm naald. Druk op het voetpedaal om voldoende stroom wordt gedetecteerd en verwijderd leads als er voldoende stroom wordt gedetecteerd. </li><li> Bereid verschillende microcapillaire buizen voor gif collectie. Houd één microcapillaire buis aan één uiteinde voorzien van een gehandschoende hand en aan de andere kant met een steriele metalen tang, het plaatsen van de tang-held einde horizontaal boven een bunsenbrander vlam. Trek aan de microcapillaire met de metalen tang uit de buurt van de vlam tot een langgerekte tip te creëren, terwijl het andere uiteinde in een stilstaande positie. Opmerking: Draag een veiligheidsbril als microcapillairen gemakkelijk kunnen breken. </li><li> Rusten bereid microcapillairen op een montage kit strip in een petrischaaltje. Onderzoeken microcapillaire eindigt onder een dissectie microscoop en een kleine, schuine opening aan het eind trok met gesteriliseerd metalen tang. </li><li> Label variabel aantal steriele 0,5 ml buisjes. Voeg steriel, gedeïoniseerd water buizen steriel (bijvoorbeeld 5 ul geautoclaveerd gedeioniseerd water). Sluiten buizen en plaats buisjes op ijs. </li><li> Bereid zoutoplossing in een beker en vul een tweede beker met geautoclaveerd water. </li></ol> 3. Immobilisatie van Spin in tang <ol><li> Schakel CO 2 tank en breng spin uit gesloten plastic verzamelen flacon (zie Materials List) in CO 2 kamer met behulp van lange metalen tang. Opmerking: zwarte weduwe spinnen gevaarlijk gif; Draag altijd handschoenen tijdens dit protocol. </li><li> Houd spin in kamer voor 5-10 minuten of totdat verdoofde en beweegt niet meer toen zachtjes porde met een lange pincet. Gebruik transferpipet naar draad nat op een tang met een zoutoplossing. Opmerking: Voor richtlijnen over CO 2 anesthesie parameters voor zwarte weduwen, verwijzen naar Spagna en Moore 19. </li><li> Ophalen verdoofde spin van CO 2kamer door picking it up door zijn voorste poten met behulp van bot ontleden tang en handschoenen aan. Verplaats verdoofd spider om tang apparaat vedergewicht. Afzonderlijke tanden van gesloten vedergewicht pincet en plaats kopborststuk van de spin in tussen de tanden en laat de tanden te dicht shut om spin te zorgen is stevig op zijn plaats gehouden, maar niet wordt geplet. Zorg ervoor dat de spin wordt geplaatst rugschild dorsum kant naar beneden (zie Foelix 20 voor gids voor spin anatomie), rustend op draad gecoat riek, en buikzijde het kopborststuk&#39;s met uitzicht op de plastic coating, terwijl de positieve elektrode blijft gehecht aan onderkant riek. Werk snel bij de omgang met spin. </li><li> Pas dissectiemicroscoop vergroting, focus, en de lichtbron tot cheliceren van de spin en de tanden zijn duidelijk zichtbaar. </li></ol> 4. Venom Collection <ol><li> Schakel vacuüm en spray spider chelicerae met water oplossing met behulp van een tweede stompe getipt spuit needle. Zuig weg water met vacuüm naald om onzuiverheden te verwijderen. </li><li> Raak het vacuüm naald met aangehechte negatieve elektrode aan spider rostrum en leveren puls met voetpedaal één of meerdere keren. Vacuum weg braken indien nodig. Opmerking: spider rostrum is in de mond van posterior naar chelicerae op dorsale oppervlak tussen chelicerae en endites (zie Foelix 20 voor gedetailleerde spider anatomie). Opmerking: Bij elke puls, zal de spin benen contract, en gif zichtbaar als heldere druppels die uit giftanden. </li><li> Verzamel gif druppels met microcapillaire tip en overdracht capillaire tip in 0,5 ml buis met water of bufferoplossing (oplossing zal worden meegezogen in capillair). Let op: niet te beschadigen spin met capillaire wat kan leiden tot hemolymph besmetting en dood. Ook besmetting van capillaire voorkomen met zijde en lijm van spintepels. </li><li> Hechten overdracht spuiten met buisadapter om microcapillaire (aan het eind tegenover collectie tip) en dispense gif oplossing terug in de buis. Zet buis op ijs. Opmerking: Verwijdering van afval haarvaten in een nabijgelegen naaldencontainer. </li><li> Plaats open plastiek verzamelen flacon, samen met de pet, dicht bij de spin. Pak het spin benen met stompe dissectie tang gehouden in de ene hand en zorgvuldig geopend vedergewicht tang tanden met de andere hand, glijden spin in het verzamelen flacon met stompe tang en snel dicht cap. Ga verder met de volgende spin en store-gif die buizen in -80 ° C vriezer wanneer u klaar bent. Opmerking: blijven voorzichtig te zijn bij het verplaatsen van de spin van de tang terug in de flacon. Zorg ervoor dat het verzamelen flesje en de dop is in de buurt om de spin voor de snelle overdracht en handschoenen dragen. </li></ol> 5. Venom Gland Dissecties <ol><li> Twee tot drie dagen na het gif collectie, verdoven spin in CO 2 kamer (zie stap 3.1). Vul vloeibare stikstof vervoerder en naast dissectiemicroscoop. Opmerking: when het werken met vloeibare stikstof, bescherming gebruik oog en cryogene handschoenen. </li><li> Schone dissectie gebied en ontleden tang met oplossing die RNase en DNA besmetting elimineert. Vul een kleine petrischaal onder dissectiemicroscoop met ontleden buffer (bijvoorbeeld 1x zoutoplossing-natriumcitraat (SSC) buffer) geplaatst. </li><li> Transfer spin van CO 2 kamer tot petrischaaltje en een tang om het kopborststuk snel scheiden van de buik. </li><li> Houd het kopborststuk onder de dissectiemicroscoop met een pincet en plaats de chelicerae in gezichtsveld. Gebruik de scherpe uiteinden van een tweede pincet om opperhuidbesnoeiing toetreding tot de schaal van de laterale aspecten van de cheliceren. Lateraal begrijpen chelicerae behulp van de tweede pincet en trek zachtjes heen en weer tot gifklieren worden uitgetrokken. </li><li> Afzonderlijke klieren uit de chelicerae (of laat gehecht aan chelicerae indien gewenst) en overbrengen in een cyrosafe 0,5 ml tube. Plaats closed buis in vloeibare stikstof. Opmerking: elke dissectie mag niet meer dan 15 minuten duren. </li><li> Herhaal dissectie met extra spinnen tot het werk klaar. Overdrachtsbuizen van vloeibare stikstof in -80 ° C vriezer. </li></ol>

<ol><li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicogenomic+multiverse%3A+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genom.+Hum.+G%22%5BJournal%5D)">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li>
<li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venomics%3A+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li>
<li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides%3A+An+emerging+class+of+drug+leads%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Disc%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li>
<li>Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+cocktails%3A+the+evolutionary+novelty+of+venoms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li>
<li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+aspects+of+spider+bites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li>
<li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li>
<li>Silva, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso%2FTeneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li>
<li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ziconotide%3A+an+update+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li>
<li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+paint%3A+a+chlorotoxin%3ACy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li>
<li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution%2C+functional+variation%2C+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li>
<li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+%CE%B1-latrotoxin%2C+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li>
<li>Platnick, N. I. The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , Available online at:
 
 <a target="_blank" href="http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html">http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html</a> (2013).</li>
<li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li>
<li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider-venom+peptides%3A+Structure%2C+pharmacology%2C+and+potential+for+control+of+insect+pests%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li>
<li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venom+landscapes%3A+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li>
<li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxin+Rev%22%5BJournal%5D)">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li>
<li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li>
<li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+activity+of+a+novel+%CE%B1-latrotoxin+from+red-back+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li>
<li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+%28Arachnida%3A+Theridiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pan-Pac.+Entomo.+l%22%5BJournal%5D)">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li>
<li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoelix%2C+R+%22Biology+of+Spiders%22">Biology of Spiders</a>. , Oxford University Press. (2010).</li>
<li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366(2014).</li>
<li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+%28latrodectin%29+which+co-purifies+with+the+%CE%B1-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+%28Theridiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li>
<li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+%28Latrodectus+tredecimguttatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li>
<li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li>
<li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+%28Agelenidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li>
<li>Alape-Girón, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper%3A+geographic%2C+individual%2C+and+ontogenetic+variations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen en geen concurrerende financiële belangen.

Vergiften een belangrijke bron van fysiologisch reactieve proteïnen, peptiden en andere moleculen met de toepassingen voor geneesmiddelenonderzoek, maar ook de fundamentele aspecten van cellulaire en ecologisch onderzoek 1-3. Echter, het verzamelen van gif, in het bijzonder van gevaarlijke of kleine dieren, is een uitdagende taak. Dit protocol laat zien hoe gif en gifklieren kunnen worden afgehaald bij zwarte weduwe spinnen, en bevestigt het succes van deze aanpak via een combinatie van MuDPIT analyse van het gif en een eiwit databank afgeleid van cDNA&#39;s gekloond van gifklieren 21. Hoewel dit protocol werkt goed voor zwarte weduwen en middelgrote spinnen, andere gif verzameling technieken zijn gebruikt voor grotere mygalomorph (tarantula-achtige) spinnen, zoals directe aspiratie van gif uit giftanden in glas pipetten bv, 24. Deze laatste benadering is echter , zal niet goed werken voor kleinere spinnen die niet aggressive. Een bijzonder kritisch aspect van het gif verzameling protocol hier beschreven is de eerste fase van voorbereiding en optimalisering van de collectie proces zodat het meer routinematige, consistente en sneller. Het protocol is in eerste instantie een uitdaging om te beheersen, maar met herhaalde proeven, wordt het gemakkelijker en sneller. Voorzichtigheid is ook aangedrongen op alle kritieke fases die de hantering van gevaarlijke spinnen, het gebruik van elektrische stroom, fine-point glazen micro haarvaten, en injectienaalden. Het is belangrijk om de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen zoals nitril handschoenen, een laboratoriumjas, lange broek en gesloten schoenen, alsook een veiligheidsbril bij het vormgeven van micro haarvaten. Een uitdagend aspect aan gif collectie is de kleine hoeveelheid gif geproduceerd door één spin, vooral Latrodectus soorten, waarvan de bedragen worden verzameld, kunnen li zijnmited 1-2 microliter per individu best. Verkrijgen van voldoende gif voor verdere toepassingen, zoals proteïne gels of functionele testen kunnen de combinatie van gif uit meerdere individuen in één buis vereist. In dergelijke gevallen moet het gif alleen worden gecombineerd uit personen van hetzelfde geslacht, ontogenetische podium, en de bevolking gezien de erkenning van intersexual, ontwikkelingsstoornissen en geografische variabiliteit in sommige vergiften 25, 26. Spinnen kunnen vertonen ook aanzienlijke variatie in de hoeveelheid gif geproduceerd tussen individuen, waarbij kleinere hoeveelheden de recente uitputting van de klier kunnen weerspiegelen. Zo kan het raadzaam zijn om gif meerdere dagen te verzamelen na hun laatste voeding zijn. Bij geringer gif vrijkomt, dienen overmatig stroom niet toegepast op de spin, die kan de cuticula scheuren, waardoor verontreiniging van het gif met hemolymfe of dood. Besmetting van gif monsters met spin silk of menselijke bronnen moet ook worden vermeden door gebruik van steriele of schoon materiaal. Ondanks deze uitdagingen, de verzameling van pure gif, het verlaten van de spin leeft, is te verkiezen boven methoden die gif te verkrijgen van klier homogenates (die geen gif componenten hoeft te scheiden van andere cellulaire eiwitten) en doodt de spin. Het is ook essentieel dat de steekproeven snel bevroren om eiwitafbraak te voorkomen. De winning van gif bevordert latere gif productie, waardoor gif genexpressie stimuleren in het gif klier. Aldus omdat protocol maakt spinnen gif uitputting overleven, de klieren worden ontleed enkele dagen later (doden van de spin) op een plaats waar gif genexpressie wordt verwacht voldoende genetische studies, zoals transcript klonen 10,11 zijn. Een aantal belangrijke voorzorgsmaatregelen moeten ook worden genomen in gifklier dissecties. De nadruk moet op het gebruik van lab equipm worden geplaatstent en reagentia die vrij zijn van RNases dat RNA afbreken zijn. Zo is het raadzaam om te vegen pincet en andere herbruikbare apparatuur en oppervlakken met oplossingen die RNase en DNA verontreiniging te elimineren. Dissecties moet zo snel mogelijk en direct bevroren worden uitgevoerd om verder te zorgen RNA integriteit van het weefsel. Tenslotte moet ontledingen alleen worden uitgevoerd op verdoofd spinnen, na cephalothorax en buik snel gescheiden. Tot slot, dit artikel geeft een geverifieerd protocol om spin gif en gifklieren verkrijgen. Venom en gifklieren zorgen voor de isolatie en karakterisering van hun eiwitten en peptiden onderdelen met behulp van proteomics en transcriptomische benaderingen. Bovendien kan gif monsters het uitgangspunt van functionele assays, die de biomedische en farmacologische potentie van de samenstellende moleculen te bepalen vertegenwoordigen. Bijna alle spinnen produceren gif, en de brede duikersiteit van gif componenten gesynthetiseerd door individuele soorten suggereert een enorme verscheidenheid aan gif moleculen worden nog ontdekt worden 13. Derhalve is dit protocol geeft een aantal instrumenten om de rijke bron van biologisch actieve moleculen in spin gif onderzoeken.

Vergiften zijn dierlijke afscheidingen overwegend geïnjecteerd in een ander dier voor de doeleinden van predatie of de verdediging, en hebben ook belangrijke biologische toepassingen met biomedische relevantie 1-3. Alleen bepaalde dieren synthetiseren gif, maar de productie taxonomisch wijdverspreid over ongewervelde (bijv cnidarians, kegel slakken, schorpioenen en spinnen) en vertebraten (bijvoorbeeld slangen, sommige vissen en zoogdieren), omdat het onafhankelijk is geëvolueerd meerdere keren 1,4 . Biochemische karakterisatie van vergiften tonen bijvoorbeeld zij bestaan ​​uit een groot aantal eiwitten en peptiden, die grotendeels werken op de bloedsomloop en het zenuwstelsel van geïnjecteerde dieren snel leveren bestanddeel toxines 1. Een klein deel van de giftige dieren kunnen een bedreiging voor de mens, met name soorten met synantrope distributies 5 vormen. De studie gif samenstelling en functionele activiteiten heeft een belangrijke rol gespeeldde functionele karakterisatie van gewervelde cellulaire componenten (met name neuronale ionenkanalen) 6 en ophelderen fundamentele cellulaire processen (bijv neurosecretie) 7. Bovendien selecteert gif peptiden hebben nuttige eigenschappen in biomedische contexten, met inbegrip van hun toepassingen als behandelingen voor kanker en pijn 8,9, en worden ontgonnen met kandidaat-medicijn leads en antivenom ontwikkeling. Venoms ook een prominente rol spelen in de ecologische en evolutionaire onderzoek 1,4,10,11, waardoor de verzameling van deze gevaarlijke afscheiding heeft vele nutsbedrijven. Er zijn&gt; 40.000 beschreven soorten spinnen (Orde Araneae), en alle, maar een van de meer dan 100 spin families bezitten gepaarde gifklieren die eindigen in giftanden 12. De hoge diversiteit aan spinnen soorten suggereert dat zij vertegenwoordigen de grootste clade van giftige organismen. Echter, biochemische karakterisering van spin gif heeft largely geconcentreerd op een klein aantal soorten het vaakst geassocieerd met menselijke envenomation. Recente proteoom en transcriptoom studies van spin gif geven ze vele unieke eiwitten en peptiden 2,13,14 bevatten doorgaans. Advances in high-throughput cDNA sequentie en massaspectrometrie peptide fingerprinting sterk vergemakkelijkt de ontdekking van deze gif eiwitten 15. Toch begint deze werkzaamheden met het verzamelen van voldoende gif en / of de gifklieren van de spinnen, en gedetailleerde documentatie voor dergelijke technieken zijn weinig 16. In deze paper wordt een protocol voor het verzamelen van gif en gifklieren van zwarte weduwe spinnen, die kan worden toegepast op vergelijkbare grootte spinnen. De collectie gif afzonderlijk van de klieren kunnen identificatie van eiwitten die worden uitgescheiden in het gif in tegenstelling tot eiwitten uitvoeren van andere cellulaire functies. Zwarte weduwen en andere Latrodectus soorten worden algemeen erkend als een van de meest gevaarlijke spinnen vanwege hun zeer neurotoxisch gif, wat ernstige pijn veroorzaakt bij mensen, die soms gepaard gaat met overmatig zweten, spiersamentrekkingen, hoge bloeddruk, ademhalingsproblemen en fragmentarisch verlamming 5. Het gif collectie protocol hier gepresenteerde maakt gebruik van elektro-stimulatie van elektrische stroom te leveren aan verdoofd spiders om spiersamentrekkingen en het vrijkomen van gif ontlokken. Venom druppels worden snel verzameld met micro-capillairen en loopt vervolgens in buizen voor vriezer bewaren. Omdat het protocol betreft gevaarlijke procedures, mag het alleen worden uitgevoerd door goed opgeleide personen en voorzichtigheid wordt aangedrongen op belangrijke stappen. De verzamelde gif heeft talrijke toepassingen, zoals de karakterisering en isolatie van samenstellende moleculen 2 om fysiologische experimenten of functionele testen 18 en gif genexpressie 11 stimuleren. Het protocol wordt afgesloten met een description van gifklier dissectie en behoud bruikbaar voor het kloneren van gif-specifieke genen, waarvan de expressie is aangetoond dat het plaatsvindt 2-3 dagen na gif depletie in verschillende spinnen 10,11.

<table><tbody><tr><td>Nerve and muscle stimulator (elektro-stimulator)&nbsp;</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td></tr><tr><td>Voltmeter</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>elke generieke voltmeter/multimeter kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Pointed Featherweight Forceps</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Beschikbaar bij Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&#189; in Precision Glide hypodermische naald</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filterkolf 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>kleinere kolven kunnen ook werken</td></tr><tr><td>Buchner Twee-delige trechter, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &#956;l capillaire boringen (Micro capillaire)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Montagekit strip&nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>Beschikbaar bij Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand algemene doeleinden extra-lange pincet Lengte: 11-13/16 in.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer, 20x (pH 7,0), Moleculair Grad</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>kan worden gemaakt van stockchemicaliën (150 mM NaCl, 15 mM natriumcitraat)</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock buizen 0,5 ml buizen (cryogeen veilig)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Vloeibare stikstof tafelkolf</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine Pincet (dissectie pincet)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>vergelijkbare hoogwaardige pincet met fijne punt kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Voetschakelaar/pedaal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Tweevoudige verlengklem, met vinyl beklede hulzen, 8,5 inch</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>vergelijkbare modellen kunnen worden vervangen</td></tr><tr><td>Klemhouder</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>vergelijkbare modellen kunnen worden vervangen, moet de diameter van de verlengde klemraad kunnen accommoderen</td></tr><tr><td>Magnetische basis (houdt de verlengde klem via de klemvanger)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>vergelijkbare apparatuur die de verlengde klem veilig in een vaste positie kan houden, mag worden vervangen</td></tr><tr><td>Kunststof verzamelbuisjes (groot/40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Katoen naaigaren</td><td>Joann fabric and craft store</td><td>7245855</td><td>vergelijkbaar product kan worden vervangen</td></tr></tbody></table>

extractie van venom en venom gland microdissections van spinnen voor proteoom en transcriptoom analyses

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Vergiften chemisch complex afscheiding kenmerkend omvattende verschillende proteïnen en peptiden met verschillende fysiologische activiteiten. Functionele karakterisering van gif eiwitten heeft belangrijke biomedische toepassingen, met inbegrip van de identificatie van de drug leads of probes voor cellulaire receptoren. Spinnen zijn de meest soortenrijke clade van giftige organismen, maar het gif van slechts een paar soorten zijn goed begrepen, voor een deel te wijten aan de moeilijkheid in verband met het verzamelen van kleine hoeveelheden gif van kleine dieren. In deze paper wordt een protocol voor het verzamelen van gif van spinnen met behulp van elektrische stimulatie, waaruit de gevolgde procedure aan de westelijke zwarte weduwe (Latrodectus hesperus). De verzamelde gif is nuttig voor gevarieerde downstream analyses met inbegrip van directe identificatie eiwit via massaspectrometrie, functionele testen, en het stimuleren van gif genexpressie voor transcriptomische studies. Deze techniek heeft het voordeel boven protocollen isolaat gif uit totaal klier homogenaten die niet echt gif componenten van cellulaire eiwitten die niet worden uitgescheiden als deel van het gif doen scheiden. Representatieve resultaten tonen de detectie van bekende gif peptiden uit het verzamelde monster met massaspectrometrie. Het gif verzamelprocedure gevolgd door een protocol voor het ontleden spin gifklieren met resultaten tonen dat dit leidt tot de karakterisering van gif expressie gebrachte eiwitten en peptiden op het sequentieniveau.

De collectie van gif en gif klier dissecties worden vaak uitgevoerd om gif eiwitten en peptiden karakteriseren op de volgorde niveau 10,11,15. Verzameld gif kan ook worden gebruikt in assays fysiologische hun functionele activiteiten 18 bepalen. De collectie gif zal gifklier genexpressie stimuleren, waardoor de klonering van specifieke toxine transcripten via RT-PCR 10,11 vergemakkelijken. Identificatie van gif eiwitten kunnen ook in een high-throughput wijze worden bereikt door integratie standaard massaspectrometrie technieken sequentie databases gegenereerd gifklier cDNA-bibliotheken 15,21. Een voorbeeld van deze werkzaamheden, uitgaande van gif en klieren verzameld via het protocol hierboven beschreven, tonen de effectiviteit, is in figuur 1. Venom verzameld van L. hesperus volwassen vrouwtjes werd gedigereerd met trypsine en onderworpen aan een in oplossingMuDPIT analyse, die HPLC (hogedrukvloeistofchromatografie) verbindt met tandem massaspectrometrie (MS / MS). Hier werd de MuDPIT analyse uitgevoerd door de Universiteit van Arizona Proteomics Consortium. Massa&#39;s gedetecteerd peptiden en hun gedistantieerd fragmenten (dochter ionen, afgeleid uit spectra) werden vergeleken met peptidensequenties theoretisch voorspeld uit vertalingen van cDNA sequenties verkregen van een genexpressie bibliotheek opgebouwd uit L. hesperus gifklieren (klieren werden verworven door de dissectie protocol hierboven beschreven) 21. In dit experiment werden 36 eiwitten gedetecteerd alle spectra verzameld bij 99,9% waarschijnlijkheid drempel, en die ten minste één peptide gedetecteerd. Eén van de gedetecteerde eiwitten wordt ondersteund door 43 totale spectra (voorbeeld spectra getoond in Figuur 1A), overeenkomend met drie exclusieve peptiden, die 35% van de eiwitsequentie (Figuur 1B). De gedetecteerde eiwit (vertaald uit een collecte<html> d cDNA) heeft een top BLASTP hit te latrodectin van L. tredecimguttatus (GenBank P49125.1), een e-score van 2e-46, en deelt 80% identiteit op het aminozuursequentie niveau de waargenomen in dit experiment eiwit. Latrodectin, ook bekend als alfa-Alfa-latrotoxine laag molecuulgewicht eiwit is een erkende giftcomponent zwarte weduwespinnen 22, 23, controle van de doeltreffendheid van de gepresenteerde protocol. Sommige eiwitten geïdentificeerd uit het gif overeenkomen met sequenties waarvoor geen BLAST hit wordt gevonden. Het is onduidelijk of dergelijke is het gevolg van de beperkte genomische middelen voor spinnen en de beperkte functionele informatie voor hun proteïnen, of omdat het onbekende eiwit is een gif contaminant. Niettemin gen of proteïne-expressie-analysen onderzoeken de overvloed van dergelijke nieuwe eiwit in gifklieren opzichte van andere weefsels moet blijken of het een echt giftcomponent. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figuur 1: Latrodectin peptide geïdentificeerd van zwarte weduwe gif met behulp van massaspectrometrie (A) Vertegenwoordiger spectra (één van 43) gedetecteerd via MS / MS gedeelte van MuDPIT analyse van L.. hesperus gif dat werd toegewezen voorspeld vertaling van een collectie cDNA sequentie getoond in deel B Spectra toont massa-verhouding (m / z) van gedetecteerde dochter ionen heffen op de horizontale as door fragmenteren ouderpeptide (CGEEDFGEEIVK), met letters boven waarin de peptidesequentie op basis dochter ion massa. (B) Eiwit sequentie waarmee spectra in deel A werd toegewezen, waarin met rode, vetgedrukte en onderstreepte tekst de overeenkomstige sequentie van de in deel A spectra extra rode tekst (niet vet) vertegenwoordigt een peptide in dit eiwit gedetecteerd met andere verzamelde spECTRA. De eiwitsequentie is vertaald uit een cDNA sequentie verkregen uit ontleed gifklieren.

Dit artikel geeft een protocol voor de winning van gif van spinnen met behulp van elektrische stimulatie om 1) uitvoeren van proteomics karakterisering, 2) het stimuleren van gifklier genexpressie, en 3) uitvoeren van functionele studies van vergiften. Daarna volgt een omschrijving van gifklier microdissections genexpressie studies.

Extractie van Venom en Venom Gland Microdissections van Spinnen voor proteoom en transcriptoom Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van gif en het dissekeren van gifklieren van spinnen voor transcriptomische en proteomische studies; dit wordt bereikt door eerst de apparatuur en reagentia voor te bereiden die nodig zijn om gif te verzamelen via elektrische stimulatie. De tweede stap is het immobiliseren en anesthetiseren van een spin met een pincet onder een dissectiemicroscoop. Vervolgens krijgt de spin elektrische pulsen toegediend en wordt het vrijgekomen gif opgevangen met een microcapillaire buis.De laatste stap is om twee tot drie dagen later de gifklieren van de spin te dissekeren. Uiteindelijk wordt massaspectrometrie of andere proteomische analyses van het gif gebruikt om de sequenties van de bestanddelen van de gifproteïnen aan te tonen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor het verzamelen van het gif moeilijk aan te leren zijn omdat ze een reeks gecoördineerde handelingen vereisen die snel, maar zorgvuldig moeten worden uitgevoerd.Sluit ten eerste de voedingskabel van een elektrostimulator aan op een stopcontact en verbind het externe voetpedaal met een externe signaalingang. Controleer vervolgens of de polariteitsschakelaar in de normale stand staat en verbind de positieve elektrode met de rode uitgangsterminal van de elektrostimulator en de negatieve elektrode met de zwarte uitgangsterminal. Stel de stimulator vervolgens in volgens de volgende aanbevolen begininstellingen.Test de output van de elektrode door krokodillenklemmen aan de positieve en negatieve meetkabels van de voltmeter te bevestigen. Zet vervolgens de aan-uitknop van de stimulator aan en dien stroom toe met het voetpedaal. Bereid de featherweight-pincet voor door één poot te voorzien van een laag vloeibaar plastic en wacht vier uur tot de coating is gedroogd. Nadat het plastic is gedroogd, wikkel je 15 millimeter van de tip van de tegenoverliggende AP-poot strak in met een enkele laag katoenen naaigaren en zet je de draad vast door het uiteinde in een knoop te leggen.Knip vervolgens met een scherpe schaar de punt van een stompe hypodermische naald af, klein genoeg om de spin niet te beschadigen, maar groot genoeg om verstopping te voorkomen. Maak de opening glad met schuurpapier en bevestig de naald aan een vacuüm afvalvanger. Positioneer daarna de vederlichte pincet horizontaal in een strak gesloten positie met behulp van een vinyl-gecoate tweetandige klem die is bevestigd aan een magnetische voet onder het gezichtsveld van een dissectiemicroscoop, met de plastic-gecoate tand bovenop en de draad-gecoate tand onderaan.Bevestig vervolgens een krokodillenclip van de positieve elektrode aan de onderste pen stroomopwaarts van de draad, en bevestig een negatieve krokodillenclip aan de stompe metalen vacuümnald. Plaats daarna de positieve leiding op de pen van de pincet tussen de draad en de krokodillenclip en de negatieve leiding op de stompe vacuümnald. Om de stroom van het voltmetercircuit te testen, wordt het voetpedaal ingedrukt om te controleren of er een voldoende stroom wordt gedetecteerd; verwijder vervolgens de leidingen terwijl u een beschermbril draagt.Bereid enkele microcapillaire buisjes voor voor de verzameling van gif. Plaats vervolgens een strip montageklei in een Petrischaal en rust de microcapillairen op de strip. Houd met een handschoen aan één uiteinde een enkel microcapillair buisje vast en houd het andere uiteinde met steriele metalen pincetten boven de vlam van een bunsenbrander; trek het uiteinde weg van de vlam om een verlengde punt te creëren terwijl het andere uiteinde in een stationaire positie wordt gehouden. Onderzoek de uiteinden van de microcapillairen onder een dissectiemicroscoop en maak met gesteriliseerde metalen pincetten een kleine schuine opening aan het uitgetrokken uiteinde.Sluit de buisjes en plaats ze op ijs. Om te beginnen met de immobilisatie van de spin, zet u het gas van de CO2-kamer aan. Verplaats vervolgens de spin met een lange metalen pincet vanuit het gesloten plastic opvangbuisje naar de CO2-kamer.Houd de spin vijf tot 10 minuten in de kamer en controleer of de spin niet meer beweegt door deze voorzichtig aan te raken met een lange pincet. Gebruik vervolgens een transferpipet met zoutoplossing om het uiteinde van de pincet te bevochtigen.Haal vervolgens de geanestheseerde spin uit de CO2-kamer door deze bij de voorpoten op te pakken. Verplaats de geanestheseerde spin met stompe dissectiepincetten en handschoenen naar het apparaat met de veer-pincetten. Spreid vervolgens de tanden van de gesloten veer-pincetten en plaats het cephalothorax van de spin tussen de tanden.Laat de klemmen sluiten om ervoor te zorgen dat de spin stevig op zijn plaats wordt gehouden zonder te worden geplet. Zorg er snel voor dat de spin zo wordt geplaatst dat de dorsale zijde van het carapace naar beneden is en rust op de met draad beklede klem, terwijl de ventrale zijde van het carapace naar de plastic coating is gericht en de positieve elektrode aan de onderste klem bevestigd blijft. Pas vervolgens de vergroting, focus en lichtbron van de dissectiemicroscoop aan totdat de chelicerae en hoektanden van de spin duidelijk zichtbaar zijn. Om te beginnen met het verzamelen van gif, schakel dan de vacuümpomp in en bespuit de chelicerae van de spin met water.Gebruik een tweede stompe naaldspuit om het water met een vacuümspuit weg te zuigen om onzuiverheden te verwijderen. Raak vervolgens met de negatieve elektrode van de vacuümspuit het rostrum van de spin aan en lever een puls via het voetpedaal. De poten van de spin zullen samentrekken en het gif zal zichtbaar worden als heldere druppels die uit de hoektanden komen.Zuig indien nodig geregutteerd materiaal weg. Verzamel vervolgens gifdruppels met de microcapillaire tip en breng de capillaire tip over in een buisje van 0,5 milliliter met water, dat in de capillair zal worden opgezogen. Vermijd het doorprikken van de spin met de capillair en besmetting van de capillair met zijde en lijm van de spinten.Bevestig vervolgens de transferspuit met buisadapter aan de microcapillair aan het uiteinde tegenover de verzameltip, doseer de gifoplossing terug in de buis en plaats de buis op ijs; bewaar buizen met gif bij min 80 graden Celsius. Wanneer de gifverzameling is voltooid, plaatst u een open plastic verzamelbuisje met bijbehorende dop dicht bij de spin. Voor een snelle overdracht grijpt u de poten van de spin voorzichtig vast met stompe dissectiepenset in één hand en opent u voorzichtig een vederlichte pincet met de andere hand.Schuif de spin vervolgens met stompe pincetten in het opvangbuisje. Sluit de dop snel. Twee tot drie dagen na de gifwinning wordt de spin geanestheseerd in een CO2-kamer; vul daarna een vloeibare stikstofhouder en plaats deze naast een dissectiemicroscoop. Reinig het dissectiegebied en de pincetten met RNA away.Vul vervolgens een kleine petrischaal met een 1x zoutoplossing van natriumcitraat en plaats deze onder de dissectiemicroscoop. Verplaats daarna de spin vanuit de CO2-kamer naar de petrischaal en gebruik een pincet om het cephalothorax snel van het abdomen te scheiden. Houd vervolgens de cephalothorax met een pincet onder de dissectiemicroscoop en positioneer het colliery in het gezichtsveld.Gebruik de scherpe uiteinden van een tweede pincet om de cuticula die de carabase verbindt met de laterale aspecten van de colliery zijdelings door te snijden. Pak de colliery vast met het tweede pincet en trek voorzichtig heen en weer tot de gifklieren eruit zijn getrokken. Dit mag niet langer dan 15 minuten duren.Scheid de klieren van het lichaam en breng ze over naar een cryovaste buis van 0,5 milliliter. Plaats de gesloten buis in vloeibare stikstof. Door massaspectrometrie-technieken te integreren met sequentiedatabases gegenereerd uit cDNA-bibliotheken van gifklieren, konden gifeiwitten worden geïdentificeerd. Laro inept peptide was een van de 36 eiwitten die met massaspectrometrie in het gif van de zwarte weduwe zijn geïdentificeerd.Vergeet niet dat het werken met spinnen zoals zwarte weduwen extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van beschermende handschoenen, altijd genomen moeten worden tijdens het uitvoeren van deze procedure.

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een efficiënte strategie om de zijde-producerende klieren te verwijderen uit de buik van de vrouwelijke zwarte weduwe spinnen. Deze procedure maakt het mogelijk een snelle isolatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren in een sterk gezuiverd, mode, een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen spinnenzijde productie en assemblage vezels.

Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren

Een protocol voor de kwantitatieve, high throughput screening expressie en analytische zuivering van fusie-eiwitten uit kleinschalige Escherichia coli culturen wordt beschreven en toegepast om de expressie van disulfide-rijke dierlijke gif eiwit targets.

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in<em&gt; E. coli</em

Hoewel veel insecten in de onderorde Wantsen (Insecta: Hemiptera) zijn giftig, de samenstelling van hun gif en de functies van hun vergift toxinen zijn meestal onbekend. Dit protocol wordt beschreven methoden om te heteropteran boosdoeners voor verdere karakterisering, met behulp van elektrostimulatie, intimidatie en klier dissectie van de oogst.

Oogsten van Venom toxines uit Assassin insecten en andere Heteropteran insecten

Hier beschrijven we een protocol om ruw gifextract uit zeeanemoon te verkrijgen en de hemolytische en fosfolipase-activiteit ervan te detecteren.

Identificatie van hemolytische en fosfolipase-activiteit in ruwe extracten van zeeanemonen door Eenvoudige Bioassays

Hier presenteren we succesvolle onderhouds- en gifextractieprotocollen voor grootschalige Tityus serrulatus Lutz en Mello, 1922 (Braziliaanse gele schorpioen) veehouderij, met als doel gif te leveren voor de daaropvolgende productie van schorpioenantigif om aan de vraag van het Braziliaanse gezondheidssysteem te voldoen.

Onderhoud in gevangenschap en gifextractie van Tityus serrulatus (Braziliaanse gele schorpioen) voor de productie van antigif

Hier presenteren we een protocol voor het extraheren van gif uit Trichogramma dendrolimi met behulp van een kunstmatige gastheer gemaakt met polyethyleenfilm en aminozuuroplossing.

Gif extraheren uit de sluipwesp Trichogramma dendrolimi met behulp van een kunstmatige gastheer

In deze video tonen we een methode voor de elektroforetische scheiding van eiwitten met behulp van poly-acrylimide gelelektroforese (PAGE).

Elektroforetische scheiding van eiwitten

Digitale Microfluidics is een techniek die gekenmerkt wordt door de manipulatie van discrete druppels (~ nL - ml) op een reeks van elektroden door de toepassing van elektrische velden. Het is goed geschikt voor het uitvoeren van een snelle, sequentiële, geminiaturiseerde geautomatiseerde biochemische assays. Hier melden wij een platform in staat is het automatiseren van een aantal proteoomanalyse processtappen.

Digitale Microfluidics voor Geautomatiseerde Proteoom verwerking

Eiwitextractie voor proteomische analyses in schimmelsoorten vereist een hoge mate van standaardisatie te worden bereikt op basis van de minimale informatie over een proteomics experiment (MIAPE) richtlijnen. We presenteren een video-protocol, dat een procedure voor het minimaliseren van experimentele vooringenomenheid tijdens toxine inductie en eiwit-extractie uit...

Toxine Inductie en eiwitextractie uit Fusarium Spp. Cultures for Proteoom Studies

Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

Leer gifextractie en klierdissectie bij spinnen voor transcriptoom- en proteoomanalyses met elektrische stimulatie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar gifcompositie en genexpressie.

Extractie van Venom en Venom Gland Microdissections van Spinnen voor proteoom en transcriptoom Analyses

Meer video's verkennen