Extractie van Venom en Venom Gland Microdissections van Spinnen voor proteoom en transcriptoom Analyses

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van gif en het dissekeren van gifklieren van spinnen voor transcriptomische en proteomische studies; dit wordt bereikt door eerst de apparatuur en reagentia voor te bereiden die nodig zijn om gif te verzamelen via elektrische stimulatie. De tweede stap is het immobiliseren en anesthetiseren van een spin met een pincet onder een dissectiemicroscoop. Vervolgens krijgt de spin elektrische pulsen toegediend en wordt het vrijgekomen gif opgevangen met een microcapillaire buis.

De laatste stap is om twee tot drie dagen later de gifklieren van de spin te dissekeren. Uiteindelijk wordt massaspectrometrie of andere proteomische analyses van het gif gebruikt om de sequenties van de bestanddelen van de gifproteïnen aan te tonen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor het verzamelen van het gif moeilijk aan te leren zijn omdat ze een reeks gecoördineerde handelingen vereisen die snel, maar zorgvuldig moeten worden uitgevoerd.

Sluit ten eerste de voedingskabel van een elektrostimulator aan op een stopcontact en verbind het externe voetpedaal met een externe signaalingang. Controleer vervolgens of de polariteitsschakelaar in de normale stand staat en verbind de positieve elektrode met de rode uitgangsterminal van de elektrostimulator en de negatieve elektrode met de zwarte uitgangsterminal. Stel de stimulator vervolgens in volgens de volgende aanbevolen begininstellingen.

Test de output van de elektrode door krokodillenklemmen aan de positieve en negatieve meetkabels van de voltmeter te bevestigen. Zet vervolgens de aan-uitknop van de stimulator aan en dien stroom toe met het voetpedaal. Bereid de featherweight-pincet voor door één poot te voorzien van een laag vloeibaar plastic en wacht vier uur tot de coating is gedroogd. Nadat het plastic is gedroogd, wikkel je 15 millimeter van de tip van de tegenoverliggende AP-poot strak in met een enkele laag katoenen naaigaren en zet je de draad vast door het uiteinde in een knoop te leggen.

Knip vervolgens met een scherpe schaar de punt van een stompe hypodermische naald af, klein genoeg om de spin niet te beschadigen, maar groot genoeg om verstopping te voorkomen. Maak de opening glad met schuurpapier en bevestig de naald aan een vacuüm afvalvanger. Positioneer daarna de vederlichte pincet horizontaal in een strak gesloten positie met behulp van een vinyl-gecoate tweetandige klem die is bevestigd aan een magnetische voet onder het gezichtsveld van een dissectiemicroscoop, met de plastic-gecoate tand bovenop en de draad-gecoate tand onderaan.

Bevestig vervolgens een krokodillenclip van de positieve elektrode aan de onderste pen stroomopwaarts van de draad, en bevestig een negatieve krokodillenclip aan de stompe metalen vacuümnald. Plaats daarna de positieve leiding op de pen van de pincet tussen de draad en de krokodillenclip en de negatieve leiding op de stompe vacuümnald. Om de stroom van het voltmetercircuit te testen, wordt het voetpedaal ingedrukt om te controleren of er een voldoende stroom wordt gedetecteerd; verwijder vervolgens de leidingen terwijl u een beschermbril draagt.

Bereid enkele microcapillaire buisjes voor voor de verzameling van gif. Plaats vervolgens een strip montageklei in een Petrischaal en rust de microcapillairen op de strip. Houd met een handschoen aan één uiteinde een enkel microcapillair buisje vast en houd het andere uiteinde met steriele metalen pincetten boven de vlam van een bunsenbrander; trek het uiteinde weg van de vlam om een verlengde punt te creëren terwijl het andere uiteinde in een stationaire positie wordt gehouden. Onderzoek de uiteinden van de microcapillairen onder een dissectiemicroscoop en maak met gesteriliseerde metalen pincetten een kleine schuine opening aan het uitgetrokken uiteinde.

Sluit de buisjes en plaats ze op ijs. Om te beginnen met de immobilisatie van de spin, zet u het gas van de CO2-kamer aan. Verplaats vervolgens de spin met een lange metalen pincet vanuit het gesloten plastic opvangbuisje naar de CO2-kamer.

Houd de spin vijf tot 10 minuten in de kamer en controleer of de spin niet meer beweegt door deze voorzichtig aan te raken met een lange pincet. Gebruik vervolgens een transferpipet met zoutoplossing om het uiteinde van de pincet te bevochtigen.

Haal vervolgens de geanestheseerde spin uit de CO2-kamer door deze bij de voorpoten op te pakken. Verplaats de geanestheseerde spin met stompe dissectiepincetten en handschoenen naar het apparaat met de veer-pincetten. Spreid vervolgens de tanden van de gesloten veer-pincetten en plaats het cephalothorax van de spin tussen de tanden.

Laat de klemmen sluiten om ervoor te zorgen dat de spin stevig op zijn plaats wordt gehouden zonder te worden geplet. Zorg er snel voor dat de spin zo wordt geplaatst dat de dorsale zijde van het carapace naar beneden is en rust op de met draad beklede klem, terwijl de ventrale zijde van het carapace naar de plastic coating is gericht en de positieve elektrode aan de onderste klem bevestigd blijft. Pas vervolgens de vergroting, focus en lichtbron van de dissectiemicroscoop aan totdat de chelicerae en hoektanden van de spin duidelijk zichtbaar zijn. Om te beginnen met het verzamelen van gif, schakel dan de vacuümpomp in en bespuit de chelicerae van de spin met water.

Gebruik een tweede stompe naaldspuit om het water met een vacuümspuit weg te zuigen om onzuiverheden te verwijderen. Raak vervolgens met de negatieve elektrode van de vacuümspuit het rostrum van de spin aan en lever een puls via het voetpedaal. De poten van de spin zullen samentrekken en het gif zal zichtbaar worden als heldere druppels die uit de hoektanden komen.

Zuig indien nodig geregutteerd materiaal weg. Verzamel vervolgens gifdruppels met de microcapillaire tip en breng de capillaire tip over in een buisje van 0,5 milliliter met water, dat in de capillair zal worden opgezogen. Vermijd het doorprikken van de spin met de capillair en besmetting van de capillair met zijde en lijm van de spinten.

Bevestig vervolgens de transferspuit met buisadapter aan de microcapillair aan het uiteinde tegenover de verzameltip, doseer de gifoplossing terug in de buis en plaats de buis op ijs; bewaar buizen met gif bij min 80 graden Celsius. Wanneer de gifverzameling is voltooid, plaatst u een open plastic verzamelbuisje met bijbehorende dop dicht bij de spin. Voor een snelle overdracht grijpt u de poten van de spin voorzichtig vast met stompe dissectiepenset in één hand en opent u voorzichtig een vederlichte pincet met de andere hand.

Schuif de spin vervolgens met stompe pincetten in het opvangbuisje. Sluit de dop snel. Twee tot drie dagen na de gifwinning wordt de spin geanestheseerd in een CO2-kamer; vul daarna een vloeibare stikstofhouder en plaats deze naast een dissectiemicroscoop. Reinig het dissectiegebied en de pincetten met RNA away.

Vul vervolgens een kleine petrischaal met een 1x zoutoplossing van natriumcitraat en plaats deze onder de dissectiemicroscoop. Verplaats daarna de spin vanuit de CO2-kamer naar de petrischaal en gebruik een pincet om het cephalothorax snel van het abdomen te scheiden. Houd vervolgens de cephalothorax met een pincet onder de dissectiemicroscoop en positioneer het colliery in het gezichtsveld.

Gebruik de scherpe uiteinden van een tweede pincet om de cuticula die de carabase verbindt met de laterale aspecten van de colliery zijdelings door te snijden. Pak de colliery vast met het tweede pincet en trek voorzichtig heen en weer tot de gifklieren eruit zijn getrokken. Dit mag niet langer dan 15 minuten duren.

Scheid de klieren van het lichaam en breng ze over naar een cryovaste buis van 0,5 milliliter. Plaats de gesloten buis in vloeibare stikstof. Door massaspectrometrie-technieken te integreren met sequentiedatabases gegenereerd uit cDNA-bibliotheken van gifklieren, konden gifeiwitten worden geïdentificeerd. Laro inept peptide was een van de 36 eiwitten die met massaspectrometrie in het gif van de zwarte weduwe zijn geïdentificeerd.

Vergeet niet dat het werken met spinnen zoals zwarte weduwen extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van beschermende handschoenen, altijd genomen moeten worden tijdens het uitvoeren van deze procedure.