Name: Isolatie van Neonatale Extrahepatisch cholangiocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Leer de isolatie van neonatale extrahepatische cholangiocyten uit muizen voor onderzoek naar galwegbiologie. Deze methode met collageenkweek levert zuivere celmonolagen voor studies naar leverontwikkeling en -pathologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dankbaar voor de Moleculaire Pathologie en Imaging Core van de UPenn NIDDK Center for Molecular Studies in Digestive en Leverziekten (P30 DK50306) voor hulp bij beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 DK-092111) en uit de Fred en Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (tot RGW) en door een beurs van de Childhood Liver Disease Research and Education Network (SK).

De gehele procedure wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. Alle dierlijke werkzaamheden moeten onder menswaardige omstandigheden onder een protocol door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) zijn goedgekeurd. 1. Voorbereiding van apparatuur en oplossingen <ol><li> Stel de muis operatietafel dicht bij de weefselkweek kap en incubator (figuur 1A). Opmerking: Vereist apparatuur omvat een dissectie microscoop, een lichtbron, 12,5 cm lange rechte iris schaar, 6 inch niet gekartelde gebogen pincet met fijne tips, en 4 inch gekarteld pincet met gebogen tips (Figuur 1B). </li><li> Plaats gesteriliseerde instrumenten in een bekerglas van 70% alcohol op de operatietafel. </li><li> Vul drie steriele 60 mm petrischalen met steriele isolatiemedia (tabel 1); plaats twee op chirurgische tafel en een in kap, alle op het ijs. </li><li> Plaats rattenstaart collageen,steriel 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), steriel water, steriel 1 N NaOH en biliaire epitheelcellen (BEC) media (tabel 1) in de weefselkweek kap. Opmerking: Het collageen moet op ijs. </li></ol> 2. Bile Duct Isolatie en Cultuur <ol><li> Euthanaseren neonatale muizen tussen 0-3 dagen van het leven, door blootstelling aan kooldioxide tot onbewuste gevolgd door cervicale dislocatie, per IACUC richtlijnen (figuur 1C). Let op: oudere muizen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de specifieke experimentele behoeften. </li><li> Plaats dier in rugligging en maak een kleine horizontale incisie oversteken van de middellijn in de regio van het bekken. Verlengen incisie zijdelings en omhoog weerszijden van de buik, die een U-vormige flap. Zet flap tot de buikorganen bloot. Zodra de buik geopend voorzichtig bewegen de ingewanden uit de buikholte naar de rechterkant van het dier voor een betere visualisatie van de lever en galbuis. Opmerking: het kan noodzakelijk zijn om de zijdelingse insnijdingen uitstrekken in de ribbenkast betere identificatie van de lever te verkrijgen. </li><li> Met de microscoop ontleden, wat de gemeenschappelijke galkanaal, lever en darmen. Identificeer de galbuis eerst (figuur 1D), met voorzichtigheid, omdat de structuren zeer delicaat. Met de gekartelde en niet gekartelde tang, zorgvuldig schoon en kies uit het bindweefsel met inbegrip van vet rondom de gal. Gebruik een tang om de buis en de andere schoon te houden. </li><li> Gebruik een soortgelijke techniek om de galblaas reinigen. </li><li> Plaats de gereinigde leidingen en galblaas in de eerste schotel van isolatie media op ijs. Masseer zachtjes de structuren met de niet getande tang, terwijl in de media om verder te verwijderen bindweefsel en verwijder gal uit de galblaas. </li><li> Transfer leidingen en galblaas naar de tweede gerecht van isolatie media. </li><li> Na isolatie van leidingen en gallbladders uit 5 dieren, de overdracht van destukjes op de derde petrischaal, in de kap. Opmerking: Als cellen worden geïsoleerd van meer dan 5 dieren doen batches met verse oplossingen voor elke groep van 5 dieren. </li><li> Bereid dikke collageen gels in de weefselkweek kap: Opmerking: elke maat schotel kan worden gebruikt. Een 60 mm kweekschaal met een eindvolume van 3 ml collageen voor elke groep van 5 pasgeborenen werkt goed. Dit moet vers worden bereid bij de inbedding vers geïsoleerde leidingen. <ol><li> Plaats rattenstaart collageen, 10x steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (10x PBS), steriele dH 2 O en steriel 1 N NaOH op ijs. </li><li> Bereken het volume van dH 2 0, 10x PBS, NaOH en collageen nodig gels met een eindconcentratie van 2 mg / ml collageen in 1x PBS, met een volume van 1 N NaOH gelijk aan 0,023 keer het volume van collageen toegevoegd. Opmerking: Als alternatieve bron van collageen wordt gebruikt, volg dan de instructies van de fabrikant voor neutralisatie en gelvorming. </li><li> Meng dH 2 0, 10x PBS, en 1 N NaOH, voeg dan collageen en pipet goed te zorgen voor een gelijkmatige menging. </li></ol></li><li> Zodra collageenoplossing is ingedikt tot een gel-achtige consistentie bij kamertemperatuur onmiddellijk insluiten de kanalen in het collageen. </li><li> Plaats in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 30 minuten aan het collageen mogelijk te stollen. </li><li> Zodra gel (kleur verandert van helder tot wit), overlay met 3,5 ml van BEC media (tabel 1) is gestold en incubeer bij 37 ° C, CO 5% 2. </li><li> Verwijder BEC media 3 keer per week en te vervangen door 3,5 ml vers medium. </li></ol> 3. Isoleren Primaire cholangiocyten van Dik collageengels Opmerking: binnen 3 weken, zal vellen cholangiocyten (cellen met grote kernen rechtstreeks uitstrekt van ingebedde leidingen) zichtbaar in de dikke collageen. Als er grote aantallen van fibroblasten in de schaal moet worden weggegooid. Als een enkele regio&#39;s van het gerecht hebbenfibroblastgroeifactor, kunnen deze worden uitgesneden met een scalpel en voor het splitsen van de cholangiocyten verwijderd. <ol><li> Bereid dunne collageen gels: <ol><li> Verdun collageen tot een concentratie van 1 mg / ml met steriele PBS. Merk op: 1 ml voor 100 mm plaat; dienovereenkomstig aan te passen voor andere grootte gerechten. </li><li> Spreid het collageen oplossing gelijkmatig met een mobiele spreader (grote borden) of pipet (kleine gerechten), dan laat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Afdekplaat met DMEM/F12 en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de plaat uit incubator en wassen met 1x PBS. Onmiddellijk zuig het 1x PBS. </li><li> Jas met een tweede laagje collageen, verspreiding door het draaien van de plaat of het plaatsen van bord op een shaker. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 10 minuten. </li><li> Nadat collageen gestold, afdekplaat met DMEM/F12 en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 30 minuten. </li></ol></li><li> Splits cellen van thick collageengels: <ol><li> Met celkweek spatel of celschraper, schraap collageen gel voorzichtig van de plaat, zodat het drijft. </li><li> Bereid collagenase oplossing door verdunnen Type XI collagenase (zie materialen) tot 10 mg / ml met DMEM/F12. Meng goed en steriel filter. </li><li> Voeg 1 ml collagenase oplossing (hierboven) per 60 mm schaal cellen in dikke collageen. Raak de BEC media (die moet worden 3 ml) niet verwijderen. Incubeer schotel voor 30 min bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Verwijder oplossing bevattende cellen en plaatsen in 15 ml conische buis. </li><li> Spin down bij 2200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en opnieuw pellet op te schorten in eenzelfde volume DMEM/F12. </li><li> Spin oplossing opnieuw bij 2200 g gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant. </li><li> Resuspendeer pellet in 3 ml 0,5% trypsine en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 5 minuten. Na incubatie pipet de oplossing op en neer te breken van de bladen van cholangiocyten. Voeg 5 ml BEC media eennd rotatie oplossing bij 1500 g gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de supernatant en resuspendeer pellet in DMEM/F12, dan draaien oplossing bij 1500 g gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en opnieuw pellet schorsen BEC media (tabel 1). Plaat cellen op eerder gemaakte dunne collageen gels. </li></ol></li></ol> 4. Passage en opslag van cellen Opmerking: cellen op dunne collageen gels kan worden gesplitst indien nodig. <ol><li> Was platen met steriele PBS vóór incuberen in 0,25% trypsine bij 37 ° C gedurende 10-15 minuten. </li><li> Neutraliseren met een gelijk volume BEC media en pellet bij 1500 xg gedurende 5 minuten. Spoel pellet met DMEM/F12, dan pellet bij 1500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen in BEC media voor distributie aan collageen gecoate celkweekschalen. Opmerking: Als alternatief kunnen cellen worden geresuspendeerd opslagmedium en opgeslagen in een -80 ° C vriezer of vloeibare stikstof (tabel 1). </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen.

Hier beschreven is een techniek om zuivere cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van muizen muizen van elke leeftijd, inclusief pasgeborenen. De techniek biedt het voordeel dat extrahepatische cholangiocyten afzonderlijk kunnen worden bestudeerd vanuit intrahepatische cholangiocyten en kan studies belangrijkste verschillen tussen deze populaties van cellen te identificeren vergemakkelijken. We hebben onlangs een studie gepubliceerd demonstreren afgenomen cilia in extrahepatic cholangiocyten geïsoleerd ...

De oorsprong en de ontwikkeling van intra-en extrahepatische cholangiocyten aanzienlijk verschillen. De lever ontwikkelt uit een divertikel van de ventrale foregut endoderm 5. De caudale regio van de divertikel vormt de extrahepatische galwegen, terwijl de craniale regio genereert de intrahepatische galwegen 5. Intrahepatic kanaal cholangiocyten zijn afgeleid van stamcellen rond de ductale plaat in de peri portal regio 6. Deze cellen hebben het vermogen om te differentiëren in ofwel hepatocyten of cholangiocyten 6. Dit heeft belangrijke klinische implicaties aangezien cholangiopathies specifiek kan richten op een categorie cholangiocyten. Bijvoorbeeld, galgangatresie aanvankelijk van invloed op de extrahepatische leidingen van de pasgeborene, terwijl Alagille syndroom treft intrahepatic kanalen. Zijn er meerdere beschrijvingen van de isolatie van intrahepatische cholangiocyten en galwegen eenheden van muizen en ratten. Investigators hebben enkele cellen geïsoleerd door kanaal isolatie en vervolgens uitgroei, of door de lever spijsvertering en antilichaam pull down van cholangiocyten expressie van specifieke celoppervlaktemerkers 1-4. Functionele en gepolariseerde galwegen units zijn geïsoleerd door de lever spijsvertering en grootte filtratie 7. Galgang eenheden kunnen reageren op stimuli secretoire en demonstreren vloeistofsecretie 7, terwijl geïsoleerd cholangiocyten is aangetoond ductulaire structuren in vitro 1,2. Beperkingen van deze methoden omvatten de behoefte aan gespecialiseerde technische expertise en speciale apparatuur voor leverperfusie met spijsverteringsenzymen. Bovendien is er een risico van besmetting met mesenchymale cellen 3. Werkwijze voor extrahepatische galwegen cholangiocyten isoleren, in het bijzonder van neonatale extrahepatische galwegen, is niet eerder beschreven. Dit document schetst een vereenvoudigde methode om neonatale een isolerens en de meerderjarige extrahepatische galwegen cellen op een hoog niveau van zuiverheid. Deze techniek zal de studie van de verschillen tussen intra-en extrahepatische cholangiocyten en onderzoek naar de mechanismen van ziekten zoals galgangatresie dat de extrahepatische kanalen betrekken vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>MEM met niet-essentiële aminozuren</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>Insulin-transferrine-selenium</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>Chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media en 500 &#956;l in de isolatie</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0.2 ml, gebruikt in BEC media en 500 &#956;l in de isolatie</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0.13 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>MEM-vitamineoplossing</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>Sojaboon trypsine-remmer</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media. Oplosmiddel is PBS, meng tot 5 mg/ml stockconcentratie</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>Runderpituitair extract</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1.1 ml, gebruikt in BEC media</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0.5 ml, gebruikt in BEC media, stock conc 393 &#956;g/ml verdunnen met ethanol</td></tr><tr><td>3 3',5-triiodo-L-thyronine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.5 ml, gebruikt in BEC media, stock conc 3.4 mg/ml verdunnen met ethanol</td></tr><tr><td>Epidermale groeifactor</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0.5 ml, gebruikt in BEC media, 25 &#956;g/ml verdunnen met DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 ml, gebruikt in BEC media, gebruik bij stockconcentratie van 0.411 mg/ml en verdun met DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml, gebruikt in BEC media en 500 &#956;l in de isolatie</td></tr><tr><td>Rattenstaart collageen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>variabel afhankelijk van de collageenconcentratie</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>gebruik bij 10x, steriele, gebruikt om collageen te maken, gebruikte hoeveelheid hangt af van de collageenconcentratie</td></tr><tr><td>dH2O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>steriele, gebruikt om collageen te maken, gebruikte hoeveelheid hangt af van de collageenconcentratie</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Verdun tot 1 N, steriele, gebruikt om collageen te maken, gebruikte hoeveelheid hangt af van de collageenconcentratie</td></tr><tr><td>collageenase type XI van Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td><td>verdun in DMEM en steriele filter voor gebruik</td></tr><tr><td>trypsine-EDTA (1x) 0.25%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, incubeer max 10 min</td></tr><tr><td>trypsine-EDTA (10x) 0.5%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, incubeer max 10 min</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Andere modellen acceptabel</td></tr><tr><td>Lichtbron (fiberoptische verlichter)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Andere modellen acceptabel</td></tr><tr><td>12.5 cm rechte irisschaar</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Andere modellen acceptabel</td></tr><tr><td>6" niet-gekartelde gebogen pincetten met fijne uiteinden</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td>Andere modellen acceptabel</td></tr><tr><td>4" gekartelde roestvrijstalen pincetten met fijne uiteinden</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td>Andere modellen acceptabel</td></tr></tbody></table>

isolatie van neonatale extrahepatisch cholangiocyten

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

De intra-en extrahepatische galwegen van de lever zijn ontwikkelingsgebied onderscheiden, en kan verschillend worden beïnvloed door bepaalde ziekten. De verschillen tussen intra-en extrahepatische cholangiocyten en tussen neonatale en volwassen cellen, zijn niet goed begrepen. Methoden voor de isolatie van cholangiocyten van intrahepatische galwegen zijn goed ingeburgerd 1-4. Isolatie van extrahepatische ductale cellen, vooral van de pasgeborene, nog niet beschreven, hoewel dit van groot nut zou zijn in het begrijpen van de verschillen tussen verschillende populaties cholangiocyte en bestuderen ziekten zoals biliaire atresie die lijken de extrahepatische kanalen richten. Hier beschreven is een geoptimaliseerde techniek om zowel neonatale en volwassen muis extrahepatische galwegen cellen te isoleren. Deze techniek levert een zuivere celpopulatie met minimale verontreiniging van mesenchymale cellen zoals fibroblasten. Deze methodiekd is gebaseerd op de verwijdering van de extrahepatische leidingen en galblaas, gevolgd door zorgvuldige dissectie en schrapen om vet en fibroblast lagen te verwijderen. Structuren zijn ingebed in dikke lagen collageen en gekweekt gedurende ongeveer 3 weken tot uitgroei van cholangiocyten in monolagen, die vervolgens kunnen worden getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat voor experimenteel gebruik mogelijk.

Het gebruik van dit protocol resulteert in de isolatie van een populatie van neonatale muis extrahepatische cholangiocyten met uitstekende zuiverheid, zoals aangetoond door K19 immunofluorescentiekleuring (Figuren 2A en 2B); we vergelijkbare resultaten isoleren van cellen van volwassen muizen te bereiken. We hebben waargenomen dat het duurt 3 weken voor de cellen van vers geïsoleerde galwegen om monolagen op dikke collageen gels te vormen. De cholangiocyten groeien lineair hele dikke collageen, die vell...

Een techniek om cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van neonatale muizen wordt beschreven. De kanalen zijn zorgvuldig ontleed en vervolgens cellen worden geïsoleerd door uitgroei in dikke collageen gels. Deze methode biedt een nuttig instrument voor het bestuderen van extrahepatische galwegen ontwikkeling en pathologie.

Isolatie van Neonatale Extrahepatisch cholangiocyten

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en kweken van extrahepatische cholangiocyten uit neonatale neuronen. Dit wordt bereikt door eerst de abdominale organen chirurgisch bloot te leggen om toegang te krijgen tot de lever en de galgangen. De tweede stap van de procedure is het zorgvuldig verwijderen van het bindweefsel en de vetten rondom de galgangen en de galblaas.De gereinigde galgangen en galblaas worden vervolgens op dikke collageengels geplaatst en gedurende drie weken gekweekt. De cholangiocyten zullen vanuit de gangen migreren en worden gesplitst naar dunne collageengels voor verdere kweek. Uiteindelijk tonen de resultaten via immunofluorescentiemicroscopie monolagen van pure cholangiocyten.Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn met deze techniek vaak moeite vanwege technische problemen met de dissectietechniek, evenals het reinigen van kleine galgangen. Richt voor deze procedure een operatietafel voor muizen in vlakbij de weefselkweekkap en de incubator. Plaats alle gesteriliseerde chirurgische instrumenten in een bekerglas met 70% ethanol.Plaats drie met medium gevulde schaaltjes van 60 millimeter op ijs. Twee schaaltjes zijn nodig op de operatietafel, maar bewaar de overige materialen in de zuurkast. Het collageen moet op ijs staan.Begin met het plaatsen van een geëuthanaseerde pasgeboren muis van nul tot drie dagen oud in rugligging op de dissectieplank. Start met een kleine horizontale incisie langs de middellijn nabij het bekken. Breid de incisie naar beide zijden uit, zodat een U-vormige flap ontstaat, en leg de organen bloot.Verschuif nu voorzichtig de darmen naar de rechterzijde van de buikholte. Om de lever en de galgang te kunnen zien, kunnen de huidincisies worden uitgebreid om de flap indien nodig te vergroten. Identificeer en reinig vervolgens onder de dissectiemicroscoop zorgvuldig de gemeenschappelijke galgang.Verwijder het bindweefsel en het omringende vet. Doe vervolgens hetzelfde. Om de galblaas te reinigen, verwijdert u de galgang en de galblaas en plaatst u deze in een van de daarvoor klaargezette schaaltjes.Masseer de structuren met niet-getande pincetten om meer bindweefsel te verwijderen en gal uit te stoten. Breng vervolgens de schone weefsels over naar de tweede schaal. Herhaal deze procedure totdat er weefsel is verzameld van precies vijf neonaten.Begin met het bereiden van een dikke collageengel. Maak deze altijd eerst vers. Zet alle gesteriliseerde oplossingen klaar op ijs.Bereken de benodigde volumes voor twee milligram collageen per milliliter 1x PBS. Voeg 0,023 delen natriumhydroxide toe aan elk deel collageen. Meng de aliquoten bij kamertemperatuur door te pipetteren.Het is essentieel om de PBS, natriumhydroxide en gedestilleerd water te mengen voordat het collageen wordt toegevoegd. De collageenvoorraad moet de laatste component zijn die aan de gel wordt toegevoegd, en de uiteindelijke oplossing moet worden gepipetteerd. Dit voorkomt dat het collageen gaat klonteren.Zodra de oplossing een gelachtige consistentie begint te krijgen, worden de geïsoleerde weefsels onmiddellijk ingebed, waarna de ingebedde weefsels gedurende 30 minuten in de incubator worden geplaatst om te stollen. Nadat de gel is gestold, wordt deze bedekt met 3,5 milliliters BEC-medium en wordt de incubatie voortgezet. Ververs het BEC-medium drie keer per week. Binnen drie weken zullen er vellen cellen met grote kernen ontstaan die vanuit de ingebedde ducten uitgroeien.Dit zijn de cholangiocyten. Als de kweekschaal een aanzienlijke populatie fibroblasten bevat, moet de schaal worden weggegooid, tenzij deze kunnen worden weggesneden. Bereid nu dunne collageengels met 1 mg collageen per mL PBS; breng 1 mL aan op een 100 mm plaat, verdeel het collageen gelijkmatig en wacht 10 minuten.Dek de plaat na 10 minuten af met zeven milliliter DM EMF 12 en incubeer deze gedurende 10 minuten. Was na de korte incubatie het collageen snel met één keer XPBS. Verwijder alle PBS door aspiratie en voeg vervolgens een tweede laag collageen toe, op dezelfde wijze als bij het opbouwen van de eerste laag.Zodra het gestold is, bedek de plaat met DMF 12 en incubeer deze gedurende 30 minuten. Scheid nu de cellen van de dikke gels. Gebruik eerst een spatel of schraper om het collageen voorzichtig van de plaat los te maken, zodat het gaat drijven.Bereid vervolgens een gefiltreerde collagenase-oplossing en voeg één milliliter toe aan elke 60 millimeter schaal met dik collageen. Plaats de schalen daarna in de incubator. Na een incubatie van 30 minuten wordt de gehele oplossing die de cellen bevat verwijderd en overgebracht naar een 15 milliliter buis.Centrifugeer de buis en verwijder het supernatant door aspiratie. Resuspendeer de pellet in 4,5 milliliters DM F 12 medium en centrifugeer deze opnieuw. Resuspendeer de pellet in drie milliliters 0,5% Trypsin en incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 degrees Celsius, waarbij de cellagen zullen loslaten.Laat de klonters na vijf minuten door een pipet van 5 of 10 milliliter stromen totdat ze uit elkaar vallen. Voeg vervolgens vijf milliliter BEC-medium toe en centrifugeer de cellen. Resuspendeer voor een derde keer.Suspendeer de pellet in DMM F 12-medium als wasstap en pellet de cellen opnieuw. Suspendeer de cellen nu in BEC-medium en zaai ze uit op de voorbereide dunne laag. Collageengels laten de cellen uitgroeien en splits de cellen op collageengels indien nodig.Met behulp van het beschreven protocol werd een populatie neonatale extrahepatische cholangiocyten van muizen met een uitstekende zuiverheid geïsoleerd en gekleurd met K 19 immunofluorescentie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een zuivere populatie neonatale extrahepatische cholangiocyten van muizen kunt isoleren door middel van een combinatie van nauwkeurige ductdissectie en uitgroei op dikke collageengels.

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we de isolatie van CD133 tot expressie lever stamcellen en kanker stamcellen van muizen gehele lever, een proces dat weefsel spijsvertering, cel verrijkingscocktail en flowcytometrie isolatie vereist. Wij omvatten methoden voor geavanceerde single cell isolatie en klonale expansie.

Isolatie van CD133 + lever stamcellen voor klonale expansie

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Lever verwondingen worden begeleid door voorlopercellen cel expansie die een heterogene populatie cellen vertegenwoordigt. Nieuwe indeling van deze cellulaire compartiment zorgt voor de onderscheidende meerdere subsets. De hier beschreven methode laat de flowcytometrieanalyse en hoge zuiverheid isoleren van diverse subsets die kunnen worden gebruikt voor verdere tests.

Isolatie en Verrijking van Liver Progenitor subsets geïdentificeerd door een Novel Surface Marker Combinatie

Dit protocol beschrijft de productie van een muis extrahepatic gal 3-dimensionale organoid kanaalsysteem. Deze biliaire organoids kan worden gehandhaafd in cultuur te bestuderen van cholangiocyte biologie. Biliaire organoids express markers van voorlopercellen zowel biliaire cellen en zijn samengesteld uit gepolariseerde epitheliale cellen.

Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen

Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Voor de observatie van muizennenatale galwegaandoeningen zijn een intact galkanaal en een efficiënte voorbereiding vereist. Daarom werd met succes een nieuwe aanpak ontwikkeld voor het isoleren van het gehele extrahepatische galkanaalsysteem bij muizenne neonaten met behoud van de integriteit van het galkanaal.

Extrahepatische galwegen en galblaasdissectie bij negen dagen oude muisverwijders

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Leer de isolatie van neonatale extrahepatische cholangiocyten uit muizen voor onderzoek naar galwegbiologie. Deze methode met collageenkweek levert zuivere celmonolagen voor studies naar leverontwikkeling en -pathologie.

Isolatie van Neonatale Extrahepatisch cholangiocyten

Meer video's verkennen