Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamiek van protonering en conformationele veranderingen van twee lichtgevoelige membraaneiwitten te onderzoeken met behulp van tijd-opgeloste STEP-scan FTIR-spectroscopie. Dit wordt bereikt door eerst een gehydrateerde eiwitfilm te vormen waarvan de infraroodabsorptie wordt gemeten, ofwel in een attenuated total reflection-configuratie voor bacterioropsine, ofwel in een transmissieconfiguratie voor channelrhodopsine 2. De tweede stap is het exciteren van het monster met een nanoseconde laserflits van een geschikte golflengte om een fotocyclische reactie in het eiwit te initiëren, waarbij tijd-opgeloste veranderingen in de intensiteit van het infraroodlicht dat met het monster interageert, worden gedetecteerd.

Vervolgens wordt het bovenstaande proces herhaald op verschillende posities van de beweegbare spiegel van een interferometer, die het optische weglengteverschil tussen twee gesplitste stralen reguleert, totdat een volledig tijdsopgelost interferogram is geregistreerd. De laatste stap is het transformeren van het tijdsopgeloste interferogram naar tijdsopgeloste IR-verschilabsorptiespectra met behulp van de Fourier-transformatie en de wet van Lambert-Beer. Ten slotte wordt de tijdsontwikkeling van banden, met name in de MI-band en in de regio's van de CO-dubbele binding van carbonzuren, onderzocht om de dynamiek van conformationele en protoneringsveranderingen in het eiwit vast te stellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de meeste bestaande experimentele methoden is dat het voorbijgaande protoneringsveranderingen in eiwitten resolveert. Bovendien gebeurt dit op micro- en millisecondenschaal, het meest relevante tijdsbereik om de functionaliteit van eiwitten te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de moleculaire biofysica en eiwitwetenschap, zoals welke residuen protoneren en wanneer dit gebeurt tijdens het functionele mechanisme van een eiwit, of wanneer er grote veranderingen in eiwitten optreden.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Victor Ria, onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Monteer eerst het accessoire voor gedempte totale reflectie (ATR) in het monstercompartiment van de FTIR-spectrometer. Meet een breed energiespectrum met een resolutie van 4 cm⁻¹ van het schone oppervlak van het interne reflectie-element middels conventionele rapid-scan FTIR-spectroscopie. Bedek het oppervlak van de ATR met 20 µL van de buffer met hoge ionsterkte die later wordt gebruikt om het monster te rehydrateren.

Meet vervolgens de IR-absorptie van de buffer. Verwijder daarna de buffer en spoel het oppervlak af met water zonder het aan te raken. Verwijder de resterende vloeistof met een krachtige luchtstroom en verspreid ongeveer 3 µL van een eiwitoplossing van bacteriële rodopsine in purpermembraan met een concentratie van 6 mg/mL over het oppervlak.

Droog de eiwitsuspensie onder een zachte stroom droge lucht totdat er een film is ontstaan. Meet vervolgens het absorptiespectrum van de droge film. Voeg daarna voorzichtig 20 tot 40 µL van de buffer met hoge ionsterkte toe om de droge film te rehydrateren.

Dek de A TR-houder af met een deksel om waterverdamping te voorkomen en meet het absorptiespectrum. Schat het percentage monster dat nabij het oppervlak overblijft na rehydratie van de film door het absorptiespectrum van de buffer af te trekken. Voeg op dit punt 10 µL channel opsin two, opgelost in dec alside in een buffer met lage ionsterkte, toe in het centrum van een bariumfluoridevenster met een diameter van 20 mm.

Verdeel de oplossing met behulp van de micropipetpunt tot een diameter van zes tot acht millimeter met een zachte stroom droge lucht om een warme, homogene film te verkrijgen met een diameter die ongeveer overeenkomt met de grootte van de IR-straal bij de grootste opening. Gebruik vervolgens een platte siliconen O-ring met een dikte van één millimeter. Hydrateer de film door drie tot vijf µL van een mengsel van glycerol en water toe te voegen, verdeeld over drie tot vijf druppels rondom de droge film, en sluit deze stevig af met een tweede venster.

Plaats de bariumfluoride-sandwichvensters in een houder. Plaats vervolgens de houder in het monstercompartiment. Meet een absorptiespectrum.

Bevestig dat de maximale absorptie in de amide-I-regio tussen 0,6 en 1,0 ligt voor de A TR-opstelling. Gebruik een optische vezel die bovenop het A TR-deksel is geplaatst om de laser aan het monster te koppelen. Stel de energiedichtheid van de laser bij het monster in op twee tot drie millijoules per vierkante centimeter per puls.

Gebruik een vermogensmeter of transmissie-experimenten en zet spiegels in om de laser naar het monster te leiden en gebruik, indien nodig, lenzen om de laserstraal te collimeren of af te buigen tot een diameter die iets groter is dan de grootte van de monsterfilm. Synchroniseer de laserpuls met de gegevensregistratie door gebruik te maken van de Q-switch. Gebruik de sync-out TTL-puls van de elektronica van de neodymium-gedopeerde aluminiumgarnetlaser om de analoog-digitaal converter van de spectrometer te triggeren.

Stel de excitatiegraad van de laser zo in dat tijdopgeloste step-scanmetingen kunnen worden uitgevoerd in het spectrale bereik van 1800 tot 850 inverse centimeter. Plaats een optisch laagdoorlaatfilter in het optische pad dat opaak is boven 1 950 inverse centimeter en een goede transmissie heeft onder 1800 inverse centimeter.

Zet vervolgens de detector van AC- naar DC-gekoppelde modus. Breng op dit punt het DC-niveau van het INTERFEROGRAM naar nul door een biasstroom op de detector aan te leggen. Pas de elektronische versterking opnieuw aan om een optimaal gebruik te maken van het dynamisch bereik van de analoog-digitaalconverter.

Start daarna het step-scanmenu van de FTIR-spectrometer. Stel de doelspectrale bandbreedte voor de step-scanmeting in op een achtste van het golfgetal van de heliumneonlaser. Stel de spectrale resolutie en faseresolutie respectievelijk in op 8 cm⁻¹ en 64 cm⁻¹.

Selecteer een appe-functie. Stel vervolgens de acquisitiemodus van het INTERFEROGRAM in op 'single side forward'. Stel de bemonsteringssnelheid van de analoog-digitaalomvormer in op de hoogste beschikbare waarde in het spectrometer.

Stel de trigger voor het experiment in op extern. Stel vervolgens het aantal lineair verdeelde datapunten in dat moet worden geregistreerd, inclusief 100 pre-trigger punten. Stel daarna het aantal co-edities of het aantal gemiddelden van de fotoreactie per spiegelpositie in en start het experiment.

Herhaal tenslotte het experiment 10 keer voor bacteria, redsin, en 35 keer op drie verschillende monsterfilms voor channel redsin two om ongeveer 200 co-addities per spiegelpositie te verkrijgen. Kenmerkende banden van peptidebinding amide-vibraties zijn te onderscheiden in het absorptiespectrum van het bacteria redsin droge schuim. Bij gebruik van buffers met een lage ionsterkte zet de film overmatig uit, waardoor de hoeveelheid proteïne die door het evanescente veld wordt gesondeerd, afneemt. De exacte afhankelijkheid tussen het zwellen van de film en de ionsterkte van de buffer zal, naast andere factoren, afhangen van de aard van de lipiden.

Filmzwelling na hydratatie vereist tijd om stabilisatie te bereiken voor bacteriën van dosin. In het paarse membraan is het proces mono-exponentieel met een tijdconstante van 12 minuten. Een 3D-plot van een typische tijd-opgeloste step scan, FDIR-experiment op bacteriën.

Hier wordt Redsin getoond. Spectra kunnen op specifieke tijdstippen worden geëxtraheerd. Bijvoorbeeld wanneer wordt verwacht dat intermediaire toestanden in de fotocyclus van bacterieel redsin hun hoogste populatie bereiken.

In de bacteriestaaf-rhodopsine fotocyclus tonen de tijdscurves van absorptieveranderingen bij 1.762 cm⁻¹ verslag uit over de protonerings- en deprotoneringsdynamiek van aspartaat 85, en bij 1.741 cm⁻¹ over veranderingen in waterstofbruggen en de deprotonerings- en reprotoneringsdynamiek van aspartinezuur 96. De tijdscurves bij 1.670 en 1.555 cm⁻¹.

Rapporteer over veranderingen in de MI één- en tweevibraties, die beide gevoelig zijn voor de conformatie van de peptide-backbone. Volgens deze methode kunnen, na de ontwikkeling ervan, andere technieken zoals site-directed neurogenese of retinaal enzymspectroscopie worden uitgevoerd om vibratiebanden toe te wijzen aan specifieke residuen in het eiwit. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de moleculaire biofysica om het functionele mechanisme van talloze verschillende lichtgedreven eiwitten te onderzoeken.