Kwantificering en Maat-profilering van extracellulaire blaasjes behulp Melodieuze Resistive Pulse Sensing

Het algemene doel van het volgende experiment is om extracellulaire blaasjes te kwantificeren en hun grootteprofiel te bepalen met behulp van instelbare resistieve pulssensing. De standaardaanpak is om metingen van de stroomblokkade van gezuiverde extracellulaire blaasjes te vergelijken met metingen van polystyreenbolletjes als standaard. Een tweede aanpak voor het karakteriseren van extracellulaire blaasjes is het toevoegen van polystyreenbolletjes aan het monster, wat wordt gebruikt bij het werken met complexe monsters, zoals niet-gezuiverde extracellulaire blaasjes.

In celkweekmedium karakteriseren de resulterende gegevens de grootte en het aantal extracellulaire blaasjes, ongeacht of deze gezuiverd of ongezuiverd zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals western blotting of flowcytometrie van extracellulaire blaasjes gebonden aan latexkraaltjes, is dat deze methode deeltjes direct in biologische vloeistoffen karakteriseert zonder dat fysieke isolatie of markering nodig is. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met de methode problemen ondervinden, omdat extracellulaire blaasjes heterogeen zijn in grootte.

Bij het detecteren van kleinere blaasjes kunnen grotere blaasjes de nanopore verstoppen. We hebben enkele praktische tips en tricks aan het protocol toegevoegd om snel terug te keren naar werkbare omstandigheden. We hebben geprobeerd de productie van extracellulaire blaasjes te verminderen en hadden een methode nodig om de concentratie blaasjes in de celcultuur te kwantificeren.Snet.

Tijdens het zoeken naar methoden om nanodeeltjes te karakteriseren, kwamen we TRPS tegen en hebben we de protocollen aangepast om deze geschikter te maken voor de karakterisering van exosomen, celcultuursupernatanten en andere biologische vloeistoffen. Begin met het aansluiten van het TRPS-instrument op een computer waarop de EyesOn Control Suite-software is geïnstalleerd. Zorg ervoor dat elektrische interferentie wordt geminimaliseerd, zoals besproken in het tekstprotocol.

Kies nu de grootte van de nanopore. Een NP 100 is de beste keuze voor blaasjes van 70 tot 200 nanometer, terwijl een NP 150 gebruikt kan worden voor blaasjes met een grootte van 85 tot 300 nanometer. Een NP 200 is beter geschikt voor het meten van blaasjes van 100 tot 400 nanometer.

Select vervolgens de complementaire polystyreen-kalibratiepartikels voor de NP 100 en NP 150; selecteer CPC 100-kalibratiepartikels voor de NP 200. Gebruik CPC 200-kalibratiepartikels. Vortex de kalibratiepartikels gedurende 30 seconden.

Indien ze nog steeds geaggregeerd zijn, gebruik dan sonicatie en verdun vervolgens de kalibratiepartikels in PBS tot de doelconcentratie. Afhankelijk van de nanoporegrootte moet het eindvolume ten minste 40 µL bedragen. Bevochtig nu de onderste vloeistofcel van het instrument door 78 µL PBS toe te voegen en dit onmiddellijk weer te verwijderen.

Dit vermindert het risico op de vorming van luchtbellen onder de nanopore. Plaats de nanopore vervolgens in de armen van het instrument. Meet de afstand tussen de twee tegenovergestelde armen met een digitale schuifmaat.

Voer deze waarde in de software in bij het veld genaamd stretch en klik, zodra dit is gedaan, op calibrate stretch met behulp van het zijwiel dat de afstand tussen de tegenovergestelde armen regelt. Rek de nanopore uit tot 47 millimeters. Zodra de juiste maat is bereikt, voegt u opnieuw 78 µL PBS toe aan de onderste vloeistofcel.

Begin het kalibratieproces door de bovenste vloeistofcel op de nanoporie te plaatsen en de afschermingskooi te bevestigen. Voeg vervolgens 40 µL verdunde kalibratiepartikels toe aan de bovenste vloeistofcel. Breng nu ten minste 0,8 kPa positieve druk toe.

Select met de variabele drukmodule (VPM) een positieve spanning en klik op 'aan'. Verminder vervolgens langzaam de rek terwijl de blokkade wordt geanalyseerd. Gebeurtenissen worden veroorzaakt door de kalibratiepartikels.

Naarmate de rek afneemt, zal de blokkadehoogte geleidelijk toenemen en zal de signaal-ruisverhouding daardoor verbeteren. Het verhogen van de spanning kan de blokkadehoogte ook vergroten, maar kan ook meer RMS-ruis genereren. Stop met het verminderen van de rek zodra de waargenomen blokkades de achtergrondniveaus passend overschrijden, zoals opgemerkt in het paneel met het signaalspoor.

Ten tweede, observeer de partikelrate. Deze heeft echter een minder strikte afkapwaarde. De partikelrate moet idealiter ten minste 100 per minuut zijn.

Als de partikelsnelheid echter hoger is dan 2000 per minuut, verdun dan het monster en kalibreer het instrument opnieuw. Een snelheid die zo hoog is, kan leiden tot onnauwkeurige metingen voor deze demonstratie. Voorheen gezuiverde extracellulaire blaasjes van een hersentumorcellijn worden gekarakteriseerd.

Begin met het laden van de kalibratiepartikels in de bovenste vloeistofcelpers. Zet het systeem aan, breng vervolgens druk aan met behulp van de VPM en registreer hier gegevens van ten minste 500 partikels. Er wordt een druk van 0.8 kilopascal toegepast.

Optioneel kan hiervoor ook een meting bij meerdere drukken worden uitgevoerd; verhoog de uitgeoefende druk en registreer een tweede kalibratiebestand. De drukvariaties moeten nu minimaal 0,2 kilopascal zijn, verwijder vervolgens het monster uit de bovenste cel en was de cel drie keer met 100 microliters PBS per wasbeurt. Veeg na het wassen de bovenste vloeistofcel af met pluisvrij papier.

Voeg vervolgens het experimentele monster toe. De basisstroom moet binnen 3% liggen van de stroom die werd waargenomen bij het meten van de kalibratieparticle. Zo niet, tik dan op de afschermkap of draai deze, bedien de zuiger of verwijder de nanopore volledig en spoel deze af met di water.

Als de waargenomen stroom goed is, pas dan exact dezelfde druk toe als bij de kalibratieparticles. Registreer vervolgens ten minste 500 particles en sla het databestand op. Indien er sprake is van een plotselinge onderbreking van de particle-detectie, een daling in de basisstroom of een plotselinge toename van de RMS-ruis, pauzeer dan de registratie en probeer de nanopore te ontstoppen.

Pipette het monster opnieuw op en neer. Tik tegen de afschermkap of draai deze, bedien de zuiger of verwijder de nanopore volledig en spoel deze schoon met DI-water. Een andere strategie is om de rek van de nanopore te vergroten tot 47 millimeters en de druk van de VPM gedurende ongeveer vijf minuten te maximaliseren.

Aangezien dit ook kan, kunt u de NPO in de software ontkoppelen. Ga naar het tabblad 'analyze data' en start de gegevensverwerking door met de rechtermuisknop op de optie 'unprocessed files' te klikken en de optie 'process files' te selecteren. Klik vervolgens op het selectievakje naast het monster om de monster- en kalibratiebestanden aan elkaar te koppelen.

Selecteer in de gekalibreerde kolom de overeenkomstige bestanden en klik op OK. De software zal verschillende monsterkenmerken weergeven, zoals grootte, distributie, basislijnduur, volledige breedte op halve hoogte (FWHM) en concentratieanalyses.

De volgende aanpak wordt gebruikt voor monsters, zoals biologische vloeistoffen, die bij de standaardmethode tijdens de preparatie leiden tot overmatige verstopping: centrifugeer ten minste 50 µL van het celcultuursupernatans dat de extracellulaire blaasjes bevat, gedurende zeven minuten bij 300 ×g. Bereid op dezelfde wijze een controle met alleen medium voor zowel het monster als de controle. Overbreng 20 µL van het supernatant naar nieuwe buisjes en voeg 20 µL PBS en 10 µL verdunde 335 nm polystyreenbead-stock toe met een concentratie van 10 miljoen beads per mL.

Stel het instrument nu op zoals voorheen, gebruikmakend van een NP 200 Nanopore, en meet het controlemonster dat enkel uit beads in medium bestaat. Ten eerste moet, voor de nauwkeurigheid, de achtergronddetectie van kleine niet-bead-deeltjes worden geminimaliseerd tot minder dan 10% van de bead-detecties. Meet nu elk monster één keer voordat de replicates worden geregistreerd.

Hierdoor worden de fluctuerende nanopore-condities over de monsters verdeeld. Elk monster moet in totaal drie keer worden gemeten door het monster met uitsluitend kalibratiekralen opnieuw te meten. Gebruik later tijdens de data-analyse spreadsheetsoftware om de concentratieberekeningen uit te voeren.

Een voorbeeldberekening is opgenomen in het geschreven protocol. Extracellulaire blaasjes werden gezuiverd uit het supernatant van U 87 M-G-E-G-F-R-V drie celkweek door middel van ultracentrifugatie, en vervolgens gemeten volgens het beschreven protocol met behulp van 115 nanometer kalibratiekraaltjes. Er werd een grootteverdeling voor de extracellulaire blaasjes verkregen.

Extracellulaire blaasjes werden ook direct gekwantificeerd uit het supernatant van glioblastoomcelculturen, met gebruik van de alternatieve methode waarbij het monster wordt gespike met een standaard. Er werden twee nanodeeltjespopulaties waargenomen. De kleinere extracellulaire blaasjes en de grotere bekende standaard; de schatting van de grootte van de twee populaties op basis van de bekende standaard identificeerde de blaasjespopulatie als groter dan 140 nanometers.

Kleinere extracellulaire blaasjes kunnen mogelijk zijn gedetecteerd met een kleinere nanopore-opening, maar dit zou waarschijnlijk leiden tot meer verstoppingen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één tot vier uur worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal geanalyseerde monsters. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat monsters aanpassingen aan het protocol kunnen vereisen.

Bijvoorbeeld, monsters die bestaan uit grotere vesicles vereisen mogelijk het gebruik van grotere nanoporiën bij een relatief grote rek, en metingen kunnen worden vergemakkelijkt door filtering of centrifugatie van monsters om cellulair debris te verwijderen, wat de nanoporie kan verstoppen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u extracellulaire vesicles kunt karakteriseren met behulp van TRPS. Afhankelijk van uw monster met extracellulaire vesicles kunt u het standaardprotocol toepassen of de aangepaste spike-in methode gebruiken.