Kwantificering en Maat-profilering van extracellulaire blaasjes behulp Melodieuze Resistive Pulse Sensing

Het algemene doel van het volgende experiment is om extracellulaire vesiclen te kwantificeren en het grootteprofiel te bepalen met behulp van tuneable resistive pulse sensing. De standaardbenadering is om de stroomblokkademetingen van gezuiverde extracellulaire vesiclen te vergelijken met die van polystyreenkralenstandaarden. Een tweede benadering voor het karakteriseren van extracellulaire vesiclen is om het monster aan te vullen met polystyreenkralen, wat wordt gebruikt bij het werken met complexe monsters zoals ongezuiverde extracellulaire vesiclen.

In celkweekmedium karakteriseren de resulterende gegevens de grootte en het aantal van de extracellulaire vesiclen, of ze nu gezuiverd of ongezuiverd zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals western blotting of flowcytometrie van ex extracellulaire vesiclen gebonden aan latexkralen, is dat deze methode deeltjes rechtstreeks in biologische vloeistoffen karakteriseert zonder dat fysische isolatie of labeling nodig is. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met de methode het moeilijk vinden omdat extracellulaire vesiclen heterogeen zijn in grootte.

Bij het detecteren van de kleinere vesiclen, kunnen grotere vesiclen het nanopore verstoppen. We hebben enkele praktische tips en trucs toegevoegd aan het protocol om snel terug te keren naar werkbare omstandigheden. We probeerden de productie van extracellulaire vesiclen te verminderen en hadden een methode nodig om de concentratie van vesiclen in celkweek te kwantificeren.Snet.

Op zoek naar methoden om nanodeeltjes te karakteriseren, kwamen we TRPS tegen en hebben we de protocollen aangepast om meer geschikt te zijn voor de karakterisering van sles en celkweek. S supernatanten en andere biologische vloeistoffen. Begin door het TRPS-instrument aan te sluiten op een computer met de eyes on control suite software die erop is geïnstalleerd. Zorg ervoor dat elektrische interferentie wordt geminimaliseerd zoals besproken in het tekstprotocol.

Kies nu de Nanopore-grootte. Een NP 100 is de beste keuze voor 70 tot 200 nanometer vesiclen, terwijl een NP 150 kan worden gebruikt voor 85 tot 300 nanometer grote vesiclen. Een NP 200 is beter geschikt om 100 tot 400 nanometer vesiclen te meten.

Selecteer vervolgens de complementaire polystyreen kalibratiedeeltjes voor de NP 100 en NP 150 selecteer CPC 100 kalibratiedeeltjes voor de NP 200. Gebruik CPC 200 kalibratiedeeltjes. Vortex de kalibratiedeeltjes gedurende 30 seconden.

Als ze nog steeds geaggregeerd zijn, gebruik dan sonicatie en verdun vervolgens de kalibratiedeeltjes in PBS tot de doelconcentratie. Op basis van de nanopore-grootte moet het eindvolume minimaal 40 microliter zijn. Bevochtig nu de onderste vloeistofcel van het instrument door 78 microliter PBS aan te brengen en deze onmiddellijk te verwijderen.

Dit vermindert het risico op het vormen van bellen onder de nanopore. Plaats vervolgens de Nanopore in de voorarmen van het instrument. Meet de afstand tussen de twee tegenovergestelde armen met digitale schuifmaten.

Voer deze waarde in de software in onder het veld genaamd stretch en klik eenmaal ingevoerd op stretch kalibreren met het zijwiel dat de afstand tussen de tegenoverliggende armen regelt. Rek de nanopore uit tot 47 millimeter. Eenmaal uitgerekt tot grootte, breng opnieuw 78 microliter PBS aan op de onderste vloeistofcel.

Begin met het kalibratieproces door de bovenste vloeistofcel op de nanopore te plaatsen en de afschermingskooi te bevestigen. Voeg vervolgens 40 microliter verdunde kalibratiedeeltjes toe aan de bovenste vloeistofcel. Breng nu minimaal 0,8 kilopascal positieve druk aan.

Gebruik de variabele drukmodule of VPM, selecteer een positieve spanning en klik op inschakelen. Verlaag vervolgens langzaam de stretch terwijl u de blokkade analyseert. Gebeurtenissen veroorzaakt door de kalibratiedeeltjes.

Naarmate de stretch afneemt, zal de blokkadehoogte geleidelijk toenemen en zal de signaal-ruisverhouding dus verbeteren. Het verhogen van de spanning kan ook de blokkadehoogte verhogen, maar kan ook meer RMS-ruis genereren. Stop met het verminderen van de stretch wanneer de waargenomen blokkades de achtergrondniveaus passend overschrijden, zoals genoteerd in het signaaltracepaneel.

Observeer ten tweede de deeltjessnelheid. Dit heeft echter een minder strenge grenswaarde. De deeltjessnelheid moet idealiter minimaal 100 per minuut zijn.

Als de deeltjessnelheid groter is dan 2000 per minuut, verdun dan het monster en kalibreer het instrument opnieuw. Een dergelijke snelheid kan leiden tot onnauwkeurige metingen voor deze demonstratie. Eerder gezuiverde extracellulaire vesiclen uit een hersentumorcellijn worden gekarakteriseerd.

Begin met het laden van de kalibratiedeeltjes in de bovenste vloeistofcelpers. Schakel in en breng vervolgens druk toe met behulp van de VPM en neem hier minimaal 500 deeltjesgegevens op. Er wordt een druk van 0,8 kilopascal toegepast.

Optioneel kan er ook een multidrukmeting worden gemaakt om dit te doen, verhoog de toegepaste druk en neem een tweede kalibratiebestand op. De drukincrementen moeten nu minimaal 0,2 kilopascal zijn, verwijder vervolgens het monster uit de bovenste cel en was de cel drie keer met 100 microliter PBS per wasbeurt. Na de wasbeurten, veeg de bovenste vloeistofcel schoon met pluisvrij papier.

Voeg vervolgens het experimentele monster toe. De basislijnstroom moet binnen 3%van de stroom liggen die wordt waargenomen bij het meten van de kalibratiedeeltjes. Zo niet, tik of draai de afschermingsdop, breng de plunjer aan of verwijder de nanopore volledig en spoel deze af met DI-water.

Als de waargenomen stroom goed is, breng de exacte druk toe die op de kalibratiedeeltjes is toegepast. Neem vervolgens minimaal 500 deeltjes op en sla het gegevensbestand op. Als er een plotselinge onderbreking van de deeltjesdetectie is, een daling van de basislijnstroom of een plotselinge toename van de RMS-ruis, pauzeer dan de opname en probeer de nanopore te ontstoppen.

Zoals eerder