Methoden te karakteriseren Spontane en Schrik-geïnduceerde Locomotion in een-Rotenon geïnduceerde Parkinson's Disease Model van

Het algemene doel van het volgende experiment is om schrikrespons-geïnduceerde en langdurige spontane locomotie te bepalen in een rotenon-geïnduceerd model voor de ziekte van Parkinson bij drosophila; dit wordt bereikt door drosophila op met rotenon aangevuld voedsel te kweken om het fenotype te induceren. Als tweede stap worden de vliegen onderworpen aan een schrikrespons-assay en een assay voor langdurige spontane locomotie met een dubbel vial-apparaat. In een drosophila-activiteitsmonitor laten de resultaten zien dat blootstelling aan rotenon locomotiedefecten veroorzaakt bij drosophila, gebaseerd op de kwantificering van de schrikrespons en de langdurige spontane locomotie.

Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van drosophila, modellen voor neurodegeneratieve aandoeningen en bewegingsstoornissen, zoals defecten in door schrik geïnduceerde locomotie en spontane locomotie op de lange termijn. Begin met het toevoegen van 1,5 gram instant drosophila-medium. Meng het medium in een standaard vliegbuisje met vijf milliliter gedeïoniseerd water dat de juiste dosis rotenon bevat.

Sedeer vervolgens acht tot 12 mannelijke vliegen in de leeftijd van één tot drie dagen met koolstofdioxide en breng ze over naar vials met het geneesmiddel. Laat de vliegen 20 minuten lang herstellen van de sedatie op aangevuld voedsel, waarbij de vial in een horizontale positie wordt geplaatst. Plaats de vial daarna rechtop in een incubator met een licht-donkercyclus van 12 uur bij 25 °C voor de rest van het experiment.

Plaats vervolgens een standaard fliesbuisje omgekeerd bovenop een ander buisje en verzegel de naad met tape om een dubbelbuis-apparaat te maken. Verdeel het dubbelbuisje vervolgens in drie gelijke secties van 6,33 centimeter door cirkels rond de buisjes te markeren met een permanente marker. Na drie dagen blootstelling aan het medicijn worden de vliegen overgebracht naar het dubbelbuis-apparaat.

Vervang de tape over de naad om de vliegen 15 minuten te laten acclimatiseren aan de nieuwe omgeving. Plaats de vials vervolgens op een witte achtergrond en stel de digitale camera in. Zorg ervoor dat het gehele apparaat in één beeldkader zichtbaar is, dat het dubbele vial-apparaat en de timer in beeld zijn en dat alle vliegen scherp zijn gesteld.

Markeer de positie van de camera en het vial om consistente beelden tussen de proeven te behouden, waarbij het proefnummer en de medicijnbehandeling duidelijk in beeld worden weergegeven. Tik vervolgens het dubbele vial-apparaat drie keer stevig tegen het aanrecht, zorg ervoor dat alle vliegen naar de bodem van het vial vallen en start onmiddellijk de timer. Maak gedurende één minuut elke vijf seconden een foto van het apparaat.

Laat de vliegen vervolgens één minuut ongestoord herstellen. Herhaal de assay nog twee keer, met telkens één minuut hersteltijd tussen elke poging. Beoordeel de foto's en noteer het aantal vliegen in elke sectie gedurende de tijd om de berekeningen uit te voeren; reconstitueer drie gram instant oph, een medium met 15 milliliter gedeïoniseerd water en de juiste dosis rotenon.

Plaats de buisjes na vijf minuten voorzichtig verticaal in transparante vials en breng het vaste voedsel tot een hoogte van één centimeter aan door aan het buisje te draaien. Druk vervolgens voorzichtig de plastic dop op het uiteinde van het buisje, waarbij moet worden voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Sedeer mannelijke vliegen van één dag oud met koolstofdioxide en plaats voorzichtig met een penseel één vlieg in elk buisje.

Stop vervolgens het uiteinde van de buis af met een klein wattenbolletje. Laat de vliegen 15 minuten lang herstellen van de kooldioxide terwijl de buizen in een horizontale positie staan, en controleer of alle vliegen levend en actief zijn. Plaats de buizen in de drosophila activity monitor of DAM, en controleer of alle buizen in dezelfde positie ten opzichte van de DAM staan.

Plaats de DAM in een incubator met een licht-donkercyclus van 12 uur bij 25 °C. Sluit vervolgens de DAM aan op het gegevensverzamelingsysteem. Open daarna de instellingen in de DAM-software.

Selecteer een bin-lengte van 10 minuten om de gegevensverzameling te starten en laat het programma zeven dagen lang gegevens verzamelen. Open vervolgens het DAM-bestandscanprogramma en open de monitorgegevens door op 'select input data' te klikken. Selecteer daarna het juiste monitorbereik en stel de bin-lengte in op intervallen van 10 minuten.

Kies vervolgens bij het bestandstype van de output voor kanaalbestanden en laat alle andere opties op hun standaardwaarden staan. Klik daarna op 'scan data' en sla de bestanden op in een aangewezen map. Importeer tot slot de gegevens in software voor circadiane data-analyse om de counts per minute te verkrijgen.

Na drie dagen blootstelling aan verschillende doseringen vertoonden roone wildtype Canton-s vliegen die waren blootgesteld aan verhoogde doseringen een tekortkoming in de schrikreactie. Een lager percentage vliegen bevond zich in het bovenste gedeelte en een hoger percentage in het onderste gedeelte van de apparatus na 30 seconden, wat duidt op een deficiëntie in de schrikreactie; een vergelijkbare trend werd waargenomen bij vliegen in de assay voor spontane locomotie. De tellingen per minuut werden gemeten met de drosophila activity monitor of DAM.

Op de vierde dag na blootstelling vertonen vliegen die zijn blootgesteld aan 250 micromolair en 500 micromolair rotenone een significante afname in counts per minute. Deze assays kunnen gemakkelijk worden aangepast om locomotiedefecten in andere slokdarmmodellen van ziekten en de effectiviteit van therapeutische middelen te karakteriseren.