Name: Gecombineerde DNA-RNA-TL In situ Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: Leer DNA-RNA-FISH voor X-chromosoom inactivatie in gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen. Deze methode maakt gelijktijdige detectie van RNA en DNA mogelijk voor genregulatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken alle voormalige en huidige leden van de afdeling Reproductie en Ontwikkeling van de Erasmus MC voor nuttige en stimulerende discussies gedurende de afgelopen jaren. We willen ook de drie anonieme recensenten bedanken voor hun nuttige feedback. Het werk in het Gribnau-lab wordt ondersteund door financiering van de Nederlandse onderzoeksraad (NWO-VICI) en een ERC-startsubsidie.

1. Inductie van differentiatie in vrouwelijke embryonale stamcellen aan X-chromosoom inactivatie Braken OPMERKING: Vrouw muis embryonale stamcellen (op aanvraag) worden geteeld onder standaard ES-cel voorwaarden ontsloten kweekschalen gecoat met muis embryonale fibroblasten (MEF). Wij hier aannemen dat de lezer bekend is met standaard celkweek technieken 39-41. Om differentiatie induceren, wordt ES cellen gekweekt in T25 gerechten worden gescheiden van de MEFs en worden uitgeplaat in differentiatiemedium. <ol><li> Verwijder ES medium uit de ES-cel cultuur, en twee keer wassen met celkweek PBS. </li><li> Voeg 1,5 ml trypsine-EDTA (voorverwarmd tot 37 ° C) en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 7 minuten. Na 3,5 minuten, schud de schotel voorzichtig te breken van de kolonies. </li><li> Inactivatie van het trypsine-EDTA door toevoegen van 3,5 ml differentiatiemedium aan de cellen. Pipet cellen omhoog en omlaag om een ​​enkele cel oplossing te verkrijgen, en het verzamelen vanin een 15 ml buisje. Centrifugeren gedurende 5 min bij 200 xg en cellen te verzamelen in 10 ml differentiatiemedium. </li><li> Voeg celsuspensie aan een niet-gegeleerd kweekschaal en incubeer gedurende 1 uur in een celkweek incubator. OPMERKING: MEF kunnen toetreden tot de niet-gegeleerde kweekschaal wordt, dat ES cellen in suspensie blijven. </li><li> Ondertussen voeg gesteriliseerde glazen dekglaasjes (24 x 24 mm) tot 6-well platen, voeg 0,2% gelatine en incubeer gedurende minimaal 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Na 1 uur, verzamel de bovenstaande vloeistof van de pre-plated ES celcultuur, die hoofdzakelijk bestaan ​​uit niet-hechtende ES-cellen. Plate ES cellen 6-well platen met dekglaasjes. OPMERKING: Gebruik ⅙ e van een confluente T25 schotel voor 6 putjes van een 6-wells plaat. Dit zal een samenvloeiing differentiatie mogelijk te maken en na 3 dagen van differentiatie. Verander medium op een dagelijkse basis. Voor langere differentiatie tijd cursussen, plaat pre-plated ES-cellen in differentiatiemedium in bacteriële gerechten, en incubaten op een cel shaker geïntegreerd in de celkweek incubator. Hierdoor kan de cellen embryoid organen, waarvan dekglaasjes kunnen worden uitgeplaat 1-2 dagen voor fixatie vormen. </li></ol> 2. Bevestiging van gedifferentieerde ES cellen voor latere DNA-RNA FISH analyse <ol><li> Verwijder differentiatiemedium uit differentiatie culturen, en tweemaal wassen met celkweek PBS. OPMERKING: Voeg PBS voorzichtig om te voorkomen dat cellen worden weggespoeld. </li><li> Verwijder celkweek PBS en zet cellen door toevoeging van 4% paraformaldehyde (PFA) / PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. LET OP: PFA is giftig en kan significant risico voor de gezondheid opleveren wanneer ze ingeademd of wanneer het in contact op de huid of ogen. Bovendien PFA is kankerverwekkend. </li><li> Verwijder 4% PFA / PBS, en was dekglaasjes 3x met 70% ethanol. OPMERKING: Correct wassen is belangrijk, omdat elk spoor van PFA zal interfereren met latere FISH stappen. Dekglaasjes worden opgeslagen in 70% ethanol bij -20 ° C gedurende enkele maanden voor FISH analyse. </li></ol> 3. Labeling van DNA probes voor FISH Experimenten LET OP: Zorg voor een DNA-fragment van het gen van belang (minimale lengte&gt; 2 kb voor RNA FISH, of&gt; 20 kb voor DNA FISH), of een BAC die het gen van belang. Voor RNA-detectie, kan een kleinere sonde voldoende opzichte DNA detectie, aangezien waarschijnlijk transcriptie zal leiden tot meervoudige transcripten, die gelijktijdig kunnen worden gedetecteerd. Voor een sterk signaal op de kopie DNA-streng, is een langere probe nodig, kunnen voldoende opgenomen haptenen detecteren. Bij voorkeur wordt een niet-getranscribeerde genomisch gebied gekozen ontwerpen van de DNA probe. Bovendien, wanneer een kleinere sonde naar RNA te detecteren, zal worden voorkomen dat de genomische loci waarvan het RNA wordt getranscribeerd wordt gedetecteerd in de gecombineerde DNA-RNA FISH benadering, hoewel dit niet volledig worden uitgesloten. Om muis Xist detecteren, werd een 5,5 kb cDNA-probe gebruikt. Voor detectie van het X-chromosoom, kan verschillende BAC probes worden gebruikt. Goede resultaten zijn verkregen met een mengsel van BAC RP23-100E1 en BAC CT7-474E4, die zich bevinden in de nabijheid van de Xist locus. Afhankelijk van het gen of chromosoom plaats kan verschillende probes vereist voor optimale resultaten. Wanneer het werken met materialen die zullen worden gebruikt voor RNA-FISH, gebruik steriel filter tips, RNAse vrij H 2 O, en werken in een schone omgeving. <ol><li> Neem 1 ug DNA en verdund in H2O in een totaal volume van 16 pl. Voeg 4 ul van digoxigenine of biotine etikettering oplossing (zie reagentia), meng door vortexen en incubeer bij 16 ° C gedurende 90 minuten. OPMERKING: De biotine of digoxigenine-gelabelde nucleotiden zal nu door nick-translatie worden opgenomen. </li><li> In de tussentijd bereiden G50 kolommen aan niet-geïntegreerde nucleotiden te verwijderen. Neem een ​​spuit 2 ml, verwijder de stamper en voeg gesteriliseerd katoen in de spuit. Voeg G50 ballen in oplossing to vul de spuit, plaats spuit in een 15 ml buis en centrifugeer bij 642 xg gedurende 1 minuut. OPMERKING: Ongeveer 80% van de spuit moet nu worden gevuld met G50. Herhaal wanneer minder G50 aanwezig is. </li><li> Na 90 min, voeg 40 ui H2O de nick-translatie reactiemengsel en voeg de reactie op de kolom G50. Voeg een lege buis onder de kolom en centrifugeer bij 642 xg gedurende 2 minuten. Verzamel de stroom door een reactiebuis. </li><li> Meet het volume van de stroming door met een pipet en voeg H2O tot een totaal volume van 200 pi te bereiken. Neerslag de doorstroming door toevoeging van 13,3 ul zalmsperma DNA (10 mg / ml), 13,3 ul tRNA (10 mg / ml), 26,7 pl muis Cot-1 DNA (1 mg / ml) en 28 ui 2 M NaAc, pH 5.6. Meng door vortexen, en voeg 533 ul ijskoude 100% ethanol. Schud de buis en centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de supernatant en was de pellet twee keer met 70% ethanol. Centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 5 minuten bij4 ° C en de lucht droog de pellet. Voeg 50 ul van 50 + hybridisatie-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten om het oplossen te vergemakkelijken. OPMERKING: Gemerkte probe kan worden opgeslagen voor meerdere jaren bij -20 ° C. LET OP: 50 + hybridisatie-oplossing bevat formamide, dat giftig is, kan de huid, ogen en luchtwegen irriteren, en is ook een teratogeen. </li></ol> 4. Permeabilisatie, Voorbehandeling en hybridisatie van Vaste Cellen voor gecombineerde DNA-RNA FISH <ol><li> Hydrateren gefixeerde cellen op dekglaasjes, door het verwijderen van 70% ethanol en toevoeging van celkweek PBS om de 6-well platen. Incubeer gedurende 5 minuten. Herhaal in totaal drie keer. </li><li> Verwijder celkweek PBS en voeg 0,2% pepsine de 6-well platen, om de cellen te permeabiliseren. Incubeer 6-well platen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 4 minuten. Verwijder pepsine en inactiveren met RNAse vrij H2O </li><li> Post-fix cellen door incubatie met 4% PFA / PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Na fixatiop, was tweemaal met celkweek PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Uitdrogen cellen door incubatie met 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Overdracht coverslips van de 6-well platen, en de lucht drogen dekglaasjes gedurende enkele minuten. </li><li> Leeftijd cellen door incubatie dekglaasjes bij 65 ° C gedurende 1 uur op een verwarmingsplaat. </li><li> Pre-FISH probe hybridiseren met muizen Cot-1 DNA door optelling van elke dekglaasje te analyseren, 25 gl 50 + hybridisatieoplossing, 0,5 pi muis Cot-1 DNA, 1 ui met biotine gelabelde probe Xist en 1 pl digoxigenine BAC gemerkte probe detecteren van het X-chromosoom. Meng door vortexen en denatureren bij 99 ° C gedurende 5 minuten. Onmiddellijk Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten, zodat Cot-1 DNA te hybridiseren met sequenties in de probes herhalen. </li><li> Na veroudering, spot 50 pl denaturatie buffer (bestaande uit 70% formamide/2x SSC/10 mM fosfaatbuffer) op een glasplaatje, en zet dekglaasjes geplaatst met cellen naar towards de denaturatiebuffer. Incubeer bij 65 ° C gedurende 2 minuten. </li><li> Dekglaasjes naar 6-well platen en na correctie cellen toevoegen door incuberen in ijskoude 70% ethanol gedurende 5 minuten. </li><li> Uitdrogen cellen door daaropvolgende incubatie in 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Verwijder dekglaasjes van 6-well platen, en laat drogen aan de lucht gedurende een aantal minuten. </li><li> Spot vooraf gehybridiseerde probe op een glasplaatje, en incubeer dekglaasje geplaatst. Plaats de glaasjes in een bevochtigde kamer gevuld met 50 ml 50% formamide/2x SSC en incubeer overnacht bij 37 ° C. </li></ol> 5. Post-hybridisatie Wast en antilichaam-gemedieerde Detectie van Probe <ol><li> Fill 6-well platen met 2x SSC en pre-warm tot 42 ° C. Dekglaasjes Voeg na overnacht incubatie, en incubeer bij 42 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder 2x SSC en incubeer dekglaasjes met 50% formamide/2x SSC gedurende 10 minuten bij 42 ° C. Herhaal dit in totaal 3 keer (30 min wassen in totaal). </li&gt; <li> Verwijder 50% formamide/2x SSC en wassen dia&#39;s met Tris-zoutoplossing-Tween (TST) voor 2 x 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spot 50 pl Tris-zout-BSA (TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia&#39;s, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor het blokkeren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer. </li><li> Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. </li><li> Vlek 50 ul schapen-anti-DIG antistof (1:500 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven de eerste incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer. </li><li> Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. </li><li> Spot 50 ul van konijn-anti-schaap antilichaam geconjugeerd met FITC (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia&#39;s, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de tweede incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer . </li><li> Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. </li><li> Vlek 50 gl geit-anti-konijn-antilichaam geconjugeerd met FITC (1:250 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven derde incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer . </li><li> Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. </li><li> Vlek 50 pl muis anti-biotine antilichaam (1:200 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven vierde incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer. </li><li> Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. </li><li> Spot 50 ul van ezel-anti-muis antilichaam geconjugeerd met Rhodamine (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia&#39;s, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de vijfde incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere chambER. </li><li> Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. </li><li> Spot 50 ul van geit-anti-paard antilichaam geconjugeerd met Rhodamine (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia&#39;s, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de zesde incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer . OPMERKING: de geit-anti-paard antilichaam zal de ezel-anti-muis antilichaam herkennen; bij beschikking van de onderzoeker, zal een geit-anti-ezel antilichaam zo goed werkt. </li><li> Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. Was eens 5 min met Tris-zoutoplossing (TS). </li><li> Uitdrogen cellen door daaropvolgende incubatie in 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Verwijder dekglaasjes van 6-well platen, en laat drogen aan de lucht gedurende een aantal minuten. </li><li> Spot een daling van montage medium met DAPI (zie reagentia) op een glasplaatje, en voeg dekglaasje omgekeerd op. Seal dia&#39;s met nagellak enFISH resultaten te beoordelen door fluorescentie microscopie (figuur 1). </li></ol>

<ol><li>Rudkin, G. T., Stollar, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+detection+of+DNA-RNA+hybrids+in+situ+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence.</a> Nature. 265, 472-473 (1977).</li>
<li>Imataka, G., Arisaka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+analysis+using+spectral+karyotyping+%28SKY%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY).</a> Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
<li>Mastenbroek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+genetic+screening%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+RCTs%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs.</a> Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).</li>
<li>Martins-Taylor, K., Xu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Genomic+stability+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 30, 22-27 (2012).</li>
<li>Rens, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+evolution+of+the+duck-billed+platypus+karyotype+with+an+X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5+male+sex+chromosome+constitution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).</li>
<li>Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+gene+expression+noise+to+understand+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Using gene expression noise to understand gene regulation.</a> Science. 336, 183-187 (2012).</li>
<li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Rep. 46, 65-72 (2013).</li>
<li>Ji, N., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+of+C.+elegans+worms+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.</a> WormBook. , 1-16 (2012).</li>
<li>Femino, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+detection+of+molecular+hybrids+between+RNA+and+DNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections.</a> Nature. 225, 946-948 (1970).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).</li>
<li>John, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-DNA+hybrids+at+the+cytological+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-DNA hybrids at the cytological level.</a> Nature. 223, 582-587 (1969).</li>
<li>Bauman, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
<li>Wiegant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+fluoresceinated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with fluoresceinated DNA.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).</li>
<li>Langer, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+of+biotin-labeled+polynucleotides%3A+novel+nucleic+acid+affinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).</li>
<li>Manuelidis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+satellite+DNA+using+biotin-labeled+DNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes.</a> J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).</li>
<li>Kislauskis, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+3%27-untranslated+sequences+sort+alpha-cardiac+and+beta-cytoplasmic+actin+messenger+RNAs+to+different+cytoplasmic+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments.</a> J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).</li>
<li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).</li>
<li>Corput, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+using+horseradish+peroxidase-labeled+oligodeoxynucleotides+and+tyramide+signal+amplification+for+sensitive+DNA+and+mRNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection.</a> Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).</li>
<li>Jonkers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF12+is+an+X-Encoded+dose-dependent+activator+of+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation.</a> Cell. 139, 999-101 (2009).</li>
<li>Barakat, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF12+activates+Xist+and+is+essential+for+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li>
<li>Gontan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF12+initiates+X-chromosome+inactivation+by+targeting+REX1+for+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation.</a> Nature. 485, 386-390 (2012).</li>
<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+action+in+the+X-chromosome+of+the+mouse+%28Mus+musculus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L).</a> Nature. 190, 372-373 (1961).</li>
<li>Barakat, T. S., Gribnau, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((chromosome+inactivation+in+the+cycle+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">chromosome inactivation in the cycle of life.</a> Development. 139, 2085-2089 (2012).</li>
<li>Augui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).</li>
<li>Brown, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+from+the+region+of+the+human+X+inactivation+centre+is+expressed+exclusively+from+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome.</a> Nature. 349, 38-44 (1991).</li>
<li>Brockdorff, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+position+and+exclusive+expression+of+mouse+Xist+from+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 329-331 (1991).</li>
<li>Borsani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+gene+expressed+from+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 325-329 (1991).</li>
<li>Barakat, T. S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+inactivation+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosome inactivation and embryonic stem cells.</a> Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Okamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eutherian+mammals+use+diverse+strategies+to+initiate+X-chromosome+inactivation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development.</a> Nature. 472, 370-374 (2011).</li>
<li>Gribnau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+choice+occurs+independently+of+asynchronous+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing.</a> J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA%2C+DNA%2C+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li>
<li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence%2C+RNA%2C+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li>
<li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gecombineerde DNA-RNA vis kan worden technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor minder stabiele RNA-moleculen kunnen worden. Verschillende benaderingen zijn toegepast op zowel DNA als RNA studie in dezelfde cel, omzeilen de noodzaak voor gelijktijdige incubatie met probes detecteren zowel DNA en RNA. Bijvoorbeeld, in een superpositie benadering wordt eerst RNA FISH uitgevoerd en de cellen worden afgebeeld en coördinaten worden genomen. Vervolgens worden dezelfde slides gebruikt ...

Studeren cellen en weefsels door middel van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is sinds de invoering ervan in de late jaren 1970 1, mogen onderzoekers genen, chromatine organisatie en de genexpressie te bestuderen op het subcellulaire niveau. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica, karyotypering 2, kankerdiagnostiek 3 en pre-implantatie genetische screening 4, en heeft een belangrijke rol in moleculair onderzoek 5-6 aangezien het de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving. Enkele cel expressie analyse op RNA FISH kunnen inheemse primaire transcripten en niet-coderende RNA&#39;s worden afgeschreven van chromosomen, en biedt voordelen voor andere technieken die op populatieniveau genexpressie te beoordelen, met inbegrip van bijvoorbeeld kwantitatieve RT-PCR, genoom-wijde expressie analyse of Northern blotting . Door het visualiseren van RNA-transcripten die rechtstreeks afkomstig zijn van hun sites van herkomst, heeft het bijvoorbeeld geweestgemerkt dat genexpressie stochastische 7 en soms allelspecifieke 8 zijn. Verbeteringen in de techniek zijn ook toegestaan ​​de detectie en kwantificering van afzonderlijke mRNA-moleculen in de cellen 9-11. Het basisprincipe van FISH bestaat uit hybridisatie van nucleïnezuren in de cel een nucleïnezuur probe door zeer specifieke Watson en Crick baseparing. De probe kan direct of indirect gedetecteerd, waardoor een signaal dat microscopisch kan worden gevisualiseerd. Initiële pogingen bestond uit radioactief gemerkte probes die nadelen had gebaseerd op veiligheid, beperkte ruimtelijke resolutie en de mogelijkheid om slechts een doelwit tegelijk 12-14. De verdere ontwikkeling van niet-radioactieve labels, waaronder fluorochromen, haptenen, en enzymen, heeft geleid tot de brede verspreiding gebruik van FISH als een routine moleculaire biologie techniek. De FISH probe kan direct worden gelabeld met fluorochromes door chemische koppeling van fluorescerende moleculen nucleïnezuur sequenties 15 en integratie van fluorescent gemerkte nucleotiden 16-19, of de sonde kan indirect worden gevisualiseerd na integratie van haptenen (zoals biotine en digoxigenine) en immunologische detectie van haptenen met hapteen antilichamen geconjugeerd aan fluorescerende reportermoleculen 20-21. Deze aanpak maakt signaalversterking door verscheidene lagen fluorescerend gemerkte antilichamen die worden gebruikt om het originele signaal te versterken, en maakt de detectie van RNA-soorten die worden uitgedrukt op lage niveaus. Door directe en indirecte labeling technieken en diverse haptenen kunnen meerdere doelen gelijktijdig worden gevisualiseerd binnen dezelfde cel. Een van de belangrijkste stappen in FISH protocollen is de hybridisatie van de probe aan het doelwit. Hoewel in theorie een probe specifiek alleen binden aan zijn doel in praktijk specificiteitniet altijd bereikt, als probes binden aan homologe gebieden en hybridisatieomstandigheden niet altijd ideaal voor een bepaalde DNA-gebied of RNA soort. Post-hybridisatie wassingen zijn daarom van bijzonder belang, aangezien zij de stringentie van de FISH procedure kan verhogen, en kan voorkomen dat niet-specifieke binding van FISH probes die resulteert in een hoge mate van achtergrondgeluiden. Als RNA-moleculen enkel zijn gestrand zij gemakkelijk kunnen worden gehybridiseerd met een FISH probe. In tegenstelling, het dubbelstrengs DNA-molecuul heeft een eerste denaturatiestap, waarna een probe hybridiseren. Dit wordt gewoonlijk bereikt door verhitting van het monster, waardoor denaturatie van het DNA. Echter, onder deze zware omstandigheden, breekbaar, enkelstrengs RNA-moleculen kunnen verloren gaan. Daarom gecombineerde DNA-RNA FISH vereist aanzienlijke optimalisering van de omstandigheden en is technisch uitdagend vergelijking met de afzonderlijke detectie van enkel RNA of DNA. Hier presentatie weta gedetailleerd protocol van gecombineerde, gelijktijdige DNA-RNA FISH die heeft ons toegestaan ​​om X-chromosoom inactivatie (XCI) studeren in het onderscheiden vrouwelijke muis embryonale stamcellen 22-24. XCI is een cruciaal epigenetisch mechanisme voor vrouwelijke embryonale ontwikkeling 25, en resulteert in heterochromatinization en dus zwijgen van een van de twee X-chromosomen in vrouwelijke individuen 26-27. Van essentieel belang om dit proces is het niet-coderende RNA Xist 28-30, die wordt gereguleerd door de RNF12 22-23 en REX1 24 eiwitten. Xist expressie wordt gereguleerd op de toekomst inactieve X-chromosoom (Xi) tijdens de embryonale ontwikkeling of bij ES celdifferentiatie in vitro en kunnen zich langs de X-chromosoom en daardoor chromatine remodeling enzymen die leiden tot transcriptionele uitschakeling van het X-chromosoom 31 te trekken. Deze verspreiding van Xist RNA kan door RNA FISH worden gevisualiseerd als een bekleding van de X-chromosommige, die ook wel een Xist cloud. Aangezien vrouwelijke ES-cellen een van hun X-chromosomen als gevolg van instabiliteit van het genoom kan verliezen, hebben wij en anderen werkzaam gecombineerde DNA-RNA FISH om XCI bestuderen, om ervoor te zorgen dat alleen karyotypisch stabiele cellen worden beoordeeld in de analyse van dit belangrijke proces 22,32 -34. Zoals bij elke moleculaire biologie technieken, hebben verschillende uitstekende protocollen gepubliceerd 35-38. Hier presenteren we onze werkwijze, uitgaande van de inductie van differentiatie in muizen ES cellen, fixatie van cellen, kenmerken van FISH probes door nick-translatie, voorbehandeling van gefixeerde cellen om permeabilisatie en daaropvolgende opname probe, hybridisatie van de probe aan de doel, en tenslotte detectie van de probe met fluorescent gemerkte antilichamen. De hierin gepresenteerde protocol kan de gelovigen detectie van Xist RNA en het X-chromosoom binnen een termijn van twee dagen, en de basis van deze techniek kan waarschijnlijk worden aangepast aan othaar systemen en onderzoeksgebieden.

<table><tbody><tr><td>vrouwelijke muis embryonale stamcellen</td><td></td><td></td><td>worden op verzoek beschikbaar gesteld</td></tr><tr><td>muis embryonale fibroblasten</td><td></td><td></td><td>kunnen worden afgeleid van E13.5 embryo's, of via commerciële bronnen bijv. Millipore</td></tr><tr><td>ES cel kweekmedium</td><td></td><td></td><td>DMEM, 15% foetaal kalfs serum, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine, niet-essentiële aminozuren, 0,1 mM α-mercaptoethanol en 1.000 U/ml LIF. Filter steriliseren en bewaren bij 4 &#176;C voor maximaal 2 weken.</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Kalfs Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline&ndash;streptomycine (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>α-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ES cel differentiatiemedium</td><td></td><td></td><td>IMDM-Glutamax, 15% verhit geïnactiveerd foetaal kalfs serum, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine, niet-essentiële aminozuren, 37,8 μl/L monothioglycerol en 50 μg/ml ascorbinezuur</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur (50 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>monothioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>T25 cel kweekschalen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>6-wells cel kweekschalen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>cel kweek kwaliteit PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25% (v/v) trypsine/0,2% (w/v) EDTA in PBS</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Falcon buizen</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 x 24 mm deksels</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td>gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>bereid een 0,2% gelatine/cel kweek PBS oplossing en autoclaveer</td></tr><tr><td>Pepsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>Verdun tot 0,2% in 0,01 M HCl (pH 2,0)</td></tr><tr><td>absoluut 100% ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td>gebruik absoluut 100% ethanol en RNAse vrij water om 70% en 90% ethanol oplossingen te maken</td></tr><tr><td>RNAse vrij water</td><td>Baxter</td><td>TKF7114</td><td></td></tr><tr><td>steriele filter tips</td><td>Rainin Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>digoxigenine-labeling kit (DIG-Nick translatie)</td><td>Roche</td><td>11745816910</td><td></td></tr><tr><td>biotine-labeling kit (Biotine Nick translatie)</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>2 ml spuit</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>gesteriliseerde katoen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>gist tRNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>muis cot-1 DNA 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tafel centrifuage</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf gekoelde centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5,6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ hybridisatie oplossing</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 2x SSC, 50 mM fosfaat buffer pH 7, 10% dextran sulfaat pH 7</td></tr><tr><td>formamide</td><td>Acros organics</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>dextran sulfaat</td><td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10 mM fosfaat buffer, pH 7</td><td></td><td></td><td>voeg 57,7 ml van 1 M Na2HPO4 en 42,3 ml 1 M NaH2PO4 toe; gebruik DEPC behandeld water en autoclaveer</td></tr><tr><td>denaturatie buffer</td><td></td><td></td><td>70% formamide/2x SSC/10 mM fosfaat buffer pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7,5 oplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-saline-Tween was oplossing (TST)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, voeg RNAse vrij water toe tot 1 L</td></tr><tr><td>10x saline oplossing</td><td></td><td></td><td>los 85 g NaCl op in 1 L RNAse vrij H2O en autoclaveer</td></tr><tr><td>Tris-saline-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse vrij H2O</td></tr><tr><td>BSA, gezuiverd, 100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>schapen-anti-dig antilichaam</td><td>Roche diagnostics</td><td></td><td>gebruik 1:500 verdund in TSBSA</td></tr><tr><td>konijn-anti-schapen antilichaam geconjugeerd met FITC</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>gebruik 1:250 verdund in TSBSA</td></tr><tr><td>geit-anti-konijn antilichaam geconjugeerd met FITC</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>gebruik 1:250 verdund in TSBSA</td></tr><tr><td>muis-anti-biotine antilichaam</td><td>Roche diagnostics</td><td></td><td>gebruik 1:200 verdund in TSBSA</td></tr><tr><td>ezel-anti-muis antilichaam geconjugeerd met Rhodamine</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>gebruik 1:250 verdund in

gecombineerde dna-rna-tl<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie (fish) aan x-chromosoom inactivatie studeren in gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de detectie van nucleïnezuren in cellen mogelijk maakt. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica en kankerdiagnostiek en kunnen afwijkingen van het genoom, die vaak belangrijke klinische implicaties detecteren. RNA FISH kunnen worden gebruikt om RNA-moleculen te detecteren in cellen en heeft belangrijke inzichten in regulatie van genexpressie verschaft. De combinatie van DNA en RNA FISH binnen dezelfde cel is technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor fragiele, enkelstrengs RNA-moleculen zou kunnen zijn. We stellen hier een gemakkelijk toepasbare protocol dat de gecombineerde gelijktijdige detectie van Xist RNA en DNA gecodeerd door de X-chromosomen mogelijk maakt. Deze gecombineerde DNA-RNA FISH protocol kan waarschijnlijk worden toegepast op andere systemen waar zowel RNA als DNA moeten worden gedetecteerd.

Met behulp van bovenstaande protocol voor gecombineerde DNA-RNA FISH, konden we X-chromosoom inactivatie visualiseren differentiëren vrouwelijke embryonale stamcellen zijn. Figuur 1 toont een representatief voorbeeld van een DNA-RNA FISH experiment waarbij we zowel Xist (die herkend zichtbaar als een zogenaamde Xist RNA wolk op het inactieve X-chromosoom en een basale transcriptie lokaliseren op actieve X-chromosoom), en een gebied van het X-chromosoom, die zichtbaar als lokaliseren si...

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van X-chromosoom-inactivatie in gedifferentieerde embryonale stamcellen van vrouwelijke muizen door middel van gelijktijdige gecombineerde DNA- en RNA-fluorescentie in situ hybridisatie, of DNA-RNA FISH. Dit wordt bereikt door eerst differentiatie te induceren in embryonale stamcellen van vrouwelijke muizen. Aangezien tijdens dit proces, dat de normale embryonale ontwikkeling na implantatie simuleert, X-chromosoom-inactivatie wordt geïnitieerd, leidt dit tot verhoogde transcriptie en accumulatie van Xist-RNA, dat codeert voor het toekomstige inactieve X-chromosoom.De tweede stap is het fixeren van de gedifferentieerde embryonale stamcellen met paraldehyde. Bereid vervolgens de probes voor het detecteren van zowel DNA van het X-chromosoom als cyst-RNA door DNA-fragmenten te labelen met biotine of digoxigenine middels nicktranslatie.De laatste stap is het uitvoeren van de D-N-A-R-N-A FISH-procedure. De gedifferentieerde embryonale stamcellen worden gepermeabiliseerd, gedenatureerd en gehybridiseerd met de gelabelde FISH-probes, die vervolgens worden gedetecteerd met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen die biotinylering of digoxigenine detecteren. Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de locatie van de twee chromosomen in vrouwelijke cellen aan te tonen en om de expressie van cyst-RNA van het X-chromosoom dat inactivering ondergaat te visualiseren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met andere methoden, zoals FISH-methoden waarbij RNA en DNA opeenvolgend worden gedetecteerd, is dat we met ons protocol beide typen nucleïnezuren gelijktijdig in hetzelfde specimen kunnen detecteren binnen minder dan twee dagen. Hoewel gecombineerde DNA- en RNA-FISH uitdagend kan zijn om uit te voeren, aangezien de optimale condities voor de detectie van DNA of RNA aanzienlijk verschillen. Met het hier gepresenteerde protocol zijn we in staat om zowel RNA als DNA afkomstig van beide X-chromosomen te detecteren in vrijwel alle geanalyseerde cellen.Dit heeft ons in staat gesteld om de X-chromosoomactivatie te bestuderen terwijl deze plaatsvindt tijdens de differentiatie van embryonale stamcellen van vrouwelijke muizen of bij abnormale ontwikkeling van vrouwelijke muizen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het proces van X-activatie, een belangrijk en fascinerend proces dat optreedt tijdens de vroege embryonale ontwikkeling van de muis, kan deze waarschijnlijk ook worden toegepast op andere biologische systemen waar het belangrijk is om RNA-transcripten te detecteren die afkomstig zijn van het native chromatine. Dit is aangezien non-coding RNA's in toenemende mate worden gewaardeerd om hun belang in biologische systemen en omdat benaderingen op single-cell niveau vaak de voorkeur hebben boven alternatieve methoden waarbij volledige celpopulaties worden geanalyseerd. Wij voorzien dat dit protocol nuttig zal zijn voor een brede wetenschappelijke gemeenschap.Vrouwelijke embryonale stamcellen van muizen of E ESL worden gekweekt onder standaard ESL-condities op met gelatine gecoate kweekschalen bekleed met embryonale fibroblasten van muizen (MEFs) om de procedure voor de inductie van differentiatie te starten. Verwijder het ES-medium uit de ESL-kweek en was tweemaal met celluulcultuur-PBS. Voeg 1,5 milliliters TRYPSIN EDTA toe, voorverwarmd tot 37 °C, en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende zeven minuten. Schud de schaal na 3,5 minuten voorzichtig om de kolonies op te breken.Inactiveer de trypsine EDTA door 3,5 milliliters differentiatiemedium aan de cellen toe te voegen, pipetteer de cellen herhaaldelijk op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen en verzamel deze in een 15 milliliter buis. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 Gs. Na het verzamelen van de cellen in 10 milliliters differentiatiemedium, voegt u de celsuspensie toe aan een niet-gelatiniseerde 10 centimeter kweekschaal en incubeert u deze gedurende één uur. In een celkweekincubator zullen MES hechten aan de niet-gelatiniseerde kweekschaal, terwijl ES-cellen in suspensie blijven.Plaats in de tussentijd steriele glazen dekglasjes in zeswellplaten, voeg 0,2% gelatine toe en incubeer gedurende minimaal vijf minuten. Verzamel na één uur bij kamertemperatuur het supernatant van de geprepareerde ESL-cultuur, dat voornamelijk zal bestaan uit niet-adhererende ESL's. Verdeel na verdunning de ESL's over de zeswellplaten die de dekglasjes bevatten.Begin deze procedure door het differentiatiemedium uit de differentiatieculturen te verwijderen en tweemaal te wassen met PBS voor celkweek. Voeg het PBS zorgvuldig toe om te voorkomen dat de cellen worden weggespoeld. Fixeer de cellen door 4% paraformaldehyde PBS toe te voegen en 10 minuten te incuberen bij kamertemperatuur.Verwijder na 10 minuten het paraformaldehyde en was de dekglasjes drie keer met 70% ethanol. Om de DNA-probes voor labeling voor te bereiden, wordt eerst één microgram van elk respectievelijk DNA in water verdund tot een totaalvolume van 16 µL. Voeg vervolgens vier µL oxgenine- of biotinelabeling-oplossing toe, meng door middel van vortexen en incubeer gedurende 90 minuten bij 16 °C.Hiermee worden de met biotine of dig-oxygen gelabelde nucleotiden door NIC-translatie ingebouwd. Bereid ondertussen G 50-kolommen voor. Om niet-geïntegreerde nucleotiden te verwijderen, neemt u een spuit van twee milliliter, verwijdert u de zuiger en voegt u gesteriliseerd katoen toe aan de spuit.Voeg G 50-bolletjes en oplossing toe om de spuit te vullen. Plaats de spuit vervolgens in een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer deze bij 642 GS gedurende één minuut. Na centrifugatie moet de spuit voor ongeveer 80% gevuld zijn met G 50. Voeg na 90 minuten 40 microliters water toe aan elk NIC-translatie-reactiemengsel en breng de reactie over naar de G 50-kolom.Plaats een lege buis onder de kolom en centrifugeer 2 minuten bij 642 Gs. Verzamel het doorstroomvolume in een reactiebuis. Meet het volume van het doorstroomvolume met een pipet en voeg vervolgens water toe tot een totaal volume van 200 microliters is bereikt.Om de doorstroom te neerslaan, voegt u salmon sperm DNA, gist tRNA, muis caught 1D NA en twee molair natriumacetaat toe en mengt u dit door vortexen. Voeg 533 µL ijskoud 100% ethanol toe, schud de buis en centrifugeer 30 minuten bij 16.200 ×g bij 4 °C. Verwijder na voltooiing van de centrifugatie het supernatant en was het pellet tweemaal met 70% ethanol; centrifugeer vijf minuten bij 16.200 ×g bij 4 °C en laat het pellet aan de lucht drogen.Wanneer de pellet droog is, voegt u 50 µL van een 50plus hybridisatieloplossing toe en incubeert u dit 30 minuten bij 37 °C. Om het oplossen vóór de permeabilisatie te vergemakkelijken, rehydrateert u de gefixeerde cellen; ontdoe de objectglaasjes van de 70% ethanol en voeg celluultur-PBS toe aan de cellen.Incubeer gedurende vijf minuten en herhaal dit in totaal drie keer om de cellen te mobiliseren. Verwijder de PBS voor celkweek en voeg 0,2% pepsin toe aan de zes-wells platen. Incubeer de platen in een waterbad bij 37 °C gedurende vier minuten.Verwijder daarna de pepsin en inactiveer met RNA-vrij water. Fixeer de cellen nageslagen door ze na fixatie vijf minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 4% paraformaldehyde in PBS, en was ze tweemaal gedurende vijf minuten met celkweekmedium of PBS. Dehydrateer de cellen door incubatie met 70% ethanol gedurende drie minuten, 90% ethanol gedurende drie minuten en 100% ethanol gedurende drie minuten.Breng daarna de dekglasjes over vanuit de zes-wells-platen en laat de dekglasjes enkele minuten drogen. Laat de cellen verouderen door de dekglasjes één uur lang bij 65 °C op een warmteplaat te incuberen. Prehybridiseer ondertussen de visprobes met mouse coat 1D NA door deze voor elk te analyseren dekglasje samen te voegen.25 µL van 50 plus hybridisatieoplossing, 1 µL biotinyl-gelabelde cyst Probe, 1 µL digoxygenein-gelabelde BAC-probe voor de detectie van het X-chromosoom en 0,5 µL muizen-Cot-1 DNA mengen door middel van vortexen en denatureren bij 99 °C gedurende vijf minuten. Onmiddellijk incuberen bij 37 °C gedurende 45 minuten om het Cot-1 DNA te laten hybridiseren met repetitieve sequenties in de probe.Zodra de cellen op de dekglasjes zijn verouderd, brengt u 50 µL de-maturatiebuffer aan op een glazen objectglas en plaatst u de dekglasjes hierop met de cellen naar de de-maturatiebuffer gericht. Incubeer gedurende twee minuten bij 65 °C. Fixeer de cellen vervolgens door de dekglasjes terug te brengen naar de zeswells-platen die vooraf zijn gevuld met ijskoude 70% ethanol en incubeer gedurende vijf minuten.Dehydrateer de cellen door opeenvolgende incubatie in 70% ethanol gedurende drie minuten, 90% ethanol gedurende drie minuten en 100% ethanol gedurende drie minuten. Verwijder de dekglasjes uit de zes-wells platen en laat ze enkele minuten aan de lucht drogen. Breng geprehybridiseerde Probe aan op een objectglas en incubeer een dekglasje hierbovenop.Plaats de objectglazen in een bevochtigingskamer gevuld met 50 milliliters 50%IDE twee XSSC en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C. Na de incubatie overnacht worden de dekglasjes van de objectglazen overgebracht naar zes wall plates die zijn gevuld met twee XSSC en zijn voorverwarmd tot 42 °C. Incubeer gedurende vijf minuten bij 42 °C.Verwijder twee XSSC en voeg 50%form MI twee XSSC toe. Incubeer gedurende 10 minuten bij 42 °C. Was drie keer in totaal met 50%form IDE twee X-S-S-C-A gedurende 10 minuten bij 42 °C per wasbeurt.Na de derde wasbeurt wordt de 50% van mijn twee XSSC verwijderd en worden de preparaten tweemaal gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur gewassen met tris-saline-tween of TST. Voor het blokkeren worden 50 µL tris-saline BSA of T-S-P-S-A toegevoegd. Plaats het dekglas op nieuwe objectglazen en leg de dekglazen ondersteboven op het objectglas. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een met TST bevochtigde donkere kamer. Na 30 minuten worden de dekglazen teruggeplaatst in de zes-well platen en tweemaal gedurende vijf minuten gewassen met TST. Voor de incubatie van het eerste antilichaam worden 50 µL schapenantigeen en antilichaam per dekglas op nieuwe objectglazen geplaatst; leg de dekglazen ondersteboven op het objectglas en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een met TST bevochtigde donkere kamer.Vervolgens worden de dekglasjes geïncubeerd met een reeks fluorescentielabelled antilichamen om het oorspronkelijke signaal te versterken, zoals gedetailleerd in het bijbehorende manuscript. Na incubatie met een reeks fluorescentielabelled antilichamen worden de cellen gedehydrateerd door incubatie gedurende telkens drie minuten in 70% ethanol, 90% ethanol en 100% ethanol. Verwijder de dekglasjes uit de zeswellplaten en laat ze enkele minuten aan de lucht drogen.Breng tot slot met een applicator een druppel monteermedium aan op elk objectglas. Plaats een dekglas ondersteboven bovenop en verzegel de glaasjes met nagellak. Door dit protocol voor gecombineerde DNA-RNA FISH te gebruiken, kan de inactivering van het X-chromosoom worden gevisualiseerd in differentiërende vrouwelijke ES-cellen.Deze figuur toont een representatief voorbeeld van een A-D-N-A-R-N-A vis-experiment waarbij zowel cyst-RNA als een regio van het X-chromosoom gelijktijdig worden gedetecteerd. Cyst-RNA is een niet-coderend RNA dat essentieel is voor het proces van X-chromosoom-inactivatie. In differentiërende vrouwelijke ESL wordt hier cyst-RNA gedetecteerd met behulp van een biotine-gelabelde CD NA-sonde, die wordt gevisualiseerd met antilichamen geconjugeerd aan rumine en in het rood is aangegeven.Het X-chromosoom wordt gedetecteerd met behulp van een gelabelde BAC-probe voor Xist, die wordt gevisualiseerd met antilichamen geconjugeerd aan FITC (aangegeven in groen); kernen zijn tegengekleurd met DAPI (aangegeven in blauw). In bijna elke cel worden twee X-chromosomen gedetecteerd. Zowel grote cyste-accumulaties op de inactieve X-chromosomen (cyste-wolken) als basale cyste-expressie van het actieve X-chromosoom (cyste-puntjes) worden waargenomen.De cyste-pinpoints worden niet in elke nucleus gedetecteerd, omdat deze basale cyste-expressie na differentiatie stopt op het toekomstige actieve X-chromosoom. Let op dat sommige van de pinpoint-signalen afkomstig van het X-chromosoom zich binnen cystewolken bevinden, wat aantoont dat de cystewolk inderdaad langs het X-chromosoom lokaliseert en dit codeert zodra dit is bemeesterd. Deze techniek kan in minder dan twee dagen worden uitgevoerd en levert een betrouwbaar resultaat op mits deze correct wordt uitgevoerd.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u de differentiatie van vrouwelijke embryonale stamcellen van muizen induceert, hoe u deze cellen fixeert en hoe u ze voorbereidt om gecombineerde D-N-A-R-N-A fish uit te voeren. Houd er rekening mee dat het voor het succes van uw experimenten essentieel is om de temperaturen en incubatietijden constant te houden, zoals aangegeven in dit protocol. Daarnaast is het belangrijk om in een schone omgeving te werken.Als u een ander celtype gebruikt of een ander biologisch systeem bestudeert, kan enige optimalisatie nodig zijn om een optimaal resultaat te verkrijgen. Veel succes met uw experimenten.

combined-dna-rna-fluorescent-situ-hybridization-fish-to-study-x

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Een combinatie van verschillende technieken om het verzamelen van gegevens te maximaliseren van muis weefsel wordt gepresenteerd.

De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op Mitotische Chromosomen van muggen

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

We ontwikkelden een eenvoudig aan te passen streng-specifieke fluorescente in situ hybridisatie (FISH) protocol gecombineerd met immunofluorescentie. Dit maakt een gedetailleerde onderzoek mogelijk van RNA-dynamica met gelijktijdige inzicht in de chromatinestructuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie op enkelcellig niveau.

Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Reproducibly het om getallen te tellen van mRNAs in individuele eicellen, enkel molecuul RNA fluorescentie in situ is hybridisatie (RNA-vis) geoptimaliseerd voor niet-aanhanger cellen. Eicellen werden verzameld, gekruist met het transcript specifieke sondes en gekwantificeerd aan de hand van een afbeelding kwantificering software.

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

Leer DNA-RNA-FISH voor X-chromosoom inactivatie in gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen. Deze methode maakt gelijktijdige detectie van RNA en DNA mogelijk voor genregulatieonderzoek.

Gecombineerde DNA-RNA-TL In situ Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal

Gecombineerde DNA-RNA-TL

Meer video's verkennen