Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Het algemene doel van deze procedure is om elektrische stroom door een enkele ionenkanaal te meten. Dit wordt bereikt door eerst de ionenkanaal van belang heteroloog te exprimeren in cellen die gemakkelijk te werken zijn en bevorderlijk zijn voor de experimentele doelen. De tweede stap is om een vuur gepolijste pipet te gebruiken om een stabiele afdichting op het celmembraan te verkrijgen.

Vervolgens moet de experimentator het aantal kanalen dat in de patch aanwezig is, bepalen en als het een enkelkanaal betreft, de stroom te registreren, is de laatste stap het verwerken en analyseren van de gegevens. Uiteindelijk wordt het meten van stroom door enkelvoudige ionenkanalen gebruikt om de biofysische eigenschappen waarmee deze membraaneiwitten werken te onderzoeken, wat de basis vormt voor hoe neuronale en andere prikkelbare cellen communiceren. In tegenstelling tot methoden die het mogelijk maken om stromen door meerdere actieve ionenkanalen te meten, is het voordeel van deze benadering dat het meten van stromen door een individueel ionenkanaal je in staat stelt om een breed scala aan responspatronen die inherent zijn aan een bepaald kanaal, te visualiseren en te scheiden.

Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het neurologische veld te beantwoorden, zoals de invloed van fysiologische en therapeutische modulatoren op de communicatie tussen neuronen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze techniek worstelen omdat het moeilijk is om opnamen met laag geluidsniveau te verkrijgen die slechts een enkel ionenkanaal bevatten. Bij een eerste poging van deze methode is het echt nuttig om iemand te zien die het doet omdat om een echt stabiele afdichting te verkrijgen, wat het belangrijkste is in deze methode, je de cel op de juiste hoek voorzichtig moet naderen en het allerbelangrijkste is dat je volhardend moet zijn. Ter voorbereiding op de transfectie.

HEK 2 93 cellen worden een dag van tevoren geplaatst in schalen van 35 millimeter om ze tot 50 tot 60% confluentie te brengen in een steriele buis. Bereid het transfectiemengsel. Voeg een microgram van elk CDNA van belang toe, 315 microliter dubbel gedistilleerd water en 350 microliter van 42 millimolar hepen.

Voeg ten slotte 35 microliter calciumchloride druppelsgewijs toe om het precipitaat te vormen. Vortex de buis gedurende vijf seconden en voeg 175 microliter transfectiesuspensie toe aan elk van de vier schalen. Geplaatst de dag ervoor.

Incubeer de cellen gedurende twee uur op 37 graden Celsius. Na de incubatie, verwijder het medium en was met PBS. Voeg vervolgens twee milliliter groeimedium toe, aangevuld met twee millimolair magnesiumchloride om MDA receptor gemedieerde excitotoxiciteit te voorkomen.

Trek eerst twee symmetrische opnamepijpen uit glassilicaatglas met behulp van een verticaal trekapparaat. Vervolgens is vuur polijsten noodzakelijk om de juiste diameter en weerstand te verkrijgen. Stel vervolgens de opname in door de QUB data acquisitie software te openen en het acquisitievenster te selecteren.

Onder lay-out. Open een nieuw QUB databestand door op nieuwe gegevens te klikken en voer de experimentele parameters in die zullen worden gebruikt. Pas de amplitude schaal aan op 0,1 volt per pico ampère door met de rechtermuisknop op het databestand te klikken, eigenschappen te selecteren en op het datatabblad te klikken.

Na het vervangen van het medium met twee milliliter PBS dat calcium en magnesium bevat, monteer de schotel met cellen op het microscooptafel. Focus op het cellulaire veld met behulp van fasecontrast microscopie om te evalueren dat de cellen gezond zijn en goed in monolaagvorm aan de schotel gehecht zijn. Schakel over naar fluorescentie detectie om te verifiëren dat de transfectie succesvol was.

Stel vervolgens de parameters voor enkelkanaal opname in. Stel de modus in op spanningsklem en toegepaste spanning op plus 100 millivolt met de spanningshoudende opdracht. In de uitstand, selecteer de testknop voor de afdichting op basis van fluorescentie en algehele verschijning.

Kies een cel om te patchen, verifieer onder fasecontrast dat de cel goed aan de schotel is gehecht, een groot deel van het celoppervlak heeft blootgesteld voor patching en verder gezond uitziet. Vul een vers gepolijste pipet met een oplossing geschikt voor NMDA receptoren en cel-aanhechting experimenten en knijp zachtjes om eventuele luchtbelletjes te verwijderen. Bevestig de opnamepipet op de versterkerhoofdtrap en zorg ervoor dat de zilverdraad in de pipetoplossing is ondergedompeld om te voorkomen dat badoplossing de pipet binnendringt.

Gedurende de nadering, gebruik een kleine plastic spuit verbonden met de pipethouder om voorzichtig positieve druk toe te passen. Gebruik vervolgens de micro manipulator om de pipet in het bad te richten. Sluit het elektrische circuit, positioneer het direct boven de cel geselecteerd voor patching.

Let op de oscilloscoop bij het binnengaan in het bad. De weerstand van de pipet moet binnen het optimale bereik liggen terwijl de positie van de pipet visueel in de microscoop wordt bewaakt en zijn weerstand elektrisch op de oscilloscoop wordt bewaakt. Ga door met naderen in kleine stappen totdat de pipet zachtjes op de cel botst.

Het testsignaal zal lichtjes afnemen om een verhoogde weerstand aan te geven. Om een afdichting te vormen, neem de spuit op en breng voorzichtig lichte negatieve druk toe via de laterale buis. Door de zuiger van de spuit te trekken, wordt de vorming van de afdichting aangegeven door een volledige afvlakking van het testgolfvormsignaal op de oscilloscoop.

Op de versterker. Schakel de externe opdrachtegel van testafdichting naar uit. Schakel de spanningshoudende opdracht van uit naar positief en verhoog de versterking van 10 x naar 100 x.

Observeer de oscilloscoop op kanaalactiviteit, die indien aanwezig, zal worden weergegeven als vierkante neerwaartse uitwijkingen van de eerder platte basislijn. Als kanaalactiviteit op de oscilloscoop wordt weergegeven, begint u met het verzamelen van gegevens in het eerder geopende digitale bestand in QUB door op de afspeelknop te drukken, gevolgd door de opnameknop. Om het verzamelen van gegevens te stoppen, drukt u op de stopkn