Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname
June 9th, 2014
Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.
Het algemene doel van deze procedure is om elektrische stroom door een enkele ionenkanaal te meten. Dit wordt bereikt door eerst de ionenkanaal van belang heteroloog te exprimeren in cellen die gemakkelijk te werken zijn en bevorderlijk zijn voor de experimentele doelen. De tweede stap is om een vuur gepolijste pipet te gebruiken om een stabiele afdichting op het celmembraan te verkrijgen.
Vervolgens moet de experimentator het aantal kanalen dat in de patch aanwezig is, bepalen en als het een enkelkanaal betreft, de stroom te registreren, is de laatste stap het verwerken en analyseren van de gegevens. Uiteindelijk wordt het meten van stroom door enkelvoudige ionenkanalen gebruikt om de biofysische eigenschappen waarmee deze membraaneiwitten werken te onderzoeken, wat de basis vormt voor hoe neuronale en andere prikkelbare cellen communiceren. In tegenstelling tot methoden die het mogelijk maken om stromen door meerdere actieve ionenkanalen te meten, is het voordeel van deze benadering dat het meten van stromen door een individueel ionenkanaal je in staat stelt om een breed scala aan responspatronen die inherent zijn aan een bepaald kanaal, te visualiseren en te scheiden.
Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het neurologische veld te beantwoorden, zoals de invloed van fysiologische en therapeutische modulatoren op de communicatie tussen neuronen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze techniek worstelen omdat het moeilijk is om opnamen met laag geluidsniveau te verkrijgen die slechts een enkel ionenkanaal bevatten. Bij een eerste poging van deze methode is het echt nuttig om iemand te zien die het doet omdat om een echt stabiele afdichting te verkrijgen, wat het belangrijkste is in deze methode, je de cel op de juiste hoek voorzichtig moet naderen en het allerbelangrijkste is dat je volhardend moet zijn. Ter voorbereiding op de transfectie.
HEK 2 93 cellen worden een dag van tevoren geplaatst in schalen van 35 millimeter om ze tot 50 tot 60% confluentie te brengen in een steriele buis. Bereid het transfectiemengsel. Voeg een microgram van elk CDNA van belang toe, 315 microliter dubbel gedistilleerd water en 350 microliter van 42 millimolar hepen.
Voeg ten slotte 35 microliter calciumchloride druppelsgewijs toe om het precipitaat te vormen. Vortex de buis gedurende vijf seconden en voeg 175 microliter transfectiesuspensie toe aan elk van de vier schalen. Geplaatst de dag ervoor.
Incubeer de cellen gedurende twee uur op 37 graden Celsius. Na de incubatie, verwijder het medium en was met PBS. Voeg vervolgens twee milliliter groeimedium toe, aangevuld met twee millimolair magnesiumchloride om MDA receptor gemedieerde excitotoxiciteit te voorkomen.
Trek eerst twee symmetrische opnamepijpen uit glassilicaatglas met behulp van een verticaal trekapparaat. Vervolgens is vuur polijsten noodzakelijk om de juiste diameter en weerstand te verkrijgen. Stel vervolgens de opname in door de QUB data acquisitie software te openen en het acquisitievenster te selecteren.
Onder lay-out. Open een nieuw QUB databestand door op nieuwe gegevens te klikken en voer de experimentele parameters in die zullen worden gebruikt. Pas de amplitude schaal aan op 0,1 volt per pico ampère door met de rechtermuisknop op het databestand te klikken, eigenschappen te selecteren en op het datatabblad te klikken.
Na het vervangen van het medium met twee milliliter PBS dat calcium en magnesium bevat, monteer de schotel met cellen op het microscooptafel. Focus op het cellulaire veld met behulp van fasecontrast microscopie om te evalueren dat de cellen gezond zijn en goed in monolaagvorm aan de schotel gehecht zijn. Schakel over naar fluorescentie detectie om te verifiëren dat de transfectie succesvol was.
Stel vervolgens de parameters voor enkelkanaal opname in. Stel de modus in op spanningsklem en toegepaste spanning op plus 100 millivolt met de spanningshoudende opdracht. In de uitstand, selecteer de testknop voor de afdichting op basis van fluorescentie en algehele verschijning.
Kies een cel om te patchen, verifieer onder fasecontrast dat de cel goed aan de schotel is gehecht, een groot deel van het celoppervlak heeft blootgesteld voor patching en verder gezond uitziet. Vul een vers gepolijste pipet met een oplossing geschikt voor NMDA receptoren en cel-aanhechting experimenten en knijp zachtjes om eventuele luchtbelletjes te verwijderen. Bevestig de opnamepipet op de versterkerhoofdtrap en zorg ervoor dat de zilverdraad in de pipetoplossing is ondergedompeld om te voorkomen dat badoplossing de pipet binnendringt.
Gedurende de nadering, gebruik een kleine plastic spuit verbonden met de pipethouder om voorzichtig positieve druk toe te passen. Gebruik vervolgens de micro manipulator om de pipet in het bad te richten. Sluit het elektrische circuit, positioneer het direct boven de cel geselecteerd voor patching.
Let op de oscilloscoop bij het binnengaan in het bad. De weerstand van de pipet moet binnen het optimale bereik liggen terwijl de positie van de pipet visueel in de microscoop wordt bewaakt en zijn weerstand elektrisch op de oscilloscoop wordt bewaakt. Ga door met naderen in kleine stappen totdat de pipet zachtjes op de cel botst.
Het testsignaal zal lichtjes afnemen om een verhoogde weerstand aan te geven. Om een afdichting te vormen, neem de spuit op en breng voorzichtig lichte negatieve druk toe via de laterale buis. Door de zuiger van de spuit te trekken, wordt de vorming van de afdichting aangegeven door een volledige afvlakking van het testgolfvormsignaal op de oscilloscoop.
Op de versterker. Schakel de externe opdrachtegel van testafdichting naar uit. Schakel de spanningshoudende opdracht van uit naar positief en verhoog de versterking van 10 x naar 100 x.
Observeer de oscilloscoop op kanaalactiviteit, die indien aanwezig, zal worden weergegeven als vierkante neerwaartse uitwijkingen van de eerder platte basislijn. Als kanaalactiviteit op de oscilloscoop wordt weergegeven, begint u met het verzamelen van gegevens in het eerder geopende digitale bestand in QUB door op de afspeelknop te drukken, gevolgd door de opnameknop. Om het verzamelen van gegevens te stoppen, drukt u op de stopkn
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het meten van elektrische stroom door een enkel ionenkanaal met behulp van de cell-attached patch-clamp techniek. Deze methode maakt real-time observatie van kanaalconformaties mogelijk, waardoor inzichten worden verkregen in hun biofysische eigenschappen.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
Achtergrond
- Ionenkanalen zijn cruciaal voor cellulaire communicatie.
- Begrip van het gedrag van enkele kanalen helpt bij het verduidelijken van neuronale signalering.
- De cell-attached patch-clamp techniek maakt gedetailleerde stroommetingen mogelijk.
- Opnamen van enkele kanalen kunnen unieke responspatronen van ionenkanalen onthullen.
Doel van het Onderzoek
- Om elektrische stroom door een enkel ionenkanaal te meten.
- Om de biofysische eigenschappen van ionenkanalen te onderzoeken.
- Om het begrip te verbeteren van hoe ionenkanalen bijdragen aan cellulaire communicatie.
Gebruikte Methoden
- Heteroloog uitdrukking van het ionenkanaal in geschikte cellen.
- Gebruik van een vuurgeslepen pipet om een stabiele afdichting op het celmembraan te creëren.
- Bepaling van het aantal kanalen in de patch.
- Opname van stroom door enkele kanalen en daaropvolgende gegevensanalyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle meting van stroom door een enkel ionenkanaal.
- Visualisatie van open-dicht conformaties van kanalen.
- Inzichten in de unieke responspatronen van individuele ionenkanalen.
- Verbeterd begrip van de rol van ionenkanalen in neuronale communicatie.
Conclusies
- De cell-attached patch-clamp techniek is effectief voor het bestuderen van enkele ionenkanalen.
- Deze methode levert waardevolle gegevens op over kanaaleigenschappen in biologische membranen.
- Bevindingen dragen bij aan het bredere begrip van neuronale signaleringsmechanismen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Single-channel electrophysiology provides direct measurement of ion channel biophysical properties, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets in neuroscience and channelopathy drug discovery. By resolving conformational dynamics and gating mechanisms at molecular resolution, this method supports target validation and lead identification through quantitative functional assessment. It enhances predictive confidence in early discovery by distinguishing specific channel modulation from nonspecific effects, informing go/no-go decisions in portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring ligand-induced conformational changes in NMDA and PIEZO1 channels.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of single-channel open-closed kinetics.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating channel-specific responses from cellular background noise.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (HEK293, native neurons) for downstream ligand screening and modulator profiling.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible single-channel recordings with quantifiable conductance and open probability metrics.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by resolving subtype-specific and state-dependent pharmacological profiles.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery findings to disease relevance through native cortical neuron recordings of NMDA receptor activity.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using identical recording parameters across heterologous and native systems.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by defining biophysical benchmarks for lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform assay design and compound characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving ion channel gating mechanisms under physiological and pharmacological conditions.
- Screening: Delivers assay readiness through stable seal formation and low-noise single-channel recording capable of detecting modulator effects.
- Analytics: Generates quantitative measurements (amplitude histograms, open-closed dwell times) enabling objective comparison of test conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via native neuron recordings that mirror heterologous system findings, strengthening target confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform applicable to diverse ion channels (NMDA, PIEZO1) and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct measurement of channel conductance and gating kinetics, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via fire-polished pipette technique and consistent voltage-clamp parameters across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering unambiguous, single-molecule pharmacological profiles that reduce false positives in lead identification.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by defining quantitative biophysical thresholds for channel modulation that inform preclinical advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, patch-clamp technique, and ion channel biology.
- Depends on specialized instrumentation including micromanipulators, amplifiers, and data acquisition software (QUB).
- Necessitates cross-team standardization of seal quality criteria and baseline correction protocols for data comparability.
- Involves adaptation considerations for different cell types (HEK293, primary neurons) and channel types (ligand-gated, mechanosensitive).
- Limited by the technical challenge of achieving stable, high-resistance seals and maintaining low-noise recordings over extended durations.
