Een methode van permeabilisatie van Drosophila Embryo's voor Testen van Small Molecule Activiteit

Het algemene doel van het volgende experiment is het voorbereiden van levensvatbare drosophila-embryo's met een doorlaatbare eierschaal om de bioactiviteit van geïntroduceerde kleine molecuuldrugs of toxines te testen. Dit wordt bereikt door ontwikkelingsstadium embryo's eerst te behandelen met verdunde bleekvloeistof om de buitenste chorion eierschaallagen te verwijderen. De tweede stap is om de embryo's te doorlaatbaar maken met een oplosmiddel dat de dunne wasachtige eierschaallaag verwijdert die kleine molecuulstoffen blokkeert.

De derde stap is om embryo's te behandelen met een drug of toxine en een kleurstof om gelijktijdig de doorlaatbaarheid van de eierschaal te meten en een stof van belang te introduceren. Na verdere ontwikkeling kunnen de embryo's direct worden geïmager of worden verwerkt voor immunohistochemie. Uiteindelijk kunnen de resultaten de activiteit van een drug of toxine op de ontwikkeling van weefsels laten zien, zoals bepaald door fluorescentiemicroscopie met immuno reagentia of vitale kleuren.

Vandaag zal ik onze methode voor het doorlaatbaar maken van drosophila-embryo's presenteren voor assays van kleine molecuulactiviteit. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het gebruik van conventionele organische oplosmiddelen zoals heptaan om doorlaatbaar te maken. De eierschaal is dat ons embryo doorlaatbaar makend oplosmiddel, of EPS, wateroplosbaar en relatief onschadelijk is.

Deze eigenschappen vergemakkelijken embryo-behandelingen waarbij oplosmiddelblootstellingen nauwkeuriger kunnen worden gecontroleerd en kunnen worden uitgevoerd in fysiologisch relevante media, wat beide resulteert in een grotere embryo-levensvatbaarheid. Ik had het idee voor deze methode toen ik nadacht over hoe de wasachtige laag van de eierschaal te verwijderen. Als skiër reflecteerde ik op het gebruik van citrusoplosmiddel om de resterende was van de skibasis te verwijderen.

Dit bracht me ertoe om deze toepassing te vertalen naar de eierschaal van het vlieg-embryo en na enige proef en fout leidde tot de oplossing van de EPS-samenstelling. Bereid bevolkingskooien voor met ten minste 500 paringsleeftijd vliegen van de gewenste stammen. De kooien moeten zijn voorzien van 10 centimeter druivensap. Beluchto met een druppelje gistpasta.

Ververs deze platen twee keer per dag. Na een paar dagen zullen de vliegen zich aanpassen aan de cultuur en regelmatig embryo's leggen. EPS bestaat uit oppervlakteactieve stoffen en beperkende oplosmiddeloplossingen en is goed voor twee maanden.

Wanneer op kamertemperatuur bewaard, verwarm de oppervlakteactieve stoffen tot 37 graden Celsius bij het mengen van vers EPS Voor EPS-behandeling worden embryo's behandeld met manden gemaakt van drie centimeter, dus 50 milliliter polypropyleenbuis en nylon gaas ruw gemaakt. Plastic randen smelten gemakkelijker aan het gaas tijdens latere ontwikkelingsstappen. Embryo's worden ook behandeld met manden gemaakt van de doppen van 50 milliliter buizen.

De dop wordt uitgeboord en gekarteld, en de schroefdraad tussen de dop en de buis bevestigt het gaas. Als alternatief wordt een lokaal gemaakte glijbaankamer gebruikt en voorbereid met een stuk zuurstofdoorlatende. Doe membraan bevestigd over de opening door een borgring om de embryo's te oogsten.

Zet 's ochtends een verse druivenplaat met gistpasta op de cultuur. Na een uur verandert u de plaat en gooit u de eerste verzamelde plaat weg. Laat de tweede plaat twee uur embryo's verzamelen bij 25 graden Celsius.

Verzamel vervolgens de plaat en breng deze over naar 18 graden Celsius. Laat de embryo's ontwikkelen tot het gewenste stadium. Wanneer de embryo's klaar zijn, verwijdert u ze. Voorafgaand aan de EPS-behandeling.

Spoel ze van de plaat in de mash-mand met water en gebruik een penseel. Spoel ze vervolgens in zacht stromend water om eventueel vuil te verwijderen. Ten derde dompelt u ze gedurende twee minuten in 50% bleekmiddel met periodieke circulatie van de bleekvloeistofoplossing.

Spoel ze vervolgens onmiddellijk af met stromend water. Vul nu zes 60 millimeter schotels elk met 10 milliliter PBS om als baden te dienen en maak een verdunning van 1 tot 40 van EPS-voorraad in MBIM, slinger de mix. Er zal een witte emulsie ontstaan, de overtollige vloeistof van de bodem van de mesh-mand afdekken met een doek en dompel de embryo's in de EPS-verdunning met constante slingerbeweging.

Nadat de embryo's 30 seconden in EPS hebben gedraaid, verwijdert u ze en dekt u de overtollige oplossing af. Vervolgens beweegt u de mand tussen de zes PBS-baden en spuit u voorzichtig om te spoelen en gaat u verder met de kleurstof- en drugbehandeling. Het optimaliseren van doorlaatbaarheid en levensvatbaarheid is het lastigste deel van dit protocol.

Doorlaatbaarheid is gevoelig voor het ontwikkelingsstadium van het embryo. De temperatuur waarbij de embryo's worden bewaard en kan ook sterk variëren tussen individuele vliegstammetjes. De beste parameters voor EPS-verdunning en blootstellingstijd moeten empirisch worden bepaald.

Bereid eerst een 50 micromolar-oplossing van sci-fi carboxylaatkleurstof in M-B-I-M-T, één milliliter in een microfichebuis is voldoende. Een toxine of drug kan in dit stadium worden toegevoegd voor acute behandelingen, voor het mengen. Breng de doorlaatbaar gemaakte embryo's van de mand over naar de microfugebuis met een penseel.

Dicht de buis en draai deze enkele keren om. Laad vervolgens de buis op een mutator en laat ze 15 minuten incuberen. Nadat de embryo's zijn bezonken, verwijdert u de kleurstof met een pipet en voegt u één milliliter M-B-I-M-T toe voor een wasbeurt.Resus.

Suspendeer de embryo's, laat ze bezinken en vervang de M-B-I-M-T. Doe dit vervolgens nog een derde en vierde keer. Zodra de vierde wasbeurt is voltooid, verwijdert u al het M-B-I-M-T en verplaatst u de embryo's naar een ontwikkelingsmand voor lange ontwikkelingsperioden.

Voor de on