Name: High-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: Meting van de Receptor Activering via Luciferaseactiviteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer een high-throughput luciferase-assay voor het meten van zoogdieren reukreceptoractivering in H3A-cellen. Deze methode maakt snelle screening van receptor-ligand interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door R01 DC013339, R03 DC011373, en Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. Een deel van het werk werd uitgevoerd met het Monell chemosensory receptor signalering Core, die wordt ondersteund, voor een deel, door financiering van de NIH-NIDCD Core Grant P30 DC011735. De auteurs danken C. Sezille voor hulp bij het verzamelen van gegevens.

1. Culture of Hana3A Cells <ol><li> Bereid M10 media door aanvulling minimum essentieel medium (MEM) met 10% (v / v) FBS. </li><li> Cultuur Onderhoud <ol><li> Handhaaf cellen in M10 media. OPMERKING: De expressievectoren voor RTP1L, RTP2, REEP1 en G αolf verlenen puromycine resistentie tegen Hana3A cellen, maar behoud van de cellen met dit antibioticum heeft geen significante invloed testresultaten. </li><li> Subcultuur in een verhouding van 1:08 in 10 cm schalen om de 2-3 dagen. </li><li> Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li></ol> 2. Plating Cellen voor transfectie <ol><li> Aspireren media uit een 100% confluent 10 cm schotel van Hana3A cellen. </li><li> Was de cellen door toevoeging van 10 ml PBS, wervelen de schotel en opzuigen PBS. </li><li> Voeg 3 ml van 0,05% trypsine / EDTA en wacht tot cellen van elkaar te scheiden (ongeveer 1 minuut). </li><li> Inactiveren trypsine door toevoeging van 5 ml M10 en breken celklonten door fijnwrijven ongeveer 10x &amp;# 160, met een pipet 10 ml. Pipet zorgvuldig te voorkomen dat er luchtbellen in de media. </li><li> Voor elke 96-well plaat, breng 1 ml cellen in een 15 ml conische buis, centrifuge bij 200 xg gedurende 5 minuten, en het supernatans aspireren zonder de celpellet. </li><li> Resuspendeer de cellen in 6 ml M10 per 1 ml cellen overgebracht in stap 2.5. </li><li> Pipetteer 50 ul van cellen aan elk putje van een plaat met 96 putjes en incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol> 3. Transfectie van reukreceptoren <ol><li> Bereiding van plasmide DNA <ol><li> Bereid plasmide DNA via een endotoxinevrij protocol. OPMERKING: Gebruik plasmide-DNA preparaat kits aangeduid &quot;endotoxinevrij&quot; of voeg een fenol-chloroform extractiestap om het plasmide DNA bereiding protocol. </li><li> Verdun DNA tot een concentratie van 100 ng / pl in TE-buffer. </li></ol></li><li> Observeren plated cellen (Stap 2.7) om een ​​juiste confluentie van onderlinge waarborgentely 30-50% per putje en terug te keren naar incubator. Opmerking: deze confluentie niet optimaal is voor de lipide transfectie reagens, een confluentie van 30-50% in deze stap is optimaal voor het meten van luciferase-activiteit 24 uur na transfectie. </li><li> Bereiding van transfectiemengsel <ol><li> Pipetteer RTP1S pCI-, M3-R-pCI, pCRE-luc en pSV40-RL plasmiden in MEM-medium per volumes in tabel 1 bij de plasmide mix maken (volumes opgegeven per 96-well plaat). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> Plasmide mix </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> per putje </td><td> per 96-well plaat </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 pi </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-pCI </td><td> 2,5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> pCRE-luc </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Plasmide mengsel onderdelen. Per putje en per 96-well plaat volumes RTP1S pCI-, M3-R-pCI, pCRE-luc en pSV40-RL en MEM. </li><li> Voor elke 96-well plaat, verdunnen 18 pi lipide transfectiereagens in 450 pi MEM medium. </li><li> Pipetteer Plasmide mix (uit stap 3.3.1), rhodopsine-gelabeld reukreceptor in pCI plasmide (Rho-OR-pCI) en lipide transfectie mix (uit stap 3.3.2) aan het complex opgenomen in maken <strong&gt; Tabel 2. Meng de oplossing door trituratie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Stop de reactie door toevoeging M10 overeenkomstig tabel 2. OPMERKING: deze reactie tijdgevoelige en mag niet te langer duurt dan 30 minuten. De goed + 10% berekening belangrijk voldoende volume vervolgstappen waarborgen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> Complex </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> per putje </td><td> per goed + 10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Plasmide mix </td><td> 4,2 pl </td><td> 4,58 pi </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-OF-pCl </td><td> 0,05 ng </td><td> 0,06 ng </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> Lipide transfectiemengsel </td><td> 4,2 pl </td><td> 4,58 pi </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41,7 ul </td><td> 45.83 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Complex componenten Per putje en per well + 10% volumina plasmide mengsel (tabel 1), reukreceptor plasmide (Rho-OR-pCI) en lipide transfectie mix.. M10 wordt toegevoegd aan de reactie na 15 min incubatie bij kamertemperatuur doven. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Kraan uit de media op de cel platen. </li><li> Pipetteer 50 ul van complex aan elk putje en incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol> 4. Geur Stimulatie <ol><li> Let op de getransfecteerde cellen om een ​​goede confluentie van 50-80% per goed verzekeren en terug te keren naar incubator. OPMERKING: Als de cellen minder dan 50% Confluent, vuurvlieg luciferase en Renilla luciferase waarden te laag zijn voor het meten van receptoractivering. Overweeg gooi de plaat. </li><li> Bereid 1 M voorraad oplossingen van elke geur in DMSO. </li><li> Bereid geur stimulatie oplossingen CD293 medium. <ol><li> Voor screening experimenten, verdunnen voorraad oplossing van geur tot 100 uM. Ook de voorbereiding van een no-geurbestrijding (CD293 alleen) om te controleren voor OR achtergrond activering. OPMERKING: Voor screening experimenten, elk OR / geur paar is getest slechts eenmaal per experiment. Omdat sommige geur diffusie over putten mogelijk is, is het raadzaam om te stimuleren met een geurstof voor elke plaat. </li><li> Voor dosis-respons experimenten bereiden zeven 10-voudige seriële verdunningen van geur voorraadoplossing in drievoud vanaf 1 mM voor elke receptor. Bereiden ook dezelfde geur verdunningen in drievoud voor lege-vector getransfecteerde cellen om te controleren voor geur achtergrond activatie. OPMERKING: Voor dosis-respons experimenten, elk odor concentratie behandeling moet worden uitgevoerd in drievoud. </li></ol></li><li> Kraan uit de media op de cel platen. </li><li> Pipetteer 25 ul van geur stimulatie oplossing in elk putje en incubeer gedurende 4 uur. </li></ol> 5. Meten of activiteit via Luciferase Assay <ol><li> Resuspendeer vuurvlieg luciferase substraat volgens de instructies van de fabrikant en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Ontdooi 1 ml vuurvlieg luciferase substraat per 96-well plaat. </li><li> Bereid deze vuurvlieg luciferase reactie quencher en Renilla luciferase substraat reagens (5 ul luciferase quencher / Renilla luciferase substraat per 1 ml buffer). Opmerking: Ongeveer 1 ml reagens nodig per 96-well plaat. </li><li> Bereid de lichtgevende microplaatlezer. Open de microplaatlezer software. Binnen het pictogram systeem: <ol><li> Onder de &quot;Pre-verwarming&quot; Tab, vinkt u het vakje voor &quot;ON&quot; en stel de temperatuur van de machine tot 25 °; C. </li><li> Onder het tabblad &quot;Dispenser&quot;, prime elk dispenser met 1000 pi van 70% ethanol, gevolgd door 1000 pi gedestilleerd water. OPMERKING: Gebruik afzonderlijke porties van alcohol en water voor iedere dispenser. Ethanol wordt gebruikt om de dispensers desinfecteren en water verwijdert de resterende ethanol. </li><li> Prime elk dispenser met 1500 pi lucht (verwijder dispensers van vloeistof). OPMERKING: het ontluchten zorgt ervoor dat luciferase substraten niet worden verdund met restwater. </li><li> Prime dispenser 1 met 1080 pi vuurvliegluciferase substraat (uit stap 5.2). Prime dispenser 2 met Renilla luciferase substraat (uit stap 5.3). LET OP: Wees voorzichtig niet te cross-besmetten het luciferase substraten. Primeren met luciferase substraten vult de dode ruimte in het reagens dispensers. </li></ol></li><li> Stel de volgende protocol om zowel vuurvlieg en Renilla luciferase luminescentie lezen. Binnen de software in verband met de microplaatlezer, under het menu &quot;Bestand&quot;, klik op &quot;Nieuwe taak&quot;. Markeer &quot;Protocols&quot; en klik op &quot;Create New&quot;. In het volgende venster, moet de cirkel naast &quot;standaard protocol&quot; worden geselecteerd. Klik op &quot;OK.&quot; Dubbelklik op &quot;uitvoeren&quot; op de linkerkant van het scherm. <ol><li> Doseer 10 pl vuurvliegluciferase substraat aan alle putjes met behulp dispenser 1. Onder het menu &quot;Acties&quot;, klik op &quot;Dispense&quot;. In het venster &quot;Verdeel Step&quot;, stelt: &quot;Dispenser&quot; naar 1, &quot;Priming&quot; voor niemand, &quot;Doseer Volume&quot; naar 10 pl en &quot;Rate&quot; tot 225 ul / sec. Klik op &quot;OK&quot;. </li><li> Schud de plaat gedurende 30 sec. Onder het menu &quot;Acties&quot;, klik op &quot;Shake&quot;. In het venster &quot;Shake Step&quot;, stelt u &quot;Intensity&quot; naar Medium en &#39;Duur&#39; om 00:30 MM: SS. Klik op &quot;OK&quot;. </li><li> Lees de luminescentie van alle putjes voor 0,5 sec per goed. Onder het menu &quot;Acties&quot;, klik op &quot;Lees&quot;;. In het venster &quot;Lees Step&quot;, stelt: &quot;Detection Method&quot; om Luminescentie, &quot;Lees Type&quot; naar Endpoint, &quot;Integratie tijd&quot; om 00:00:50 MM: SS: ss, &quot;Sets Filter&quot; op 1, &quot;Emissie&quot; Hole, &quot;Optics Position&quot; naar boven, &quot;Gain&quot; naar 135, en &quot;Lees Hoogte&quot; tot 1,00 mm. Klik op &quot;OK&quot;. </li><li> Doseer 10 pl Renilla luciferasesubstraat aan alle putjes met behulp verdeler 2. Stel de voorwaarden zoals in stap 5.6.1, behalve set &quot;Dispenser&quot; naar 2. </li><li> Schud plaat gedurende 30 sec. Stel de voorwaarden zoals in stap 5.6.2. </li><li> Lees luminescentie van alle putjes voor 0,5 sec per goed. Stel de voorwaarden zoals in stap 5.6.3. </li></ol></li><li> Verwijder het deksel van de 96-well plaat en plaats de plaat in de microplaat lezer. Start de set-up in stap 5.5 tot plaat luminescentie lezen programma. </li><li> Reinig het reagens dispenser pompen. Via het pictogram systeem onder de tab &quot;Dispenser&quot;: <ol><li> Zuiver 1.000 III firefly luciferasesubstraat van de vuurvliegluciferase dispenser in een herstel buis. OPMERKING: Firefly luciferase kan worden opgeslagen bij -80 ° C en hergebruikt. </li><li> Prime elke dispenser met 1000 pi gedestilleerd water, gevolgd door 1000 ui 70% ethanol en uiteindelijk 1500 ui lucht (verwijder dispensers vloeistof). OPMERKING: Water verwijdert luciferase substraten van het reagens pompen, ethanol desinfecteert en lucht droogt eventueel resterende ethanol. </li></ol></li></ol> 6. Data Analysis <ol><li> Gegevens exporteren <ol><li> In de microplaatlezer software, dubbelklik op &quot;Rapport / Export bouwers &#39;aan de linkerkant van het scherm. </li><li> Klik op de knop &quot;Nieuw Exporteren naar Excel&quot; en klik op &quot;OK&quot;. </li><li> Markeer EXPORT1 en klik op &quot;Bewerken&quot;. <ol><li> Onder &quot;Content&quot; check &quot;System Beschrijving&quot;, &quot;procedure&quot;, &quot;Plate Beschrijving&quot; en &quot;plaatindeling Matrix&quot;. Zijn &quot;Raw data&quot; eennd &quot;Berekend gegevens&quot;. </li><li> Onder &quot;Workflow&quot;, vink &quot;Autoexecute na afloop van de procedure&quot;. Onder Export Mode, vink &quot;Alle platen in dezelfde werkmap&quot; en &quot;Als een nieuw werkblad&quot;. </li><li> Onder &quot;Bestand&quot; kiezen bestandsnaam formaat en file locatie en klik op &quot;OK&quot;. </li><li> Sluit het venster &quot;Rapport / Export Builders&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Genormaliseerde luciferase waarden te komen, verdeel de vuurvliegluciferase luminescentie lectuur voor elk putje (stap 5.6.3) door de Renilla luminescentie lectuur voor elk putje (stap 5.6.6). </li></ol>

<ol><li>Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+a+human+olfactory+receptor+functionally+expressed+in+human+embryonic+kidney+293+cells+and+Xenopus+Laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).</li>
<li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+testicular+odorant+receptor+mediating+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis.</a> Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).</li>
<li>Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+odorant+specificity+of+two+human+olfactory+receptors+from+different+phylogenetic+classes+and+evidence+for+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism.</a> Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Matarazzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+two+human+olfactory+receptors+expressed+in+the+baculovirus+Sf9+insect+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system.</a> Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).</li>
<li>Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+extended+receptive+ligand+repertoire+of+the+human+olfactory+receptor+OR17-40+comprising+structurally+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds.</a> Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+heat+shock+protein+enhances+the+expression+of+mammalian+olfactory+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins.</a> Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).</li>
<li>Shirokova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+ligands+for+orphan+olfactory+receptors.+G+protein-dependent+agonism+and+antagonism+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants.</a> The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).</li>
<li>Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+a+human+odorant+receptor+alters+odour+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception.</a> Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).</li>
<li>Menashe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elucidation+of+human+hyperosmia+to+isovaleric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid.</a> PLoS biology. 5 (11), (2007).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Science signaling. 2 (60), (2009).</li>
<li>Jaeger, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mendelian+Trait+for+Olfactory+Sensitivity+Affects+Odor+Experience+and+Food+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection.</a> Current Biology. 23, 1-5 (2013).</li>
<li>DeMaria, S., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of smell.</a> The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+nauroscience%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+olfactory+receptor+%28OR%29+gene+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily.</a> Human Genomics. 3 (1), 87(2008).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an odorant receptor.</a> Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+a+broad+but+selective+ligand+spectrum+of+a+mouse+olfactory+receptor%3A+mapping+the+odorant-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+Reticulum+Retention%2C+Degradation%2C+and+Aggregation+of+Olfactory+G-Protein+Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Molecular+brain+research%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Expression+of+a+Mammalian+Odorant+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li>
<li>Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Ligands+for+Olfactory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Ligands for Olfactory Receptors.</a> Cell. 95, 917-926 (1998).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Science signaling. 4 (155), (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metric+for+odorant+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A metric for odorant comparison.</a> Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).</li>
<li>Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Receptors%3A+From+basic+science+to+applications+in+flavors+and+fragrances%5BTitle%5D)+AND+%22Perfumer+and+Flavorist%22%5BJournal%5D)">Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances.</a> Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+map+in+the+mouse+olfactory+bulb%3A+in+vivo+sensitivity+and+specificity+of+receptor-defined+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli.</a> Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).</li>
<li>Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+odorant+receptor+OR2J3+is+associated+with+the+ability+to+detect+the+%26%2334%3Bgrassy%26%2334%3B+smelling+odor%2C+cis-3-hexen-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the &#34;grassy&#34; smelling odor, cis-3-hexen-1-ol.</a> Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).</li>
<li>Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evolution+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Functional evolution of mammalian odorant receptors.</a> PLoS genetics. 8 (7), (2012).</li>
<li>Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li>
<li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li>
<li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li>
<li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+ROC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition+Letters%22%5BJournal%5D)">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li>
<li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Olfactory+Recept.+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li>
<li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Geurstof identiteit wordt gecodeerd door reukreceptor activeringspatronen, maar receptoractivering patronen, waaronder die receptoren geactiveerd en in welke mate, zijn bekend om minder dan 6% van de menselijke olfactorische receptoren 1-11. Pogingen om reukreceptoren karakteriseren zijn beperkt door hun arbeidsintensief en toepasbaarheid slechts een subset van de olfactorische receptorfamilie 17,23,24,33,34. De Hana3A heterologe expressie ondersteunt de robuuste expressie van de meeste geteste reu...

De zoogdieren olfactorische systeem heeft de mogelijkheid om te reageren op een groot aantal geurende stimuli, waardoor de detectie en discriminatie van duizenden geurstoffen. Reukreceptoren (UPR) zijn de moleculaire sensoren door de olfactorische sensorische neuronen in de olfactorische epitheel 12 uitgedrukt. Zoogdieren geur herkenning gebeurt door verschil in activatie van de UPR door geurstoffen en de OR gen-familie is uitgebreid met zo&#39;n 1.000 muizen en 400 menselijke receptoren 12-16. Vorige functionele analyses van de UPR in olfactorische neuronen en in heterologe cellen hebben aangetoond dat verschillende geurstoffen worden herkend door unieke, maar overlappende ensembles van UPR 10,17-20. Bijpassende liganden voor de UPR is van cruciaal belang voor het begrijpen van de olfactorische code en essentieel voor het opbouwen van levensvatbare modellen van de reukzin. Vanwege problemen uiten UPR in heterologe systemen evenals het grote aantal van zowel geurstoffen en ultraperifere regio&#39;s heeft deze gegevens grotendeels afwezig van de f geweestield; inderdaad, minder dan 6% van de menselijke UPR een bekend ligand 1-11. Dit protocol beschrijft het gebruik van een luciferase assay geurstof / of interacties te karakteriseren. Deze test kan de hoge-doorvoer analyse van de UPR, een taak die essentieel is voor het begrijpen van geurstof / of interacties, evenals het ontwikkelen van een model van geur codering. High-throughput studies van de UPR geconfronteerd drie grote uitdagingen. Eerst UPR expressie in heterologe cellen werden vastgehouden in het ER en vervolgens afgebroken in het proteasoom 21,22, waardoor de UPR interageren met geurstoffen in het testsysteem 23-25. Dit probleem is aangepakt door de ontdekking van accessoire eiwitten die stabiele celoppervlak-expressie van een groot aantal UPR 19,26,27 vergemakkelijken. Receptor-transporter-eiwit 1 en 2 (RTP1 en 2) bevorderen of celoppervlak expressie en activering in respons op stimulatie geurstof 19. Op basis van dit werk, HEK293T cellengemodificeerd om stabiel tot expressie RTP1 lang (RTP1L) en RTP2, receptor-expressieversterkende eiwit 1 en G αolf, waardoor de Hana3A cellijn 19,27. Bovendien, het type 3 muscarine acetylcholine receptor (M3-R) samenwerkt met OR&#39;s op het celoppervlak en verbetert activering in reactie op geurstoffen 26. Co-transfectie van een OR met RTP1S en M3-R in Hana3A cellen resulteert in een robuuste, consistente en functionele expressie van een brede waaier van UR op het celoppervlak 27. Ten tweede, zoogdier of repertoires vrij groot. Bij de mens, bijvoorbeeld de OR repertoire is een orde van grootte talrijker dan de smaak receptor repertoire, en 2 ordes van grootte talrijker dan de visuele receptor repertoire. Hoewel het klonen van een OR is een relatief eenvoudig protocol, wordt belangrijke up-front inspanning die nodig is om een ​​uitgebreide bibliotheek te genereren. Ten derde, hoewel we weten dat in de visie, golflengte vertaalt in kleur enin auditie frequentie vertaalt in toonhoogte, wordt de organisatie van geuren slecht begrepen, waardoor het moeilijk voor onderzoekers om interpoleren uit een representatieve steekproef van geurstoffen. Hoewel enige vooruitgang is geboekt op dit front 10,28, de kaart van de olfactorische landschap nog steeds niet voltooid. Screening tienduizenden moleculen tegen honderden UPR is een moeilijke taak; high-throughput-schermen op dit gebied vereisen zorgvuldig gedefinieerd campagnes. De belangrijkste overblijvende uitdagingen die logistiek en kosten dan problemen verbonden wat de techniek. Hoewel heterologe screening is niet op grote schaal gebruikt om liganden te identificeren door academische groepen, is een particuliere onderneming dezelfde techniek gebruikt om liganden te identificeren voor 100 menselijke UPR 29. Helaas, deze gegevens blijven eigendom. De high-throughput luciferasetest hier geschetst heeft een aantal voordelen ten opzichte van alternatieve methoden die worden gebruikt om te beoordelen of activering. Hoewel de verantwoordelijkheidses van inheemse olfactorische sensorische neuronen zijn gemeten met behulp van elektrofysiologie en calcium beeldvorming, deze technieken hebben moeite plagen elkaar, die of dat leidt tot de reactie van een neuron als gevolg van de overlap in reactie woningen te reukneuronen. Hoewel kloppen in een GFP-gelabeld receptortype 30,31, levert specifieke receptoren via adenovirus reukneuronen muriene 32,33, of het uitvoeren van RT-PCR na opname 17,24,33 kunnen opnamen koppelen aan enkele soorten receptoren zijn deze werkwijzen low-throughput en niet geschikt voor grootschalige schermen. Heterologe screening systemen zijn schaalbaar, en twee belangrijke vormen zijn te vinden in de literatuur: cAMP pathway verslaggevers en inositol trifosfaat (IP3) route verslaggevers. Bij geur stimulatie, UPR activeren G αolf transductie signalerende cascade die leidt tot de productie van cyclisch AMP (cAMP) 12. Door co-transfectie van een vuurvlieg luciferase reportergen onder controle van acAMP respons elementen (CRE), kan luciferase productie worden gemeten als functie van geur respons, waardoor de kwantificering van of activering. OR activering kan ook worden gekoppeld aan de IP3 pad door co-expressie G-eiwitten zoals G α15/16 of G α15-OLF chimeer 24,25,34. We hebben de test hier gepresenteerde gebaseerd op drie factoren gekozen: (1) de co-expressie van RTP1 met Rho-tagged reukreceptoren verbetert de expressie van olfactorische receptoren op het celoppervlak 19,27; (2) gebruik van een cAMP-responsieve reporter gen maakt voor het meten van of activering via canonieke tweede boodschapperpad; en (3) test is zeer geschikt voor high-throughput screens. Deze high-throughput luciferase assay is voor verschillende studies waardevol voor het gebied van reukzin. Ten eerste kan een groot aantal UPR afgeschermd van een geurstof om de receptoractivering patroon voor een sp bepalenecifieke geurstof. Dit type van studie identificeerde OR7D4 als OR verantwoordelijk voor het reageren op de steroïde geurstof androstenon 8. Omgekeerd kan een of afgeschermd van een panel van geurstoffen teneinde de receptor responsprofiel 10 bepalen. Als kandidaat olfactorische reukstof / OF paren geïdentificeerd via deze schermen kan de interactie worden bevestigd door het uitvoeren van een dosis-respons-experiment onderzoekt de respons van de OF toenemende concentraties van geurstof. Dosisresponscurven kan ook beoordelen hoe genetische variatie in een OR invloed in vitro geurstof reactie 8,9,11,35, en deze studies kan worden uitgebreid tot interspecifieke OF variatie, waardoor het onderzoek van receptor evolutie tussen soorten en causale mutaties in de evolutie 36,37, tenslotte deze test kan worden gebruikt om te screenen op antagonisten die geur kunnen tegenwerken of reactie op een bepaalde geurstof voor een bekende geurstof / receptor paar 38,39 zijn. Samengevat, deze hogeThroughput luciferase assay is toepasbaar op een reeks studies die zullen helpen karakteriseren of activeringspatronen en een beter begrip van geur codering in het olfactorische systeem.

<table><tbody><tr><td>Hana3A cellen</td><td>Beschikbaar bij het Matsunami Laboratorium op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTP1S-pCI</td><td>Beschikbaar bij het Matsunami Laboratorium op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M3-R-pCI</td><td>Beschikbaar bij het Matsunami Laboratorium op aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCRE-luc</td><td>Agilent</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td></tr><tr><td>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=nl&amp;region=NL">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (zonder Ca2+ en Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td><a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>Trypsine (0,05% Trypsine EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25300</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product">Trypsine</a></td></tr><tr><td>CD293</td><td>Life Technologies</td><td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019?ICID=search-11913019">CD293</a></td></tr><tr><td>96-well PDL wit/heldere plaat</td><td>BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td></tr><tr><td>Lipide transfectiereagens: Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019?ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td></tr><tr><td>Firefly luciferase substraat, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substraat: Dual-Glo Assay</td><td>Promega</td><td>E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&amp;__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&amp;__utmx=-&amp;__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td></tr><tr><td>Synergy S2&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td></tr><tr><td>Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software</td><td>BioTek</td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td>BIOSTACK</td><td>BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>Multiflo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956;l GripTips</td><td>Integra</td><td>4433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>12,5 &#956;l GripTips</td><td>Integra</td><td>4414</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>300 &#956;l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>12,5 &#956;l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=nl&amp;region=NL">DMSO</a></td></tr><tr><td>Forskoline</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010</td><td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td></tr></tbody></table>

high-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: meting van de receptor activering via luciferaseactiviteit

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Geurstoffen creëren unieke en overlappende patronen van olfactorische receptor activering, zodat een familie van ongeveer 1.000 muizen en 400 menselijke receptoren tot duizenden geurstoffen herkennen. Odorant liganden verschenen voor minder dan 6% van de humane receptoren 1-11. Dit gebrek aan gegevens is deels te wijten aan moeilijkheden functioneel uiten van deze receptoren in heterologe systemen. Hier beschrijven we een werkwijze voor het uitdrukken van de meerderheid van de olfactorische receptor familie in Hana3A cellen, gevolgd door een hoge-doorvoer beoordeling van olfactorische receptoractivering met een luciferase reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om (1) scherm panelen geurstoffen tegen panelen reukreceptoren; (2) bevestigen geurstof / receptor interactie via dosisresponscurven; en (3) vergelijken met receptor activering niveaus onder receptor varianten. In ons voorbeeld, werden 328 reukreceptoren gescreend tegen 26 geurstoffen. Geurstof / receptor paren met verschillende respons scores waren selectieted en getest dosisrespons. Deze gegevens geven aan dat een scherm is een effectieve methode om verrijken geurstof / receptor paren die een dosis respons experiment passen, namelijk receptoren die een bona fide reactie op een geurstof hebben. Daarom is deze hoog-luciferase assay is een effectieve methode om reukreceptoren-een essentiële stap naar een model van geur codering in het zoogdier olfactorische systeem karakteriseren.

Een primaire scherm getest 328 UPR tegen 26 geuren bij een concentratie van 100 uM. Deze geur concentratie is aangetoond effectief activeren een groot deel van UR met bekende liganden 10. Eerst werd genormaliseerd luciferase-activiteit berekend door het vuurvliegluciferase lezing door het Renilla luciferase lezen verdelen. Vervolgens werden baseline waarden berekend door de luciferase genormaliseerde waarden voor de niet geurbestrijding het luciferase genormaliseerde waarden voor elk putje (F...

Olfactorische receptor activering patronen coderen geur identiteit, maar het gebrek aan gepubliceerde gegevens identificeren geurstof liganden voor zoogdieren reukreceptoren belemmert de ontwikkeling van een alomvattend model van geur codering. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor zeer snelle identificatie van olfactorische receptor liganden en kwantificering van receptoractivering vergemakkelijken.

High-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: Meting van de Receptor Activering via Luciferaseactiviteit

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een hoogdoorvoermeting uit te voeren van reukreceptoractivering via een luciferase-assay. Dit wordt bereikt door H drie A-cellen te transfecteren met vectoren die accessoire-eiwitten, vuurvlieg- en vanille-luciferase en reukreceptoren bevatten om een andere reukreceptor tot expressie te brengen. In elke put van een 96-wellsplaat.Als tweede stap worden de cellen gestimuleerd met geuren. Vervolgens wordt luciferase-substraat toegevoegd, waardoor de cellen die het luciferase-enzym produceren, gaan luminesceren en dus fungeren als een reporter voor reukreceptoractivering. Uiteindelijk laten de resultaten de reacties van de populatie reukreceptoren op de geuren zien op basis van de luminescentie van elke put in de plaat.De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals adenoviraal, transductie van inheemse neuronen of calciumbeeldvorming, is dat deze techniek zowel schaalt naar hoge doorvoerscreenings als dat deze de inheemse CM-gemedieerde tweede boodschapperroute gebruikt om reukreceptoractivering te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van reukzin, zoals het matchen van reukliganders, dus reukreceptoren, en het onderzoeken van het effect van genetische variatie op reukreceptoractivering. De Hanna drie A-cellen die in dit protocol worden gebruikt, worden gehouden in M 10-media bij 37 graden Celsius met 5% CO2, en moeten 100% confluent zijn om cellen voor transfectie te beplaten. Aspirateer media van een 10 centimeter schaal met cellen, was de cellen.Door 10 milliliter PBS toe te voegen, de schaal te laten draaien en de PBS af te zuigen, voegt u drie milliliter 0,05% tripsine EDTA toe en wacht u ongeveer een minuut tot de cellen bij kamertemperatuur zijn losgekomen. Deactiveer trypsine door vijf milliliter M 10-media toe te voegen, breek de celklompjes op door ongeveer tien keer met een 10 milliliter pipet te trireren. Pipetteer voorzichtig om te voorkomen dat luchtbellen in het medium terechtkomen.Voor elke 96-wellsplaat brengt u één milliliter cellen over in een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 keer de zwaartekracht en zuig de supernatant af zonder het celpelletje te verstoren. Suspendeer de cellen in 12 milliliter M 10, pipet 50 microliter cellen in elke put van de 96-wellsplaat en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius met 5% CO2.Voordat u met deze procedure begint, observeert u de cellen die de vorige dag zijn beplaat om een goede confluëntie van ongeveer 30 tot 50% per put te garanderen. Breng de schalen terug in de incubator en ga door. Om de transfectie voor te bereiden, mengt u de plasmiden voor het tot expressie brengen van accessoire-eiwitten.Vuurvlieg-luciferase en ran vanille-luciferase zijn elk verdund tot een concentratie van 100 nanogram per microliter in TE-buffer om het plasmidemix te maken. Pipet de plasmiden in mem-medium volgens de volumes die in deze tabel zijn aangegeven. Voor elke 96-wellsplaat verdunt u 18 microliter lipide transfectie-reagens in 450 microliter mem-medium om de lipide transfectiemix te maken. Pipet vervolgens het plasmide.Meng het plasmide met het opsine-gelabelde reukreceptor en de lipide transfectiemix in een schone MICROTITER-plaat. Om het complex te maken dat in deze tabel is beschreven, is de berekening van de put plus 10% belangrijk om voldoende volume te garanderen voor de volgende stappen. Meng de oplossing door tricuratie en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Stop de reactie door M 10 toe te voegen volgens de tabel. Voor het succes van deze procedure is het belangrijk dat cellen nooit langer dan twee minuten zonder media worden gelaten. Terwijl de oplossingen in de putten worden toegevoegd.Verwijder de cellen uit de incubator en draai de cellenplaat om en klop het medium uit de cellenplaten. Pipet 50 microliter complex in elke put en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius met 5% CO2 op de dag na transfectie van reukreceptoren. Observeer de getransfecteerde cellen om een goede confluëntie van 50 tot 80% per put te garanderen. Breng de cellen terug in de incubator. Het reukmiddel is verdund tot een stockconcentratie van één molair en DMSO voor screeningsexperimenten. Verdun elke stockoplossing van reuk tot 100 micromolair.Bereidt bovendien een controle zonder geur voor die alleen CD 2 93-medium bevat om te controleren op achtergrondactivering van reukreceptoren. Verwijder de cellen uit de incubator en klop het medium uit de cellenplaten. Pipet 25 microliter oplossing voor reukstimulatie in elke put en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% CO2 gedurende vier uur.Begin met deze procedure. Ontdooi één milliliter vuurvlieg-luciferase-substraat per 96. Welpenplaat. Bereid vers vuurvlieg-luciferase-reactie-quencher en ran vanille-luciferase-substraatreagens voor.Ongeveer één milliliter reagens is nodig per 96-welpplaat. Bereid vervolgens de luminescente microplaatlezer voor binnen het systeempictogram onder het tabblad voorverwarming. Vink het vakje aan voor ingeschakeld en stel de temperatuur van de machine in op 25 graden Celsius onder het tabblad dispenser.Primer elke dispenser met 1000 microliter 70% ethanol, gevolgd door 1000 microliter gedistilleerd water. Gebruik aparte aliquotten alcohol en water voor elke dispenser. Prime elke dispenser met 1. 500 microliter lucht prime dispenser.Een met 1080 microliter vuurvlieg-luciferase-substraat prime dispenser. Twee met ranil-luciferase-substraat. Wees voorzichtig om de luciferase-substraten niet te kruisbesmetten.Stel het volgende protocol in om de luminescentie van vuurvlieg-luciferase en vanille-luciferase te lezen binnen de software. Onder het menu Bestand. Klik op nieuwe taak, markeer protocollen en klik op nieuw maken.In het volgende venster moet het cirkeltje naast standaardprotocol worden geselecteerd. Klik op oké. Dubbelklik op procedure.Aan de linkerkant van het scherm pipet

high-throughput-analysis-mammalian-olfactory-receptors-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Hier laten we zien een protocol voor het uitvoeren van live cell vlekken die kunnen worden gebruikt om de geurstof receptoren gemakkelijk te detecteren op het oppervlak van HEK293T cellen. Daarnaast kan het ook worden gebruikt om de analyse voor oppervlakte-expressie van andere chemosensory receptoren of GPCR's.

Het testen van oppervlakte-expressie van receptoren Chemosensory in heterologe cellen

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

This video demonstrates the protocol for measuring odorant receptor activation in transfected cells using a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor and luminescence detection. The method is applied to study receptor-ligand interactions and signaling pathways in olfactory neurons.

Measuring Odorant Receptor Activation using a Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay

Source: de March, C. A. et. al., Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the method to monitor the real-time activation of odorant receptors in recombinant mammalian cells using luminescence measurement. Odorant binding triggers G-protein activation and cAMP production, activating glosensor proteins that emit luminescence upon substrate binding, providing a quantitative measure of receptor response.

Real-Time Monitoring of Odorant Receptor Activation in Recombinant Cells

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Karakterisering van de functie van odorant receptoren serveert een onmisbaar onderdeel in het proces van deorphanization. Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van odorant receptoren in real time via een kamp assay.

Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

Fysiologisch, worden odorant receptoren geactiveerd door odorant moleculen in de fase van de damp ingeademd. Echter, meest in vitro systemen gebruiken vloeibare fase odorant stimulatie. Hier presenteren we een methode waarmee in vitro bewaking in real-time van odorant receptor activering op odorant stimulatie in damp fase.

Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

Leer een high-throughput luciferase-assay voor het meten van zoogdieren reukreceptoractivering in H3A-cellen. Deze methode maakt snelle screening van receptor-ligand interacties mogelijk.

High-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: Meting van de Receptor Activering via Luciferaseactiviteit

Meer video's verkennen