Een Ex vivo Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

Het algemene doel van deze procedure is om een ex vivo-cultuur, muis, embryonale schildklierimplantaten of lobben te disseceren om de studie van morfogenetische en differentiatiegebeurtenissen tijdens de schildklierontwikkeling mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de bovenste kaak en het onderste deel van het lichaam van embryonale dag te verwijderen. E 12,5 tot E 14,5 muis embryo's om het nekgebied van de embryo's te isoleren.

In de tweede stap worden de neurale buis, laterale weefsels en tong verwijderd om het bovenste deel van de luchtpijp en slokdarm bloot te leggen. Vervolgens worden de schildklierknobbels, gebieden of lobben verder gereinigd van eventuele ongewenste weefsels. In de laatste stap worden de schildklierimplantaten geplaatst voor cultuur op een gecoate microput of op een filter.

Uiteindelijk kan time-lapse beeldvorming, immunokleuring of genexpressieanalyse worden uitgevoerd om de epitheliale morfogenese driedimensionale organisatie en follikels, vascularisatie van de implantaten of schildklierstamceldifferentiatie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke ontwikkelings- en differentiatievragen over de organisatie van schildklierepitheelcellen in 3D, lumenvorming, celdifferentiatie, polarisatie en groei.

Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door Fidel Marcel, een afgestudeerde student, en Myla LaCorte, een postdoc, beide uit mijn laboratorium. Onder steriele omstandigheden in de laminaire stroomkap. Twee uur voorafgaand aan de isolatie van het schildklierweefsel verdunt steriele Type één collageen tot een 50 microgram per milliliter. De uiteindelijke concentratie in 10 millimolair waterstofchloride en plaats het collageen op ijs.

Bedek vervolgens elk van de putjes van een plastic kweekkamer met 200 microliter van het verdunde collageen en incubeer de kamer op kamertemperatuur. Na twee uur aspireer het collageen. Spoel de putjes af met M1 99-medium en voeg een minimaal volume van 200 microliter kweekmedium toe aan elk. Plaats de gecoate kamers in de incubator en ga vervolgens door met de schildkliersnede.

Plaats eerst de gedissekteerde baarmoeder in een 10 centimeter plaat met HBSS. Gebruik vervolgens een pincet om een uiteinde van de baarmoeder vast te houden en open vervolgens de baarmoeder met kleine schaar om achtereenvolgens elk van de embryo's te bevrijden. Gebruik de schaar om de embryo's van de placenta te scheiden en breng vervolgens de embryo's met hun extra embryonale membranen over in een nieuwe 10 centimeter plaat met vers HBSS.

Ga vervolgens door met de dissectie onder een stereomicroscoop voor elk embryo. Verwijder eerst de dooierzak en de amnion. Houd vervolgens wolfraamnaalden in glazen capillairen als mes en vork.

Verwijder het bovenste deel van het hoofd, inclusief de bovenkaak en de oren. Houd het embryo op zijn rug. Verwijder vervolgens een extra stuk van de neurale buis en verwijder daarna het onderste deel van het embryo net onder de voorste ledematen en boven het hart.

Om het weefsel te oriënteren, brengt u de embryo-snede met de tong in het nekgebied over in een nieuwe 10 centimeter plaat met vers HBSS en verwijder de neurale buis en weefsels achter de slokdarm en luchtpijp. Snijd vervolgens voorzichtig de weefselsnede langs beide zijden van de tong. Lokaliseer vervolgens de slokdarm en luchtpijp, snij de tong weg en laat de retinoïde zwelling en het weefsel aan beide zijden van de slokdarm en luchtpijp over.

Na het verwijderen van de tong, snij de slokdarm weg en plaats de luchtpijp met de ventrale zijde naar boven. Snijd vervolgens ongewenste weefsels zoals de thymus en alle weefsels lateraal aan de faryngealeboogaanslagen weg. Bepaal vervolgens voor de E 13,5 of E 14,5 embryo's de schildklierlobben aan beide zijden van de luchtpijp en snij de lobben verder weg van de luchtpijp.

Voor E 12,5 embryo's kan de dissectie worden uitgevoerd zoals zojuist is gedemonstreerd tot na het uitnemen van de tong en slokdarm. Vervolgens, na het lokaliseren van de faryngealeboogaanslagen, verwijder alle laterale weefsels zoals voor E 13,5 tot 14,5 embryo's. Gebruik tenslotte een voorbevochtigde filtertip op een P 200 micropipet om het geïsoleerde weefsel over te brengen in een 35 millimeter kweekplaat met voorgewarmd kweekmedium.

Voor het plaatsen van de E 13,5 tot E 14,5 schildklier X-explan. Was eerst het weefsel door opeenvolgende overdracht in drie putjes van een 24-putjesplaat met één milliliter voorgewarmd kweekmedium om de lobben op de voorgecoate kamers te plaatsen. Aaspibeer het kweekmedium en gebruik een micropipet met gefilterde tips om voorzichtig één schildklierknobbel in elk van de kweekkamers te plaatsen.

Verwijder eventueel overtollig medium en plaats vervolgens de kweekkamer in een weefselkweekincubator om de explanten aan de matrix te laten hechten. Voeg vervolgens na twee uur voorzichtig 200 tot 300 microliter voorgewarmd kweekmedium toe aan elke put en plaats de kamers terug in de incubator om de E 12,5 luchtpijpgebied of schildklierlobben op semiporeuze filters te plaatsen. Vul eerst de putjes van een 24-putjesplaat met honderd en 30 microliter voorgewarmd kweekmedium.

Plaats de filters op het medium. Zorg ervoor dat u luchtbellen onder de kweekfilter vermijdt. Gebruik vervolgens een micropipet met gefilterde tips om voorzichtig de schildklierexplan of lobben en een minimaal volume medium over te brengen naar het midden van elk van de filters tot een maximum van vier X-explan per filter.

Wanneer u de X-explan op het filter plaatst, is het belangrijk om ze met een minimale hoeveelheid medium naar het midden van het filter over te brengen om te voorkomen dat het medium in contact komt en een meniscus met de filterwand creëert. Verwijder vervolgens eventueel overtollig medium en gebruik een wolfraamnaald