Name: Een Ex vivo Cultuur Systeem om Schildklier Development Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer een ex vivo kweeksysteem voor schildklierontwikkeling met muizenembryo's. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar morfogenese en differentiatieprocessen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door subsidies van de Université catholique de Louvain (Action de recherche concertées) en het Fonds voor Wetenschappelijk Medisch Onderzoek (F.R.S.-FNRS, België). A.-S.D. is een doctoraatsonderzoeker van Télévie, A.-C.H. had een fellowship van het Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (België), M.V. wordt ondersteund door het de Duve Instituut en C.E.P. is een senior onderzoeksmedewerker van de F.R.S.-FNRS (België).

Muizen werden opgevoed en behandeld volgens de principes van proefdier verzorging van de Universiteit Animal Welfare Committee. Alle procedures en protocollen werden goedgekeurd door deze commissie. 1. Coating van Microscopie Plastic Cultuur Chambers OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. De twee soorten coating functioneel gelijkwaardig. <ol><li> Coat plastic cultuur kamers met fibronectine een dag voorafgaand aan de isolatie van de schildklier weefsels: <ol><li> Verdun steriele fibronectine tot 50 ug / ml eindconcentratie in M199 medium aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 0,25 ug / ml fungizon en 2 mM glutamine 12. </li><li> Bedek de putten met 200 pi van verdunde fibronectine en incubeer overnacht in een 4 ° C koelkast. </li><li> Op de dag van de dissectie, zuig het fibronectine, spoel de putten eenmaal met M199 en voeg een minimaal volume van 200 gl M199 aangevuld met antibiotica, glutamine en 10% foetaal kalfsserum. </li><li> Laat de gecoate kamers in de incubator totdat klaar om de explantaten bord. </li></ol></li><li> Coat plastic cultuur kamers met type I collageen 2 uur voor de isolatie van de schildklier weefsels: <ol><li> Verdun steriele type I collageen in een 50 ug / ml eindconcentratie van 10 mM HCI. LET OP: Houd collageen stamoplossing op ijs. </li><li> Bedek de putjes met 200 ui verdund type I collageen en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Zuig het type I collageen, spoel de wells eenmaal met M199 en voeg een minimaal volume van 200 gl M199 aangevuld met antibiotica, glutamine en 10% foetaal kalfsserum. </li><li> Laat de gecoate kamers in de incubator totdat klaar om de explantaten plaat. </li></ol></li></ol> 2. Dissectie van Schildklier Anlagen-bevattende weefsels (E12.5) of schildklier Kwabben (E13.5-e14.5) OPMERKING: Gebruik schoon ontleden gereedschappen en Petri / cultuur platen. De algemene stappen en insnijdingen hieronder beschreven zijn dezelfde voor E12.5 en E14.5 embryo. <ol><li> Sacrifice getimed-zwangere vrouwelijke muizen op de gewenste embryonale (e) dag (van E12.5 tot E14.5) en verwijder de baarmoeder met behulp ontleden instrumenten. </li><li> Plaats de ontleed baarmoeder in een 10 cm plaat met HBSS. </li><li> Houd een uiteinde van de baarmoeder met een tang en open de baarmoeder met een klein schaartje geleidelijk bevrijden alle embryo&#39;s. </li><li> Scheid de embryo&#39;s van de placenta met een schaar en de overdracht van de embryo&#39;s met hun extra-embryonale membranen in een nieuwe 10 cm plaat met HBSS. </li><li> Haal de dooierzak en het amnion. LET OP: Vanaf dit punt, werken onder een stereomicroscoop met transillumination van onderen; toenemende vergroting met dissectie stappen. Gebruik wolfraam naalden in glazen capillairen als ontleden gereedschap. </li><li> Met behulp van de naalden alseen mes en vork, verwijder het bovenste deel van de dieren, waarvan de bovenkaak en de oren (Figuur 1A, gesneden langs een). </li><li> Houd de embryo op zijn rug en verwijder eerst een extra stuk van de neurale buis (figuur 1A, gesneden langs b), dan het onderste deel van het embryo, net onder de voorste ledematen en boven het hart (Figuur 1B). </li><li> Breng de embryo slice met de tong (om het weefsel te oriënteren) en halsgebied in een nieuwe 10 cm plaat met HBSS. </li><li> Verwijder de neurale buis en weefsels van na de slokdarm / luchtpijp (figuur 1C, gesneden langs een). </li><li> Voorzichtig gedeelte weefselplak langs beide zijden van de tong (figuur 1C, gesneden langs b en b &#39;). </li><li> Zoek de slokdarm-en luchtpijp, in het verlengde van de tong, en ontleden weg de tong, waardoor de arytenoid zwelling (figuur 1D, snijden langs een), en het weefsel aan both zijden van de slokdarm / luchtpijp (figuur 1D, snijd langs b en b &#39;). </li><li> Verwijder de slokdarm, en plaats de luchtpijp met zijn ventrale zijde naar boven. </li><li> Ontleden weg de ongewenste weefsels zoals thymus (figuur 1E) en alle weefsels lateraal gelegen ten kieuwboogarteriën. Bij E13.5 en E14.5 embryo, visualiseren de schildklier lobben aan weerszijden van de luchtpijp (Figuur 1F; rode stippellijnen) en verder ontleden de lobben van de luchtpijp. </li><li> Breng de geïsoleerde E12.5 luchtpijp regio, of de E13.5-E14.5 schildklier lobben in een 35 mm cultuur plaat met voorverwarmde M199 medium aangevuld met antibiotica, glutamine en 10% foetaal kalf serum. Transfer explantaten met een voorbevochtigd filter tip over een P-200 micropipet. Voor E12.5 explantaten, snijd het uiteinde van de tip om de opening te verbreden. OPMERKING: Routinematig, en als embryo hetzelfde genotype, stap 6 en 7 uitvoeren op alle embryo, den 9-11, en tenslotte 12 &amp; 13. </li></ol> 3. Plating en cultuur van de Schildklier Explantaten <ol><li> Was de explantaten achtereenvolgens overschrijving in drie putjes van een plaat met 24 putjes bevattende 1 ml voorverwarmde kweekmedium (= M199 aangevuld met antibiotica, glutamine en 10% foetaal kalfsserum). </li><li> Plating van de schildklier lobben op gecoat microscopie plastic cultuur kamers: <ol><li> Zuig M199 kweekmedium van de gecoate kamers. </li><li> Zorgvuldig, overdracht van de schildklier explants in de cultuur kamers met een micropipet en filter tips. Plaats een explant in het midden van elke kamer. </li><li> Verwijder overtollig medium en plaats de kweekkamer in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 2 uur te laten de explantaten hechten aan de matrix. </li><li> Voeg voorzichtig 200 tot 300 ul voorverwarmde kweekmedium aan elke well. </li><li> Incubeer langetermijnkweek in weefselkweek incubator. </li></ol></li><li> Plating of luchtpijp regio of schildklier lobben op semiporous filters: <ol><li> Vul het aantal putjes van een 24-wells plaat vereist met 330 ul voorverwarmde kweekmedium. </li><li> Plaats filters (bv. 0,4 micrometer Millipore filter) op het medium, en zorg dat het opsluiten van luchtbellen onder de cultuur filter te voorkomen. </li><li> Zorgvuldig met een micropipet en tipjes dragen de schildklier explantaten met een minimaal volume van medium naar het midden van de filters (maximum 4/filter). </li><li> Verwijder de overmaat aan middelgrote en ruimte uit de explantaten met een wolfraam naald. </li><li> Incubeer langetermijnkweek in weefselkweek incubator. OPMERKING: Verander kweekmedium om de andere dag onder de laminaire stroming kap. Cultuur de explantaten tot 7 dagen. </li></ol></li></ol> 4. Whole-mount immunofluorescentiekleuring Protocol voor Schildklier Explantaten Verjagen explantaten gekweekt op filters (na stap 2 hieronder) met behulp van wolfraam naalden offijn pincet en overdracht in een 24-wells plaat voor alle stappen, met uitzondering van primair (stap 5) en voortgezet (stap 7) antilichaam incubatie (96-well plaat). Voor hechtende explantaten gekweekt op microscopie plastic kamers, voeren alle stappen in de cultuur kamers. <ol><li> Zuig M199 kweekmedium en zet de explantatie met ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten (500 pi in 24-putjes en 300 ul in microscoopglaasjes). </li><li> Was 2x 10 minuten in Tris gebufferde zoutoplossing met Triton (TBST, 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) bij KT. </li><li> Verwerk de explantaten onmiddellijk of bewaar bij -20 ° C. OPMERKING: Voor langdurige opslag bij -20 ° C, dehydrateren de explantaten in methanol met geleidelijk toenemende methanolconcentratie in TBST 100% methanol bereiken. Als u klaar bent om verder te gaan met de immunokleuring (stap 4), hydrateren de explantaten door geleidelijk toevoegen van TBST aan methanol. </li><li> Vervang TBST met blokkerende oplossing (10% normaal geit serum in TBST) En incubeer op een zee-zaag rocker gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun primaire antilichaam in het blokkeren van oplossing (100-200 ul per conditie). Breng de &quot;filter&quot; explantaten van een 24-wells plaat om een ​​96-well plaat. Incubeer explantaten met de primaire antilichamen op een zee-zaag rocker overnacht bij 4 ° C. </li><li> De volgende dag, gooi het primaire antilichaam oplossing, de overdracht van de &quot;filter&quot; explantaten terug in een 24-well plaat, en was ten minste vijf keer met TBST op een zee-zaag rocker 45-60 minuten elk bij RT. </li><li> Verdun secundair antilichaam (bijv. geit anti-X-Alexa Fluor bij 1:2000 verdunning) in TBST met 1% normaal geit serum en incubeer de explantaten met deze verdunning nachts op zee zaag rocker bij 4 ° C en in het donker. Voor nucleaire tegenkleuring bevatten 1 ug / ml bis-Benzimide (Hoechst) met het secundaire antilichaam oplossing. </li><li> De volgende dag, gooi het secundaire antilichaam oplossing en was 5x met TBST op een zee-zaagrocker 45-60 minuten elk bij RT. Tijdens het wast, houd de explantaten in het donker. </li><li> Voer een extra wassen in TBST voorzichtig schudden overnacht bij 4 ° C in het donker. </li><li> Postfix het immunologisch explantaten in 4% PFA bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Wassen 2x 10 min. met TBST. </li><li> Breng de explantaten hetzij geleidelijk methanol 100% voor langdurige opslag bij -20 ° C, of ​​onmiddellijk geanalyseerd. Voor explantaten gekweekt op filters en immunostained in een 24-well plaat, overdracht in een microscopie kamer (bv. LabTek of Ibidi) met TBST of beter fluorescerende montage medium voorafgaand aan de analyse met een Multiphoton of confocale microscoop. </li></ol> Extractie van RNA uit Schildklier 5. Werken in een RNase-vrije omgeving. Gebruik daarom nucleïnezuur en nuclease gratis pipet tips en reinig zowel bank en apparatuur van contaminanten en RNases. Dit protocol is gebaseerd op fenol / chloroform, voeren de eerste staps (1 tot 7) onder een chemische kap. <ol><li> Homogeniseren een schildklier explant of twee schildklier lobben met 300 ul van RNA-extractie-oplossing met behulp van een disposable stamper voor 1,5 ml tube. In tussen de monsters, was de stamper in 2% SDS, dan water, dan ethanol. </li><li> Voeg nog eens 100 ul RNA extractieoplossing, 10 seconden vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Vortex gedurende 30 seconden en voeg 20 ng tRNA aan elk monster. </li><li> Vortex gedurende 1 minuut en voeg 80 ul van chloroform. </li><li> Vortex krachtig gedurende 30 seconden en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeren gedurende 15 minuten bij 19.000 xg in een gekoelde (4 ° C) gecentrifugeerd. </li><li> Transfer zorgvuldig de kleurloze bovenste waterige fase in een nieuwe buis met 20 ug van glycogeen als coprecipitatiemiddel. </li><li> Vortex en voeg 200 ul 100% isopropanol. </li><li> Vortex krachtig gedurende 15-30 seconden en laat RNA neerslag bij -20 ° C gedurende 2-3 uur of bij -80 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Spin gedurende 30 minuten bij 19.000xg bij 4 ° C en elimineren supernatant. </li><li> Was de pellet met 450 ul koude 75% ethanol en vortex om de pellet los te maken. </li><li> Centrifugeren gedurende 10 minuten bij 19.000 xg bij 4 ° C en elimineren supernatant. </li><li> Droog de pellet onder de kap 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet met 10 ul van RNase-vrij water en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Test RNA-concentratie, bewaar bij -80 ° C of achteruit transcriberen voor de analyse van genexpressie. </li></ol>

<ol><li>Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+cell+biology+of+thyroid+angiofollicular+units%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units.</a> Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).</li>
<li>Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+mouse+thyroid+embryonic+vessel+contacts+and+parenchymal+growth+pattern+during+specification+budding%2C+migration%2C+and+lobulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation.</a> Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).</li>
<li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+thyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the thyroid gland.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).</li>
<li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetics+of+early+thyroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetics of early thyroid development.</a> J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).</li>
<li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+development+and+its+disorders+genetics+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms.</a> Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).</li>
<li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+factors+in+thyroid+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update.</a> Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).</li>
<li>Hick, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+epithelial+paracrine+interactions+during+thyroid+development+govern+follicular+organization+and+C-cells+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation.</a> Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).</li>
<li>Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+integration+of+thyrocytes+and+thyroid+folliculogenesis%3A+a+perspective+for+thyroid+tissue+regeneration+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+J%22%5BJournal%5D)">Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering.</a> Endocr. J. 48, 407-425 (2001).</li>
<li>Toda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+for+studying+thyroid+biology+and+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Culture models for studying thyroid biology and disorders.</a> ISRN Endocrinol. , (2011).</li>
<li>Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+factors+regulating+growth+and+function+of+human+thyroid+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo.</a> 213, 47-58 (2003).</li>
<li>Antonica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thyroid+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thyroid from embryonic stem cells.</a> Nature. 491, 66-71 (2012).</li>
<li>van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh-dependent+differentiation+of+intestinal+tissue+from+embryonic+pancreas+by+activin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A.</a> J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).</li>
<li>Hick, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands%3A+a+role+for+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol.+9%22%5BJournal%5D)">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9. , (2009).</li>
<li>Pierreux, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial%3AEndothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li>
<li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+ex-vivo+culturing+of+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro.</a> Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit document beschrijft een werkwijze voor het ontleden en kweken schildklier explantaten (E12.5) of lobben (E14.5) teneinde te bestuderen en beter inzicht in de complexe gebeurtenissen die leiden tot de vorming schildklier. Door de dubbele oorsprong van de schildklier Anlagen (de middellijn anlage en twee laterale ultimobranchial organen), en hun geringe omvang, een fragment van E12.5 weefsel gelokaliseerd rostraal van de kieuwboogarteriën en met de luchtpijp, maar niet de slokdarm wordt gemicrodissecteerde. Zoals geïl...

De schildklier is een verzameling van onafhankelijke epitheliale bolletjes, de zogenaamde follikels, omgeven door een dicht netwerk van endotheel haarvaten. Deze organisatie maakt schildklierfunctie: endotheliale capillairen voorzien thyrocytes met jodium, vereist voor T3 en T4 hormoonsynthese en deze laatste op het hele lichaam verspreiden. Verspreid tussen de follikels en haarvaten, C-cellen produceren het hormoon calcitonine hypocalcemieperioden 1. Hoewel volwassen schildklier architectuur en functies zijn bekend, de cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de schildklier embryonale ontwikkeling (follikel vorming en differentiatie) zijn verre van begrepen. Tijdens de embryogenese, thyrocytes voorlopercellen afkomstig is als een verdikking (de middellijn anlage) van de ventrale wand van de voordarm endoderm op embryonale dag (e) 8.5 in de muis embryo, terwijl de C-cellen voorlopercellen ontstaan ​​bij E11.5 als druppel-vormige uitsteeksels ( de ultimobranchial bodies) van het vierde faryngeale zakjes 2-6. De middellijn knop los dan van het endoderm, breidt bilateraal fuseren op E13.5 de ultimobranchial organen aan elke kant van de luchtpijp. Tenslotte thyrocytes organiseren in follikels en C-cellen differentiëren. Huidige kennis over schildklier vorming komt vooral van histologische analyse van vaste weefsels, maar de morfogenetische gebeurtenissen betrokken bij de vorming van de schildklier zijn zeer dynamisch en communicatie en interacties tussen verschillende celtypen en met de extracellulaire matrix te betrekken. Recent onderzoek toonde aan dat thyrocyte voorlopers van hoge niveaus van VEGF in endotheelcellen de ontwikkeling schildklier, en, beurtelings, gerekruteerd endotheelcellen bevorderen follikel vorming en C-cellen differentiatie 7. De meeste ex vivo studies over de schildklier zijn uitgevoerd op geïsoleerde volwassen schildklier-afgeleide cellen, geteeld op 2D weefselkweek plastic dishes of in 3D matrices. Gebruik van dit soort culturen, gedifferentieerde folliculaire cellen ofwel blijven gepolariseerd en georganiseerd als follikels of opnieuw op te pakken van een 3D-organisatie 8-10. Echter, deze zuivere epitheelcellen, geëxplanteerd van de fysiologische omgeving, en gekweekt in 2D, negeren interacties met de extracellulaire matrix, cytokinen, groeifactoren en andere celtypes zoals endotheliale of zenuwen cellen die zij normaal tegenkomen in vivo. Een zeer mooie studie die onlangs beschreef een differentiatie protocol van ES-cellen in de schildklier follikels met behulp van een laatste cultuur stap in 3D matrigel 11. Echter, deze 3D culturen missen contact met andere celtypen. Op basis van eerdere kennis over pancreas en speekselklieren orgelcultuur 12-14 is een werkwijze voor het ontleden muis embryonale schildklier Anlagen en kweken van de explantaten op semiporous filters of microscopie plastic objectglaasjes ontwikkeld. Wanneerwerken met E12.5 embryo&#39;s, de dubbele oorsprong van de schildklier Anlagen (de middellijn anlage en de twee zijdelingse ultimobranchial lichamen) opgelegd de microdissection van een groot fragment van weefsel. Dit bevatte de luchtpijp, maar niet de slokdarm en uitgebreid van de kieuwboogarteriën tot de arytenoid zwelling. Wanneer gekweekt op filters, de middellijn Anlage zich lateraal aan weerszijden van de luchtpijp, waar fuseren met de ultimobranchial lichamen de twee lobben schildklier, nog verbonden door een smalle landengte vormen. In cultuur epitheelcellen prolifereren, organiseren in follikels en differentiëren in thyrocytes en C-cellen, afhankelijk van hun oorsprong. Endotheelcellen in de gemicrodissecteerde weefsel ook vermenigvuldigen en binnenvallen de schildklier lobben om eindelijk nauw te betrekken bij de epitheliale folliculaire structuur, onafhankelijk van de bloedstroom of circulerende factoren. Aangezien ontwikkeling van de explantaten trouw recapituleert in vivo ontwikkelingment, deze cultuur systeem optimaal te morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen tijdens schildklier ontwikkeling te bestuderen. Schildklier weefsels kunnen worden verkregen bij wild type, knockout of fluorescerende transgene embryo&#39;s, en de cultuur systeem vatbaar is voor verlies-en winst-of-function experimenten. Ten slotte kan time-lapse imaging van fluorescent gelabelde schildklier explantaten op microscopie plastic schaaltjes worden benut om de kinetiek en de continuïteit van morfogenetische bewegingen die zich voordoen in vivo beter te onderzoeken. Time-lapse imaging is al gebruikt om vertakking morfogenese van de alvleesklier 15,16 of de ureterknop 17 bestuderen.

<table><tbody><tr><td>&micro;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, steriele</td><td>proxylab</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Collageen type I, rattenstaart</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin uit humaan plasma</td><td>Invitrogen</td><td># 33010-018</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraamdraad</td><td>Goodfellow</td><td>LS237450</td><td></td></tr><tr><td>cultuurplaatje-inzet (12 mm diameter)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherine</td><td>BD Biosciences</td><td>610182</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-661-P1</td><td>1/400</td></tr><tr><td>PECAM</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr></tbody></table>

een<em&gt; ex vivo</em&gt; cultuur systeem om schildklier development study

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

De schildklier is een endocriene klier bilobated gelokaliseerd aan de basis van de hals, waardoor de schildklierhormonen T3, T4 en calcitonine. T3 en T4 worden geproduceerd door gedifferentieerde thyrocytes georganiseerd in gesloten gebieden genoemd follikels, terwijl calcitonine wordt gesynthetiseerd door C-cellen afgewisseld tussen de follikels en een dicht netwerk van bloedvaten. Hoewel volwassen schildklier architectuur en functies zijn uitvoerig beschreven en bestudeerd, de vorming van de &quot;angio-folliculaire&quot; eenheden, de verdeling van C-cellen in het parenchym en paracriene communicatie tussen epitheel-en endotheelcellen is verre van duidelijk. Deze methode beschrijft de opeenvolgende stappen van muis embryonale schildklier anlagen dissectie en haar cultuur op semiporous filters of op microscopie plastic dia&#39;s. Binnen een periode van vier dagen, deze cultuur systeem trouw recapituleert in vivo schildklier ontwikkeling. Namelijk (i) bilobation van het orgel plaatsvindt (bij E12.5 explantaten), (ii) thyrocytes voorlopers ordenen in follikels en polariseert, (III) thyrocytes en C-cellen differentiëren, en (iv) endotheelcellen in de gemicrodissecteerde weefsel prolifereren, migreren in de schildklier lobben, en nauw te betrekken bij de epitheelcellen, zoals ze doen in vivo. Schildklier weefsel kan worden verkregen bij wild type, knockout of fluorescerende transgene embryo&#39;s. Bovendien explantaten cultuur kan worden gemanipuleerd door toevoeging van inhibitoren, blokkerende antilichamen, groeifactoren, of cellen of geconditioneerd medium. Ex vivo ontwikkeling kan in real time worden geanalyseerd, of op elk moment van de cultuur door immunokleuring en RT-qPCR. Tot slot, de schildklier explantaatkweek gecombineerd met downstream hele-mount of op de afdelingen beeldvorming en profilering van genexpressie biedt een krachtig systeem voor het manipuleren en bestuderen van morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen van de schildklier organogenesis.

Schildklier anlages (middellijn en UB, samen met omliggende weefsels) en schildklier lobben ontleed uit muizenembryo&#39;s op E12.5 en e13.5/e14.5 respectievelijk (figuur 1). Na een dag in kweek op filterpapier, de middellijn Anlage zichtbaar (Figuur 2A) als langwerpig weefsel verspreid bovenop de luchtpijp. Het vormt steeds twee lobben aan weerszijden van de luchtpijp. Als geïsoleerd schildklier lobben (E13.5 of E14.5) worden gekweekt, zullen ze uitbreiden, ondergaan morfogenese en epi...

Dit protocol beschrijft de dissectie van embryonale schildklier aanleg bij muizen en de kweek van explantaten op semiporeuze filters of op plastic dia's voor microscopie. Dit systeem is ideaal om morfogenetische of differentiatiegebeurtenissen te bestuderen die plaatsvinden tijdens de schildklierontwikkeling van wildtype of knockout embryo's, en is geschikt voor gain- en loss-of-function experimenten.

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Het algemene doel van deze procedure is het dissecteren van ex vivo culturen, implantaten of lobben van de embryonale schildklier van muizen om de studie van morfogenetische en differentieprocessen tijdens de ontwikkeling van de schildklier mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de bovenkaak en het onderste deel van het lichaam van muizembryo's van embryonale dag E 12.5 tot E 14.5 te verwijderen, zodat de halsregio van de embryo's geïsoleerd kan worden.In de tweede stap worden de neurale buis, het laterale weefsel en de tong verwijderd om het bovenste gedeelte van de trachea en de slokdarm bloot te leggen. Vervolgens worden de schildklierknop, regio's of lobben verder gereinigd van ongewenst weefsel. In de laatste stap worden de schildklierimplantaten geplaatst voor kweek in een gecoate microwell of op een filter.Uiteindelijk kan time-lapse imaging, immunokleuring of genexpressieanalyse worden uitgevoerd om de driedimensionale organisatie van de epitheliale morfogenese en follikels, de vascularisatie van de implantaten of de differentiatie van schildklierprogenitoren te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen over ontwikkeling en differentiatie, zoals de organisatie van schildklierepitheelcellen in 3D, lumenvorming, celdifferentiatie, polarisatie en groei.De procedure zal worden gedemonstreerd door Fidel Marcel, een promovendus, en Myla LaCorte, een postdoc, beiden uit mijn laboratorium, onder steriele omstandigheden in de laminaire flowkast. Verdun twee uur vóór de isolatie van het schildklierweefsel steriel Type one collagen tot een uiteindelijke concentratie van 50 µg/mL in 10 mM waterstofchloride en plaats het collageen op ijs.Bedek vervolgens elke put van een plastic kweekkamer met 200 µL van het verdunde collageen en incubeer de kamer bij kamertemperatuur. Aspireer na twee uur het collageen. Spoel de putten met M1 99-medium en voeg aan elke put een minimaal volume van 200 µL kweekmedium toe. Plaats de gecoate kamers in de incubator en ga vervolgens over tot de dissectie van de schildklier.Plaats eerst de gedissecteerde uterus in een petrischaal van 10 centimeter die HBSS bevat. Gebruik vervolgens een pincet om één uiteinde van de uterus vast te houden en open de uterus met een kleine schaar om de embryo's opeenvolgend vrij te maken. Gebruik de schaar om de embryo's van de placenta te scheiden en breng de embryo's, samen met hun extra-embryonale membranen, over naar een nieuwe petrischaal van 10 centimeter met vers HBSS.Vervolg vervolgens de dissectie van elk embryo onder een stereomicroscoop. Verwijder eerst de dooierzak en het amnion. Gebruik daarna wolfraamnaalden in glazen capillairen als mes en vork.Verwijder het bovenste gedeelte van de kop, inclusief de bovenkaak en de oren. Houd het embryo op zijn rug. Verwijder vervolgens een extra stuk van de neurale buis en verwijder daarna het onderste gedeelte van het embryo, net onder de voorpoten en boven het hart.Om het weefsel te oriënteren, brengt u de embryosnede die de tong en de halsregio bevat over naar een nieuwe petrischaal van 10 centimeter met vers HBSS en verwijdert u de neurale buis en de weefsels posterior van de slokdarm en de trachea. Snijd nu voorzichtig de weefselsnede langs beide zijden van de tong. Lokaliseer vervolgens de slokdarm en de trachea en dissekeer de tong weg, waarbij de retinoid swelling en het weefsel aan beide zijden van de slokdarm en de trachea behouden blijven.Verwijder de tong, ontleed de slokdarm en plaats de trachea met de ventrale zijde naar boven. Verwijder vervolgens het ongewenste weefsel, zoals de thymus en alle weefsels die zich lateraal van de arteriën van de faryngeale boog bevinden. Visualiseer bij embryo's van E 13.5 of E 14.5 de schildklierlobben aan weerszijden van de trachea en ontleed de lobben vervolgens verder van de trachea.Voor embryo's van E 12,5 kan de dissectie worden uitgevoerd zoals zojuist gedemonstreerd tot na het verwijderen van de tong en de slokdarm. Lokaliseer vervolgens de faryngeale boogslagaders en verwijder al het laterale weefsel, net als bij embryo's van E 13,5 tot 14,5. Breng tenslotte het geïsoleerde weefsel, met behulp van een vooraf bevochtigde filtertip op een P 200 micropipet, over naar een culturele plaat van 35 millimeter met voorverwarmd kweekmedium.Voordat de schildklier-explantaten van E 13.5 tot E 14.5 worden geplaatst: was eerst het weefsel door opeenvolgende overdracht naar drie wells van een 24-wells plaat die elk één milliliter voorverwarmd cultuurmedium bevatten, om de lobben vervolgens in de voorbehandelde kamers te plaatsen. Aspireer eerst het cultuurmedium en gebruik een micropipet met gefilterde tips om voorzichtig één schildklierlob in elk van de cultuurkamers te plaatsen.Verwijder alle overtollige medium en plaats de kweekkamer vervolgens in een weefselkweekincubator om de explantaten aan de matrix te laten hechten. Voeg na twee uur voorzichtig 200 tot 300 µL voorverwarmd kweekmedium toe aan elke well en plaats de kamers terug in de incubator om de E 12.5 trachea-regio of schildklierkwabben op semi-poreuze filters uit te platen. Vul eerst de wells van een 24-well plaat met 130 µL voorverwarmd kweekmedium.Plaats de mediumfilters op het medium. Let er hierbij op dat er geen luchtbellen onder het kweekfilter opgesloten raken. Gebruik vervolgens een micropipet met gefilterde tips om de schildklier-explantaat of lobben en een minimaal volume medium zorgvuldig over te brengen naar het midden van elk filter, tot een maximum van vier explantaat per filter.Wanneer de X-explantaat op het filter worden geplaatst, is het belangrijk om deze met een minimale hoeveelheid medium naar het centrum van het filter te verplaatsen om te voorkomen dat het medium in contact komt met de filterwand en een meniscus vormt. Verwijder vervolgens eventueel overtollig medium en gebruik een tungsteennaald om de explantaten te verspreiden. Plaats ze daarna voor maximaal zeven dagen in de weefselkweekincubator, waarbij het cultuurmedium om de dag wordt vervangen onder de laminaire flowkast.Na één dag kweek op een filter is de middellijn op laa zichtbaar als een langwerpig weefsel dat over de gehele bovenlengte loopt en twee lobben vormt aan weerszijden van de trachea. Tijdens de kweek breiden de lobben zich uit en ondergaan ze morfogenese, waarbij de epitheelcellen worden georganiseerd in macroscopisch zichtbare folliculaire structuren. Zoals in deze afbeeldingen wordt aangetoond, kunnen de organisatie en polarisatie van de coherente, positieve epitheelcellen worden gevisualiseerd door ezrine-immunolabelling.Na verloop van tijd fuseerden de ezrine-positieve intracellulaire structuren met de pool van de cel die de apicale pool zou worden. Tijdens dit proces prolifereren en organiseren pcam-positieve endotheelcellen zich rond de ontwikkelende follikels om angiofollikulaire eenheden te vormen. Om de differentiatie van de thyrocyten en C-cellen te kwantificeren, kan de genexpressie worden bepaald via RT-qPCR van RNA, geïsoleerd uit de gecultiveerde schildklierkwabben.Hoewel de expressie van de schildklier-transcriptiefactor NK X 2.1 tijdens de kweek niet verandert, neemt de expressie van het schildklier-specifieke thyroglobuline en van het C-cel-specifieke calcitonine drastisch toe, wat wijst op een functionele differentiatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u schildklier-explantaten moet dissekeren en kweken. U bent nu klaar om gain- en loss-of-function-experimenten uit te voeren met wildtype- of NOCO-embryo's.

an-ex-vivo-culture-system-to-study-thyroid-development

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the procedure for orthotopic inoculation of thyroid cancer cells into the thyroid gland of mouse models, which may then serve as a valuable platform to assess carcinogenesis and discover potential treatment strategies.

Orthotopic Inoculation of Thyroid Cancer Cells into Murine Thyroid: A Procedure to Establish Orthotopic Thyroid Cancer Mouse Model

Generatie van een orthotope muismodel van anaplastisch schildkliercarcinoom wordt hier beschreven. Deze techniek maakt chirurgische plaatsing van menselijk anaplastisch schildklierkanker cellen in de schildklier van immunodeficiënte muizen, waardoor een meer klinisch relevante instelling van ziekteprogressie en screen vernieuwende therapeutische interventies bestuderen.

Een orthotope Muis Model van Anaplastisch Schildklier Carcinoom

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

De ex vivo rechtopstaande druppelcultuur is een alternatief voor huidige in vitro en in vivo experimentele technieken. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist kleinere hoeveelheden reagens, terwijl het de mogelijkheid biedt om foetale vasculaire vorming, morfogenese en organogene te manipuleren en te bestuderen.

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Dit artikel bevat een bijgewerkte aanpak van de klassieke kwartel-kip chimera systeem te bestuderen van de vorming van het orgel, door het combineren van nieuwe in vitro en in ovo experimentele procedures.

De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma

Dit protocol beschrijft xenotransplantaatmodellen is en orthotopic Muismodellen van menselijke schildklier tumorvorming als een platform voor het testen van microRNA-gebaseerde remmer behandelingen. Deze aanpak is ideaal voor het bestuderen van de functie van niet-coderende Rna's en hun potentieel als nieuwe therapeutische doelen.

In vivo remming van MicroRNA te verminderen tumor groei bij muizen

Hier presenteren we een standaard pijplijn om murine ATC-tumoren te verkrijgen door spontane genetisch gemanipuleerde muismodellen. Verder presenteren we tumordynamiek en pathologische informatie over de primaire en uitgezaaide laesies. Dit model zal onderzoekers helpen om tumorigenese te begrijpen en medicijnontdekkingen te vergemakkelijken.

Spontaan muizenmodel van anaplastische schildklierkanker

Het huidige protocol beschrijft hoogfrequente echografie voor het visualiseren van de gehele schildklier van de muis en het monitoren van de groei van anaplastisch schildkliercarcinoom.

Hoge-resolutie echografie voor de analyse van orthotopische ATC-tumoren in een genetisch gemanipuleerd muismodel

Het muismodel Thyroid Hormone Action Indicator is ontwikkeld om weefselspecifieke kwantificering van de lokale werking van schildklierhormoon mogelijk te maken met behulp van de endogene regulerende machinerie. Onlangs is aangetoond dat het model geschikt is voor het karakteriseren van hormoonverstorende chemicaliën die interageren met de schildklierhormooneconomie, zowel door ex vivo als in vivo methodologieën.

In vivo karakterisering van hormoonverstorende chemische effecten via schildklierhormoon actie-indicator muis

Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

Leer een ex vivo kweeksysteem voor schildklierontwikkeling met muizenembryo's. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar morfogenese en differentiatieprocessen mogelijk.

Een

Meer video's verkennen