Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten
June 13th, 2014
Statische adhesietest is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om het model van interacties tussen T-lymfocyten en andere celtypes. Interacties worden gegenereerd door het injecteren gelabelde T-cellen in putjes bekleed met adhesiemoleculen, terwijl een plaatlezer wordt gebruikt om het aantal hechtende cellen te kwantificeren na seriële wasbeurten.
Het algemene doel van deze procedure is om cellulaire adhesie te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een 96-wells microplaat te coaten met adhesiemoleculen in de tweede stap. Primaire humane T-cellen worden geïsoleerd uit het bloed en gelabeld met CFSE.
Vervolgens worden de T-cellen gestimuleerd met behandelingen om hun hechtingsvermogen te beïnvloeden. In de laatste stap worden de behandelde cellen toegevoegd aan de microplaat en wordt adhesie toegestaan. Uiteindelijk kan de hoeveelheid fluorescentie per well worden gemeten om het percentage adhesieve cellen per behandelingsconditie te bepalen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals T-cel toevoeging aan een model en anterium, is dat co-cultuur van T-cellen en erl-cellen niet vereist is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het immunologieveld, zoals hoe specifieke geneesmiddelen de adhesie van lymfocyten beïnvloeden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in line foot biologie, kan het ook worden toegepast op andere maie cellen zoals neutrofielen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen moeilijk te beheersen zijn en precisie en vaardigheid vereisen. Om een microplaat met de adhesiemoleculen te coderen, begint u met het wassen van 24 wells van een 96-wells plaat met 50 microliters wasoplossing, en incubeer vervolgens elke well behalve de ongecoate controlewells met 50 microliters coatingoplossing gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Aspibeer vervolgens voorzichtig de coatingoplossing zonder dat de pipettepunt de bodem van de wells raakt. Was vervolgens de wells met nog eens 50 microliters wasoplossing, en incubeer de microplaat met 50 microliters adhesieoplossing per well.
Opnieuw bij 37 graden Celsius. Na één uur aspibeert u voorzichtig de adhesieoplossing en wast u de wells nogmaals met 50 microliters wasoplossing. Om de T-cellen te isoleren, mengt u eerst grondig 50 microliters humaan T-cel verrijkingscocktail per milliliter vol bloed, en incubeer vervolgens het behandelde bloed gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens zes milliliters van het behandelde bloed en een gelijk volume calcium- en magnesiumvrij PBS verrijkt met 1%D glucose toe aan een 50 milliliter conische buis op kamertemperatuur en meng de oplossing voorzichtig.
Voeg vervolgens 15 milliliters lymfo prep toe aan een nieuwe 50 milliliter conische buis, en leg voorzichtig uw verdunde bloedmonster op het lymfocytisolatiemedium. Scheid de cellagen gedurende 20 minuten bij 400 keer G en 20 graden Celsius met de breekbuis. Gebruik vervolgens een verse pasterpipet om de bovenste laag te verwijderen, waarbij de lymfocytlaag ongestoord aan het grensvlak blijft.
Breng de lymfocytlaag over naar een nieuwe conische buis met een nieuwe pesterpipet. Voeg negen milliliters PBS toe aan de lymfocyten en verdeel vervolgens de cellen gelijkmatig door de suspensie voorzichtig in en uit te trekken. Spuit de cellen neer en resuspendeer vervolgens het pellet in media.
Breng vervolgens de cellen over in een T 75 kweekflacon. 20 milliliters kweekmedia om de cellen te stimuleren na de geschikte kweekperiode. Voeg eerst serumvrij media toe aan 2,4 keer 10 tot de zes T-cellen, en sterf vervolgens de cellen in een 37 graden Celsius incubator.
Na twee uur spuit u de cellen neer en resuspendeert u het pellet. Label de cellen in het donker gedurende acht minuten op kamertemperatuur met een fluorescente marker in één milliliter PBS, en stop vervolgens de reactie door 10 milliliter 37 graden Celsius PBS toe te voegen. Na het spuiten van de cellen, resuspendeert u het pellet in 1,2 milliliters voorverwarmde adhesieoplossing.
Verwarm de gecoate microplaat tot 37 graden Celsius, verdeel vervolgens de cellen in acht 150 microliters aliquoten in 1,5. Milliliter buisjes. Stimuleer één buisje met PMA bij 10 nanogram per milliliter als positieve controle. Laat drie buisjes onbehandeld om de controle voor stimulatie, de onbehandelde laadcontrole en de controle voor ICAM een coating te dienen, en stimuleer vier buisjes met verschillende concentraties anti CD drie antilichamen.
Deel vervolgens onmiddellijk 50 microliters van één keer 10 tot de vijfde cellen per well van de gestimuleerde celmengsels in de geschikte wells in de microplaat en incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Om het percentage adhesieve cellen te bepalen, wast u eerst elke well met 150 microliters warme adhesieoplossing. Schud de plaat voorzichtig een paar seconden en aspibeer vervolgens voorzichtig het medium uit elke well zonder de bodem van de wells met de pipettepunten aan te raken.
Herhaal het wassen drie keer, verander de hoek van de pipet bij elke aspiratie. Zet vervolgens de plate reader aan en open de plate reading software onder het taakmenu. Klik op nieuw om een nieuw protocol in te stellen.
Selecteer vervolgens de leesoptie onder het actiemenu. Klik op fluorescente intensiteit en klik op oké. Voer de excitatiegolflengte in als 485 en de emissiegolflengte als 528.
Selecteer vervolgens onder het optiekmenu de optie onder en klik op oké. Ga vervolgens terug naar het actiemenu en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius en klik op oké. Laad ten slotte de microplaat en klik op uitvoeren.
Na het exporteren van de resultaten naar een spreadsheet, gebruikt u de formule om het percentage adhesieve cellen in deze afbeeldingen te berekenen. Een voorbeeld van een adhesietest met primaire T-cellen, gestimuleerd met verschillende concentraties van anti CD drie antilichamen, wordt getoond. De niet-gestimuleerde cellen dienen als de negatieve controle.
De met PMA behandelde cellen dienen als de positieve controle. Voor de anti CD drie antilichamen toont de tabel de relatieve fluorescentie-intensiteiten van CFSE. Gelabelde primaire T-cellen gestimuleerd met verschillende doses van oplosbare anti CD drie antilichamen en geplateerd op IAM een gecoate wells. Voor elke con
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
De statische adhesie-assay is een methode die wordt gebruikt om de interacties tussen T-lymfocyten en andere celtypen te bestuderen. Dit omvat het coaten van een microplaat met adhesiemoleculen en het kwantificeren van de aanhechtende T-cellen met behulp van fluorescentiemeting.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celadhesie
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van T-celinteracties is cruciaal voor immunologisch onderzoek.
- Adhesiemoleculen spelen een belangrijke rol in cel-celinteracties.
- Het kwantificeren van adhesie kan inzicht geven in het gedrag van T-cellen.
- Deze assay kan worden aangepast voor verschillende experimentele omstandigheden.
Doel van de studie
- Om de cellulaire adhesie van T-lymfocyten te kwantificeren.
- Om de effecten van verschillende behandelingen op de kleefkracht van T-cellen te beoordelen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van T-celinteracties.
Gebruikte methoden
- Het coaten van een 96-wells microplaat met adhesiemoleculen.
- Het isoleren van primaire humane T-cellen uit bloed.
- Het labelen van T-cellen met CFSE voor fluorescentiemeting.
- Het stimuleren van T-cellen met behandelingen om hun kleefkracht te wijzigen.
Belangrijkste resultaten
- Fluorescentiemeting geeft het percentage aanhechtende cellen aan.
- Verschillende behandelingen beïnvloeden de adhesieniveaus van T-cellen.
- De assay levert kwantitatieve gegevens over T-celinteracties.
- Resultaten kunnen verder onderzoek naar immuunresponsen informeren.
Conclusies
- De statische adhesie-assay is effectief voor het bestuderen van T-celinteracties.
- Kwantitatieve analyse van adhesie kan belangrijke biologische inzichten onthullen.
- Deze methode kan worden toegepast in verschillende immunologische onderzoekscontexten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying integrin-mediated adhesion in T lymphocytes provides a mechanistic readout for evaluating immunomodulatory compounds that influence immune cell trafficking and synapse formation. This static adhesion assay enables target validation by linking intracellular signaling events to functional adhesive outputs, supporting de-risking of immunomodulator candidates in early discovery. The assay’s adaptability to other integrin-ligand pairs (e.g., VLA-4/fibronectin) extends its utility across inflammatory and autoimmune disease areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates inside-out signaling pathways that regulate integrin affinity states, enabling mechanistic de-risking of targets involved in T cell activation.
- Operational Value: Provides a quantitative, fluorescence-based readout to compare adhesion levels across treatment conditions, supporting hypothesis testing in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds affecting lymphocyte adhesion, such as anti-CD3 antibodies or PMA, enabling lead identification based on functional immunomodulation.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well format with CFSE labeling and plate reader compatibility, supporting assay reproducibility and scalability for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular mechanisms of integrin activation to cellular phenotypes relevant to immune cell migration and immunological synapse formation.
- Operational Value: Enables evaluation of adhesion-modulating substances in a disease-relevant system using primary human T cells, supporting translational biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where quantitative adhesion measurements help prioritize immunomodulators based on functional impact on T cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inside-out signaling pathways by measuring changes in integrin-mediated adhesion under controlled stimulation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative fluorescence outputs that allow comparison of compound effects on T cell adhesiveness across replicates.
- Analytics: Enables calculation of percent adherent cells relative to controls, providing a normalized metric for structure-activity relationship analysis.
- Translational Research: Uses primary human T cells coated with physiological ligands (e.g., ICAM-1), enhancing relevance to human immune responses.
- Enterprise Reuse: Adaptable to alternative integrin-ligand pairs, allowing reuse across multiple immunology projects without redeveloping core methodology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to functional adhesion outcomes, increasing predictive confidence in immunomodulator mechanisms.
- Operational Value: Eliminates need for co-culture systems, simplifying workflow and reducing variability compared to cell-based adhesion assays requiring APCs.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by identifying compounds that fail to modulate T cell adhesion, reducing investment in mechanistically inactive candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulators based on quantitative adhesion profiles, improving capital efficiency in preclinical development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human T cell isolation and fluorescence-based assay techniques.
- Dependent on access to a fluorescence plate reader capable of CFSE excitation (485 nm) and emission (528 nm) detection.
- Necessitates standardization of coating, stimulation, and washing steps to ensure reproducible adhesion measurements across wells and experiments.
- Adaptation to other integrin-ligand pairs (e.g., VLA-4/fibronectin) requires validation of coating efficiency and ligand specificity.
- Limitations include static conditions that may not fully replicate shear-dependent adhesion observed in vivo.
