Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten

Het algemene doel van deze procedure is om cellulaire adhesie te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een 96-wells microplaat te coaten met adhesiemoleculen in de tweede stap. Primaire humane T-cellen worden geïsoleerd uit het bloed en gelabeld met CFSE.

Vervolgens worden de T-cellen gestimuleerd met behandelingen om hun hechtingsvermogen te beïnvloeden. In de laatste stap worden de behandelde cellen toegevoegd aan de microplaat en wordt adhesie toegestaan. Uiteindelijk kan de hoeveelheid fluorescentie per well worden gemeten om het percentage adhesieve cellen per behandelingsconditie te bepalen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals T-cel toevoeging aan een model en anterium, is dat co-cultuur van T-cellen en erl-cellen niet vereist is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het immunologieveld, zoals hoe specifieke geneesmiddelen de adhesie van lymfocyten beïnvloeden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in line foot biologie, kan het ook worden toegepast op andere maie cellen zoals neutrofielen.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen moeilijk te beheersen zijn en precisie en vaardigheid vereisen. Om een microplaat met de adhesiemoleculen te coderen, begint u met het wassen van 24 wells van een 96-wells plaat met 50 microliters wasoplossing, en incubeer vervolgens elke well behalve de ongecoate controlewells met 50 microliters coatingoplossing gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Aspibeer vervolgens voorzichtig de coatingoplossing zonder dat de pipettepunt de bodem van de wells raakt. Was vervolgens de wells met nog eens 50 microliters wasoplossing, en incubeer de microplaat met 50 microliters adhesieoplossing per well.

Opnieuw bij 37 graden Celsius. Na één uur aspibeert u voorzichtig de adhesieoplossing en wast u de wells nogmaals met 50 microliters wasoplossing. Om de T-cellen te isoleren, mengt u eerst grondig 50 microliters humaan T-cel verrijkingscocktail per milliliter vol bloed, en incubeer vervolgens het behandelde bloed gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens zes milliliters van het behandelde bloed en een gelijk volume calcium- en magnesiumvrij PBS verrijkt met 1%D glucose toe aan een 50 milliliter conische buis op kamertemperatuur en meng de oplossing voorzichtig.

Voeg vervolgens 15 milliliters lymfo prep toe aan een nieuwe 50 milliliter conische buis, en leg voorzichtig uw verdunde bloedmonster op het lymfocytisolatiemedium. Scheid de cellagen gedurende 20 minuten bij 400 keer G en 20 graden Celsius met de breekbuis. Gebruik vervolgens een verse pasterpipet om de bovenste laag te verwijderen, waarbij de lymfocytlaag ongestoord aan het grensvlak blijft.

Breng de lymfocytlaag over naar een nieuwe conische buis met een nieuwe pesterpipet. Voeg negen milliliters PBS toe aan de lymfocyten en verdeel vervolgens de cellen gelijkmatig door de suspensie voorzichtig in en uit te trekken. Spuit de cellen neer en resuspendeer vervolgens het pellet in media.

Breng vervolgens de cellen over in een T 75 kweekflacon. 20 milliliters kweekmedia om de cellen te stimuleren na de geschikte kweekperiode. Voeg eerst serumvrij media toe aan 2,4 keer 10 tot de zes T-cellen, en sterf vervolgens de cellen in een 37 graden Celsius incubator.

Na twee uur spuit u de cellen neer en resuspendeert u het pellet. Label de cellen in het donker gedurende acht minuten op kamertemperatuur met een fluorescente marker in één milliliter PBS, en stop vervolgens de reactie door 10 milliliter 37 graden Celsius PBS toe te voegen. Na het spuiten van de cellen, resuspendeert u het pellet in 1,2 milliliters voorverwarmde adhesieoplossing.

Verwarm de gecoate microplaat tot 37 graden Celsius, verdeel vervolgens de cellen in acht 150 microliters aliquoten in 1,5. Milliliter buisjes. Stimuleer één buisje met PMA bij 10 nanogram per milliliter als positieve controle. Laat drie buisjes onbehandeld om de controle voor stimulatie, de onbehandelde laadcontrole en de controle voor ICAM een coating te dienen, en stimuleer vier buisjes met verschillende concentraties anti CD drie antilichamen.

Deel vervolgens onmiddellijk 50 microliters van één keer 10 tot de vijfde cellen per well van de gestimuleerde celmengsels in de geschikte wells in de microplaat en incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Om het percentage adhesieve cellen te bepalen, wast u eerst elke well met 150 microliters warme adhesieoplossing. Schud de plaat voorzichtig een paar seconden en aspibeer vervolgens voorzichtig het medium uit elke well zonder de bodem van de wells met de pipettepunten aan te raken.

Herhaal het wassen drie keer, verander de hoek van de pipet bij elke aspiratie. Zet vervolgens de plate reader aan en open de plate reading software onder het taakmenu. Klik op nieuw om een nieuw protocol in te stellen.

Selecteer vervolgens de leesoptie onder het actiemenu. Klik op fluorescente intensiteit en klik op oké. Voer de excitatiegolflengte in als 485 en de emissiegolflengte als 528.

Selecteer vervolgens onder het optiekmenu de optie onder en klik op oké. Ga vervolgens terug naar het actiemenu en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius en klik op oké. Laad ten slotte de microplaat en klik op uitvoeren.

Na het exporteren van de resultaten naar een spreadsheet, gebruikt u de formule om het percentage adhesieve cellen in deze afbeeldingen te berekenen. Een voorbeeld van een adhesietest met primaire T-cellen, gestimuleerd met verschillende concentraties van anti CD drie antilichamen, wordt getoond. De niet-gestimuleerde cellen dienen als de negatieve controle.

De met PMA behandelde cellen dienen als de positieve controle. Voor de anti CD drie antilichamen toont de tabel de relatieve fluorescentie-intensiteiten van CFSE. Gelabelde primaire T-cellen gestimuleerd met verschillende doses van oplosbare anti CD drie antilichamen en geplateerd op IAM een gecoate wells. Voor elke con