Name: Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Verken glycosoomdynamiek in de Afrikaanse trypanosoom met behulp van fluorescerende eiwitten en flowcytometrie. Deze methode maakt real-time analyse van levende cellen mogelijk om metabole veranderingen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het Creative Inquiry Program for Undergraduate Research en het Calhoun Honors College aan de Clemson University.

1 Algemeen Trypanosoom Veehouderij <ol><li> Weeg vaste stoffen SDM79 media preparaat (Tabel 1). </li><li> Bewaar bij 4 ° C in 50 ml conische of een hersluitbaar zakje. OPMERKING: Reagentia stabiel gedurende tenminste 6 maanden. </li><li> Dooi foetaal bovine serum (FBS) in een 37 ° C waterbad, en meng die periodiek door inversie. OPMERKING: FBS ontvangen van de leverancier als een steriele oplossing. Filter steriliseren FBS verlaagt haar vermogen parasiet groei. </li><li> Zodra de gehele fles wordt ontdooid, warmte inactiveren serum gedurende 30 minuten in een 56 ° C waterbad, mengen periodiek precipitatie van serumcomponenten minimaliseren. </li><li> Ontdooien penicilline / streptomycine-oplossing (pen / strep), hemine (2 mg / ml in 50 mM NaOH), en basaal medium eagle vitamine oplossing bij kamertemperatuur. </li><li> Aan een 1000 ml maatglas, voeg 20,2 g SDM79 vaste stoffen (tabel 1) aan de vloeibare bestanddelen (tabel 2) en meng goed op een roerplaat. </li><li> Breng de pH op 7,35, en breng het volume tot 850 ml met water. </li><li> Filter steriliseer media Door een vacuümslang onderaan een filter fles. Breng vacuüm totdat de oplossing wordt gefiltreerd. </li><li> Verwijder filter boven in de bioveiligheid kast en voeg 150 ml geïnactiveerd FBS. Verwijder de plastic afdekking van steriele dop en verzegeling media fles. </li><li> Bereid SDM80 media op dezelfde wijze als SDM79 met de volgende uitzonderingen; kan glucose of glucosamine niet toevoegen en gebruiken MEM zonder glutamine. In plaats van 150 ml hitte geïnactiveerd FBS, voeg 135 ml gedialyseerd warmte geïnactiveerd FBS en 15 ml hitte geïnactiveerd FBS. </li><li> Cultuur PCF parasieten in 25 cm2 kolf met 10 ml geschikt medium bij 27 ° C en 5% CO2. OPMERKING: De cellen moeten dagelijks worden geteld met behulp van een hemocytometer of flowcytometeranalyses (zie hoofdstuk 6) en culturen moet worden gehandhaafd op dichtheden tussen 1 x 10 5 en 5 x 10 6 cellen / ml. </li></ol> 2 Transfection van PCF Parasieten met de TL-Reporter Construct OPMERKING: glycosome dynamiek volgen, een reporter eiwit dat het peroxisomale targeting sequentie (PTS2) van aldolase gefuseerd met verbeterde geel fluorescent eiwit tot expressie in de parasieten. De sequentie coderend voor het fusie-eiwit wordt gekloneerd in pXS2bla 12, die procyclin promoter en tubuline intergene gebieden die direct homologe recombinatie in het genoom en de blasticidine resistentie-gen voor selectie bevat. Procyclische cellijnen die het op genen die coderen voor het T7 polymerase en tetracycline repressor (PF29-13) worden getransformeerd met de targeting construct, pXS2: PTS2eYFP. <ol><li> Bereid cytomix door het mengen van de in tabel 3 genoemde onderdelen. Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> Lineariseren plasmide DNA met MluI pipetteren 10 ui DNA (1 ug / ul), 5 ui restrictie-enzym buffer, 33 pl water en 2 μ, L MluI enzym in een microcentrifugebuis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Zuiver het restrictiedigestie door 1 volume bindingsbuffer het restrictie-enzym digest. Meng bindende buffer en verteerd DNA door vortexen. Kort Centrifugeer het monster op de bodem van de reageerbuis te verzamelen. </li><li> Plaats een DNA bindende kolom in een 2 ml verzamelbuis en overdracht gedigereerd DNA / bindingsbuffer oplossing kolom. </li><li> Centrifugeer 10.000 xg gedurende 1 minuut. Na het centrifugeren, gooi filtraat uit de collectie buis en terug te keren in de kolom aan de collectie buis. </li><li> Voeg 700 ul van SPW wasbuffer en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut. </li><li> Weggooien filtraat uit de collectie buis, terug in de kolom aan de collectie buis en herhaal SPW wasstap en centrifugeren. </li><li> Gooi filtraat terugkeer kolom verzamelbuis en gecentrifugeerd lege kolom gedurende 3 minuten bij 10.000 xg om resterende ethanol te verwijderen. </li><li> In een bioveiligheid kast, weggooien collectie buis plaats kolom in een steriele microcentrifugebuis. </li><li> Om het DNA te elueren, voeg 25 ul steriel water naar kolom en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg nog 25 uit steriel water bioveiligheid kap kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 10.000 xg snelheid gedurende 1 minuut. </li><li> In een bioveiligheid kast gehele volume van DNA over te dragen aan een nieuwe steriele microcentrifugebuisje. OPMERKING: Deze stap voorkomt vervuiling van de open deksel tijdens het centrifugeren. </li><li> Voeg de steriele, gezuiverde, gelineariseerd DNA (10 ug) tot 400 gl-filter gesteriliseerd cytomix. </li><li> Tellen cellen zoals beschreven in hoofdstuk 6 en oogsten 5 x10 7 -10 8 cellen door centrifugeren bij 800 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur. </li><li> Giet supernatant en resuspendeer de celpellet in 450 ui DNA + cytomix met een 1 ml serologische pipet. </li><li> Transfer oplossing met ce<html> lls, DNA, en cytomix een steriele 4 mm gat cuvet en plaats cuvette in de elektroporatie kamer. </li><li> Selecteer &quot;exponentieel verval&quot; en handmatig de volgende instellingen: Voltage: 1,5 kV, Capaciteit: 25 mF, Resistance: Ω, en Cuvette: 4 mm. Druk op puls. Zodra de puls is voltooid, verwijdert cuvette uit de elektroporatie kamer en terug te keren naar de bioveiligheid kast. </li><li> In een nieuwe steriele fles, pipet 10 ml van SDM79. Breng de getransformeerde cellen aan de kolf met 10 ml SDM79. </li><li> Incubeer zonder geneesmiddelselectie voor 24 uur bij 27 ° C, 5% CO2. Na 24 uur, voeg G418 (15 ug / ml), hygromycine (50 ug / ml) en blasticidine (10 ug / ml). Pass 1 ml van getransformeerde cellen met drugs in 9 ml SDM79 met drugs. </li><li> Analyseren cellen dagelijks, zoals beschreven in de paragrafen 6 en 7 Wanneer cellen zijn fluorescerend, en een celdichtheid van 1 x 10 7 / ml hebben bereikt, maken stabilaten voor langdurige opslag (3.1-3.3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Making stabilaten <ol><li> Om bevriezing media, een gelijk volume van 100% glycerol cytomix en filter steriliseren. </li><li> Voeg 200 ul van bevriezing media 800 ul cellen (1 x 10 7) in een cryovial, meng voorzichtig door omkering en tussen twee Styrofoam rekken en bevriezen bij -80 ° C. </li><li> Eenmaal bevroren (~ 24 uur), de overdracht cellen om vloeibare stikstof. Opmerking: Het is belangrijk om cellen verplaatsen naar LN 2 na 24 uur, zoals langere opslag bij -80 ° C leidt tot een afname in cellevensvatbaarheid. </li></ol> 4 Ontdooien Ingevroren Voorraden <ol><li> Verwijder bevroren flacon van -80 ° C en ontdooien bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 minuten. </li><li> Pipetteer 9 ml SDM79 met drugs in een nieuwe steriele kolf. Voeg ontdooide cellen aan deze kolf. Pass cellen 01:10 door toevoeging van 1 ml van deze kweek 9 ml SDM79 in een nieuwe kolf (eindconcentratie van 1 x 10 5 / ml). </li><li> Voordat de cellen een dichtheid van 10 7 / ml bereikt, beginnen cytometer seten verdunning assays. </li></ol> 5 Cytometer Setup <ol><li> Zet de flowcytometer en cflow Plus-programma te openen. OPMERKING: Voordat u de nodige monsters moet de fluïdica worden teruggespoeld en gespoeld volgens stappen 5,2-5,7. </li><li> Plaats de buis nanozuiver water waarin de sip opgeslagen met een lege buis. </li><li> Selecteer de &quot;backflush&quot; knop. </li><li> Zodra backflush is voltooid, verwijdert microcentrifugebuisje van slok en gooi. </li><li> Plaats een nieuwe microcentrifugebuis met 1 ml van nieuwe nanozuiver water op de slok. </li><li> Selecteer een nieuwe put in cflow programma. Onder &quot;Limieten Run&quot; ingestelde tijd gedurende 2 minuten. Onder &quot;Fluidics&quot; selecteer &quot;snel&quot; en &quot;Run&quot;. </li><li> Zodra de 2 min tijdslimiet is voltooid, klikt u op de knop &quot;Delete Data Sample&quot;. </li></ol> 6 Celtelling gebruik van de Flow Cytometer <ol><li> Vervang het water met het monster moet worden geteld. Stel &quot;Run Limits &quot;tot 30 sec,&quot; Fluidics &quot;om&quot; snel &quot;en selecteer vervolgens&quot; Uitvoeren &quot;. </li><li> Na de 30 seconden tijdslimiet is voltooid, cflow plus zal de gebeurtenissen / ul onder &quot;Laatste Run.&quot; Herhaal telling voor elke cultuur te bieden. OPMERKING: Voordat cellen te bereiken 1 x 10 7 cellen / ml, doorgaan met verdunningstest. De cellen moeten worden stopgezet na een verdunningstest is voltooid. Cellen gekweekt voor een langere periode verliezen hun vermogen om te reageren op milieu-omstandigheden. </li></ol> 7 Het meten van fluorescentie met behulp van de Flow Cytometer <ol><li> Fluorescentie te beoordelen, stelt u &quot;Run Limits&quot; tot 10.000 gebeurtenissen, en &quot;Fluidics&quot; om &quot;langzaam&quot;. Selecteer &quot;Set drempel&quot;. Onder &quot;Primaire Threshold&quot;, selecteer &quot;permanent elimineren gebeurtenissen op&quot;, &quot;FSC-H&quot; (in het drop down box) en voer minder dan 30.000. Klik op &quot;Apply&quot;, dan op &quot;close&quot;. </li><li> Selecteer220; Histogram &quot;knop in een van de nieuwe plot ramen en selecteer&quot; FSC-A &quot;uit het drop-down lijst, selecteert u&quot; FL1-A &quot;. OPMERKING: VT1-A maatregelen fluorescentie in de 530 nm golflengte. </li><li> Selecteer &quot;Run&quot; en herhaal voor alle culturen. </li><li> Ren reinigingsoplossing via fluïdica lijn voor 2 min en water gedurende 2 min. </li></ol> 8 Verwatering Testen <ol><li> Pass cellen tot een dichtheid van 1 x 10 5 cellen / ml in 3 ml SDM79 in een 25 cm2 kolf en meet fluorescentie onmiddellijk na passage en vervolgens 3 uur en 24 uur. </li></ol> 9 Data Analysis <ol><li> Selecteer &quot;Analyseer&quot; tab op cflow Plus. </li><li> Klik op &quot;Histogram&quot; knop onder &quot;Maak een nieuw plot.&quot; Selecteer &quot;FSC-A&quot; en een drop down lijst zal verschijnen. Selecteer kanaal &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Markeer een goed te analyseren. Selecteer &quot;Gate&quot; knop, en een poort met de hand te tekenenvoor de bevolking van belang. </li><li> Flow Plus cell &quot;Graaf&quot; in deze poort en &quot;% van dit perceel&quot; te leveren. </li></ol>

<ol><li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetoplastids%3A+related+protozoan+pathogens%2C+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li>
<li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li>
<li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids%3A+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes%2C+glyoxysomes+and+glycosomes+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li>
<li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes%3A+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li>
<li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+function%2C+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li>
<li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li>
<li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li>
<li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li>
<li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%3A+RNA+interference+studies+of+PEX14%2C+hexokinase%2C+and+phosphofructokinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li>
<li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li>
<li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li>
<li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li>
<li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li>
<li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+medical+bulletin%22%5BJournal%5D)">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li>
<li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li>
<li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li>
<li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+trypanosomatid+PEX19%3A+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li>
<li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi%27s+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li>
<li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells%3A+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li>
<li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li>
<li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li>
<li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Glycosomen zijn essentieel, dynamisch, parasiet-specifieke organellen. De processen die de biogenese, onderhoud, proliferatie en verbouwing van deze organellen regelen waarschijnlijk ook drug targets die kunnen worden benut voor therapeutische doeleinden. Ondanks het potentieel hoge overvloed van deze targets, is het gebied van glycosome biogenese achterbleef het bestuderen van gelijkaardige processen in andere organismen, voornamelijk door het ontbreken van een soepel, high-throughput systeem waarbij snelle, dynamische...

Trypanosoma brucei veroorzaakt Afrikaanse slaapziekte bij de mens en een slopende ziekte, Nagana, bij runderen. Geneesmiddelen die worden gebruikt bij de behandeling van deze ziekten zijn verouderd en uiterst giftig, vaccins beschikbaar zijn, en het potentieel voor de ontwikkeling van resistentie vereist de zoektocht naar nieuwe drug targets 1. Tijdens zijn levenscyclus, T. brucei, afwisselend een insect vector en zoogdiergastheer-; twee hosts die zeer verschillende omgevingen waarin de parasiet moet overleven presenteren. Een aantal metabolische en morfologische veranderingen optreden als de parasiet blootgesteld aan verschillende omgevingsomstandigheden. Enkele van de meest dramatische veranderingen zijn waargenomen bij enkele-membraan begrensd parasiet specifieke microlichamen, genoemd glycosomen 13. Glucosespiegels zijn relatief hoog (~ 5 mM) in het bloed en bloed parasieten (BSF) genereren ATP uitsluitend via glycolyse while mitochondriale stofwisseling wordt onderdrukt 14. In tegenstelling tot andere eukaryoten waar glycolyse optreedt in het cytoplasma, T. brucei compartmentalizes meeste glycolytische enzymen in glycosomen 14,15. De parasieten worden door de tseetseevlieg tijdens een bloedmeel genomen en ervaren een daling in glucose, dat valt te stellen niveaus binnen 15 minuten te worden ingenomen door de vlieg. Het metabolisme van insecten, procyclische vorm (PCF), parasieten is flexibeler en glucose, alsook aminozuren zoals proline, kan worden gebruikt bij de synthese van ATP 16-18. Vergelijkende proteomics studies blijkt lifecycle afhankelijke veranderingen in glycosomal en mitochondriale eiwitten met glycolytisch eiwitten toegenomen in de bloedbaan parasieten en mitochondriale eiwitten die betrokken zijn bij de TCA-cyclus en respiratoire keten 13,19. Terwijl veel studies hebben zich gericht op de verschillen tussen de BSF en PCF glycosomen, is er weinig bekend over de veranderingen in de PCF glycosomen die optreden als reactie op environmental veranderingen. In de dikke darm van de vlieg, het glucose laag is met een voorbijgaande verhoging tijdens een voeding 20. In de meeste in vitro studies, zijn PCF parasieten gekweekt in medium met glucose. Echter, recente studies hebben aangetoond dat PCF stofwisseling sterk verandert in reactie op de beschikbaarheid van 17 glucose. Aangezien glucose, proline opname en proline dehydrogenase activiteit verhogen 18. Deze verandering in het mitochondriaal metabolisme waarschijnlijk gepaard met een verandering in glycosome samenstelling en morfologie, maar dit is niet direct beoordeeld. Elektron en fluorescentie microscopie worden gemeenschappelijke technieken gebruikt om glycosome dynamiek in T. brucei 2,21-24. Deze protocollen zijn tijd en arbeidsintensief, duur en moeilijk aan te passen om real-time studies hoge doorvoer protocollen. Om deze beperking te overwinnen, een tl-organel reporter systeem used naar organellen in zoogdiercellen en gist te bestuderen is aangepast voor gebruik in T. brucei 12. Fluorescent organel reportersystemen zijn uitgebreid gebruikt in hogere eukaryoten zoals gist, planten en zoogdiercellen 25-27. In dergelijke systemen wordt een fluorescerend eiwit gefuseerd aan een aminozuursequentie die het eiwit aan specifieke organellen gericht. De afbraak en synthese van de beoogde eiwitten gemeten via fluorescentie en veranderingen in organel samenstelling worden gereflecteerd door veranderingen in cel fluorescentie. Wanneer het open leesraam van versterkte geel fluorescent eiwit (eYFP) gefuseerd aan een type II peroxisomale targeting sequentie (PTS2) 12, wordt de PTS2eYFP eiwit invoer in rijpe, import-bevoegde glycosomen en fluorescentie kan worden gevolgd via flowcytometrie. Variaties in glycosome preparaat worden gereflecteerd door veranderingen in de cellulaire fluorescentie. Dit systeem kan helpen bij resolVing de mechanismen die het milieu veroorzaakte veranderingen in glycosome samenstelling te regelen. Dit manuscript beschrijft de vorming van een glycosome reporter systeem PCF parasieten in combinatie met flowcytometrie om real-time glycosome dynamiek in levende parasieten volgen en een voorbeeld van hoe het is gebruikt om veranderingen in glycosome samenstelling volgen in reactie op verschillende omgevingen. Samengevat wordt glycosome samenstelling beïnvloed door extracellulaire glucose concentraties en passage van log-fase culturen in vers medium triggers veranderingen in glycosome samenstelling. Dit systeem kan worden aangepast om het dynamische gedrag van andere organellen in trypanosomen en andere parasieten bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Adenosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Cytomix ingrediënt</td></tr><tr><td>EZNA Gel Extraction kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>DNA-zuivering</td></tr><tr><td>Research grade Serum</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Glucosamine HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Freesmedia</td></tr><tr><td>Graces insect cell media powder</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>MEM Amino Acids (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>NEAA Mixture (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Sodium biocarbonate</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix ingrediënt</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Cytomix ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>Pyruvic acid, sodium salt</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Taurine</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Ingrediënt</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>DNA-zuivering</td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>DNA-zuivering</td></tr><tr><td>SPW wash buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>DNA-zuivering</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Trypanosoom transformatie</td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>VWR</td><td></td><td>Trypanosoom transformatie</td></tr></tbody></table>

met behulp van fluorescerende eiwitten naar monitor glycosome dynamiek in de afrikaanse trypanosoom

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is een kinetoplastid parasiet die humane Afrikaanse slaapziekte (HAT), of slaapziekte, en een slopende ziekte, Nagana veroorzaakt, bij runderen 1. De parasiet afwisselend de bloedbaan van de zoogdier gastheer en de tseetseevlieg vector. De samenstelling van veel cellulaire organellen verandert in reactie op deze verschillende extracellulaire condities 2-5. Glycosomen zijn zeer gespecialiseerde peroxisomen waarin veel van de betrokken bij de glycolyse enzymen zijn gecompartimenteerd. Glycosome samenstelling verandert in een ontwikkelings-en milieuvriendelijke gereguleerde manier 4-11. Momenteel is de meest gebruikte technieken om glycosome dynamica te bestuderen zijn elektron en fluorescentiemicroscopie; technieken zijn duur, tijd en arbeidsintensief en niet gemakkelijk worden aangepast aan hoge doorvoer analyse. Om deze beperkingen, een fluorescerende-glycosome reporter systeem in te overwinnendie geel fluorescerend eiwit (eYFP) meer gefuseerd aan een peroxisomen targeting sequentie (PTS2), waarbij het ​​fusie-eiwit glycosomen 12 verbindt, is vastgesteld. Bij de invoer van de PTS2eYFP fusie-eiwit, glycosomen geworden fluorescerend. Organel afbraak en recycling resulteert in het verlies van fluorescentie die kan worden gemeten door stroming cytometrie. Grote aantallen cellen (5.000 cellen / sec) kunnen in real-time worden geanalyseerd, matrixvoorbereiding zoals fixatie en bevestigingsmiddelen. Deze werkwijze biedt een snelle manier detecteren van veranderingen in organel samenstelling in reactie op wisselende omgevingsomstandigheden.

In dit systeem werd een glucose-afhankelijke verandering in glycosome samenstelling waargenomen. Wanneer cellen worden gekweekt in glucose bevattend medium, worden twee populaties waargenomen; een lichte en een dim (Figuur 2A). Dim cellen haven onvolwassen glycosomen, die niet zijn geïmporteerd het PTS2eYFP terwijl heldere cellen herbergen een mix van rijpe en onrijpe glycosomen 12. Wanneer glucose aanwezig is in de media is, mislocalisatie van glycosome eiwitten is dodelijk 15,28 ...

De dynamica van glycosomen in Afrikaanse trypanosomen is moeilijk te bestuderen met traditionele celbiologietechnieken zoals elektronen- en fluorescentiemicroscopie. Als middel om dynamisch orgaangedrag waar te nemen, is een fluorescentie-orgaanrapportagesysteem gebruikt in combinatie met flowcytometrie om de glycosoomdynamica in real-time in levende parasieten te monitoren.

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om real-time veranderingen in de glycosamenstelling in levende cellen te observeren. Dit wordt bereikt door een fluorescent eiwit tot expressie te brengen dat is gefuseerd met een Pero Somal-targetvolgorde PTs twee. Het fusie-eiwit wordt geïmporteerd in volwassen glycozonen, die hierdoor fluorescente organellen worden.Degradatie en recycling leiden tot een verlies van fluorescentie dat via flowcytometrie kan worden gemonitord; cellen worden blootgesteld aan verschillende omgevingscondities om factoren te identificeren die glyco-remodellering triggeren. De resultaten laten zien dat de glyco-compositie varieert als reactie op omgevingsveranderingen, gebaseerd op veranderingen in de cellulaire fluorescentie wanneer cellen worden overgezet van nutriëntarme naar nutriëntrijke media. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals elektronen- en fluorescentiemicroscopie, is dus dat het real-time analyse van duizenden cellen mogelijk maakt.De procedure zal worden gedemonstreerd door Sarah Bauer, een promovendus, en Megan Conlan, een bachelorstudent uit mijn laboratorium. De insecten procyclische vorm

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Effectortranslocatie naar gastcellen via een type III secretiesysteem is een veelvoorkomende virulentiestrategie bij gramnegatieve bacteriën. Een op beta-lactamase gebaseerde effectorfusie-assay voor kwantitatieve analyse van translocatie werd toegepast. In Yersinia geïnfecteerde cellen wordt de conversie van een FRET-reporter door de beta-lactamase gemonitord met behulp van laserscanemicroscopie.

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Dit manuscript beschrijft het gebruik van een bioluminescente stam van Afrikaanse trypanosomen om de tracking van een late infectiefase mogelijk te maken en demonstreert hoe in vivo live beeldvorming kan worden gebruikt om infecties binnen het centrale zenuwstelsel in real-time te visualiseren.

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Het toevoegen van een tag aan een eiwit is een krachtige manier om inzicht te krijgen in zijn functie. Hier beschrijven we een protocol om honderden Trypanosoma brucei-eiwitten parallel endogenetisch te taggen, zodat tagging op genoomschaal haalbaar is.

High-throughput Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

We beschrijven een methode om te bestuderen hoe pH reageert op omgevingssignalen in de glycosomen van de bloedbaanvorm van Afrikaanse trypanosomen. Deze aanpak omvat een pH-gevoelige erfelijke eiwitsensor in combinatie met flowcytometrie om de pH-dynamiek te meten, zowel als een tijdverlooptest als in een high-throughput screen-formaat.

Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei

Verken glycosoomdynamiek in de Afrikaanse trypanosoom met behulp van fluorescerende eiwitten en flowcytometrie. Deze methode maakt real-time analyse van levende cellen mogelijk om metabole veranderingen te bestuderen.

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

Meer video's verkennen