Een nieuwe Verduidelijking methode om Visualiseer Biliary Degeneratie Tijdens Lever Metamorfose in Sea Lamprey ( Petromyzon marinus)

Het algemene doel van deze procedure is om de gehele lever en de verbinding met de darm te verduidelijken voor globale, structurele en cellulaire analyses van biliaire degeneratie. In metamorfe C lamprey. Dit wordt bereikt door eerst de weefsels te fixeren in de hydrogelmonomer-oplossing.

Vervolgens wordt de hydrogel gepolymeriseerd met de gefixeerde weefsels. Daarna wordt het plasmamembraan van het gefixeerde weefsel verwijderd en wordt het weefsel transparant. Ten slotte wordt immunofluorescente kleuring uitgevoerd, waarna uiteindelijk laserhuid- en confocale microscopie wordt gebruikt om globale structurele en cellulaire veranderingen tijdens biliaire degeneratie in metamorfe c Lampry te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biomedische wetenschappen, zoals de connectomen in het centrale zenuwstelsel en in ons geval, de biliaire degeneratie tijdens serumpuntmetamorfose. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie of diagnose van menselijke biliaire of atresie, omdat deze zeldzame aangeboren kinderziekte vergelijkbare kenmerken vertoont met de ary degeneratie tijdens serumpuntmetamorfose. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we een nieuwsartikel bij nature vonden en het online video presenteerden tijdens onze laboratoriumbijeenkomst die de procedure zal zijn Ann Scott, een afgestudeerde student uit ons laboratorium. Na het maken van fosfaatgebufferde zoutoplossing en fosfaatbuffer of pb, volgens het tekstprotocol.

In een afzuigkast bereid 400 milliliter hydrogel voor door gedestilleerd water, 40%acrylamide 2%bis acrylamide 10 XPBS, 16%paraform, aldehyde, saponine en ammoniumpersulfaat te combineren. Bereid een liter clearingoplossing samen van 4%SDS en 0,2 molaire boorzuur, en maak 500 milliliter 80%glycerol om weefsel voor te bereiden in de afzuigkast. Eloqua 10 milliliter hydrogelmonomeroplossing in 15 milliliter centrifugeerbuisjes.

Dissecteer het weefselmonster en plaats het weefsel in elk buisje hydrogel fix bij vier graden Celsius gedurende twee dagen. Na de incubatie onder een afzuigkast, polymeriseert u het gefixeerde weefsel door vijf microliter temid toe te voegen. Meng vervolgens goed en laat de monsters gedurende twee tot drie uur bij kamertemperatuur incuberen.

Na de incubatie verwijdert u het overtollige gel grondig om de weefselmonsters te klaren. Plaats elk in 15 milliliter clearingoplossing en incubeer bij 50 graden Celsius en 70 RPMs gedurende enkele dagen totdat ze transparant worden. Ververs de clearingoplossing minstens eenmaal per dag en verwijder eventueel overtollig gel.

Breng de monsters over in 15 milliliter 0,1 molaire PB met 0,1%Triton X 100 bij 37 graden Celsius en 70 RPMs overnacht. Herhaal de incubatie nog twee keer met verse buffer. Nu het weefsel is opgehelderd en vrij is van overtollig gel, dompelt u de monsters onder in primaire antilichaam in PB tritton X 100 en incubeer bij 37 graden Celsius en 70 RPMs gedurende twee dagen. Gebruik na de incubatie 15 milliliter PB met 0,1%tritton X 100 om de weefselmonsters te wassen bij 37 graden Celsius en 70 RPMs overnacht.

Herhaal de wassing drie keer na het verwijderen van de laatste wasbuffer, voeg fluorescente secundaire antilichaamoplossing toe in PB met 0,1%Trix 100 en blokkerend serum en incubeer in het donker bij 37 graden Celsius en 70 RPMs gedurende een dag. Na het wassen van de monsters drie keer in 10 milliliter PB tritton X 100 bij 37 graden Celsius en 70 RPMs overnacht, voert u drie overnachtelijke wasbeurten uit in PBS. Incubeer ten slotte het opgehelderde weefsel in 80%glycerol bedekt met folie overnacht.

Confocale microscopiebeeldvorming wordt vervolgens uitgevoerd in donker of zwak licht, hoewel de lichten in deze video zijn aangezet voor visualisatiedoeleinden. Er treden verschillende belangrijke ontwikkelingsgebeurtenissen op in het HEPA-biliaire systeem tijdens c lampre-metamorfose, zoals hier getoond, ondergaan de galwegen en de galblaas apoptose en degeneratie. Na gebruik van de gemodificeerde klaringsmethode en kleuring met levercelmarker cytokeratine 19 anti anti apoptotische marker, BCL twee laserscanning confocale microscopie werd gebruikt om optische secties uit te voeren door de intacte lever.

De kleuring onthulde dat het degeneratieve proces optreedt in metamorfe stadia twee tot vier. De bovenste panelen zijn van het anterieure en de onderste panelen zijn van het posterieure uiteinde. Hier is de biliaire boom en hier zijn donkere dendritische uitziende apoptotische cellen en omringende canaliculi en ductgereedschappen in de lever.

Deze figuur vertegenwoordigt driedimensionale beelden die de confocale Z-serie reconstrueren van drie leveren tussen metamorfe stadia twee en drie, gelabeld met antilichamen tegen cytokeratine 19 en BCL twee, de biliaire boom en de donkere dendritische uitziende apoptotische cellen en omringende canaliculi en ductgereedschappen zijn respectievelijk gemarkeerd met witte en zwarte pijlen. Hier is een confocale optische sectie van de galwegen van een specimen tussen metamorfe stadia twee en drie met galdruppeltjes in het lumen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het gehele weefsel kunt klaren voor verdere beeldanalyses.

Vergeet niet dat het werken met paraform, aldehyde en polyacrylamide-oplossingen uiterst gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en het gebruik van de afzuigkast moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.