Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P F) Van Sferische Cellen: Isolated plantenprotoplasten als voorbeeld
8 oktober 2014
Het meten van de osmotische waterdoorlatendheid coëfficiënt (P f) van de cellen kan helpen begrijpen van de regelgeving van aquaporines (AQPs). F bepaling P sferische plantencel protoplasten gepresenteerde omvat protoplasten isolatie en numerieke analyse van de initiële snelheid van volumeverandering als gevolg van een osmotische uitdaging bij constant bad perfusie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om meer te weten te komen over de functie van aquaporines door de osmotische waterdoorlaatbaarheidscoëfficiënt, of PF van plantenprotoplasten te bepalen. Knip een stuk uit een blad zonder axiale epidermis en leg het op een isotone oplossing. Breng de stukken over naar een enzymatische oplossing en incubeer gedurende 20 minuten in 28 graden Celsius, vervolgens naar een verse isotone oplossing.
Verzamel vervolgens de protoplasten bevattende oplossing met een afgesneden punt. Als tweede stap, bereid een experimentele kamer voor. Bevestig een dekglas op de bodem van de dia met siliconenvet.
Bekleed vervolgens de bodem van de kamer met een lijm met een positieve lading en vul de kamer met een isotone oplossing. Geïsoleerde protoplasten worden vervolgens toegevoegd aan de kamer en de kamer wordt delicaat op de microscooptafel geplaatst. Vervolgens worden de protoplasten blootgesteld aan een hypotone oplossing terwijl video's worden opgenomen om hun zweltijdsverloop vast te leggen.
Vervolgens wordt het zweltijdsverloop numeriek geanalyseerd door software, inclusief curvefitting procedures, om de PF van elke protoplast te bepalen op basis van de numerieke analyseresultaten die verschillen in PF tonen, bijvoorbeeld veroorzaakt door expressie van verschillende aquaporinegenen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van cellulaire membraanfysiologie te beantwoorden, zoals de regulatie van de functie van aquaporine. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de waterdoorlaatbaarheid van plantenwaterplanten die ofwel inheems of genetisch gemodificeerd zijn.
Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals een ide blootgestelde oorsprong van belang. Voordat u met deze procedure begint, bereidt u de vereiste isotone en hypertone oplossingen voor en verifieert u hun osmolariteit. Met behulp van een osmolometer moet de osmolariteit van elke oplossing binnen 3% van de doelwaarde liggen.
Vul een 10 centimeter Petrischaal met ongeveer zes druppels isotone oplossing. Schil de ABBA-seal of laat een konijn opsys-bladepidermis zakken en snijd het geschilde blad in vierkantjes van ongeveer vier bij vier millimeter. Plaats de kleine stukjes op de druppels isotone oplossing met de blootgestelde axiale zijkant naar beneden en raakend aan de oplossing.
Los vervolgens 5,7 milligram van de enzymmix op in 165 microliter isotone oplossing in een 1,5 milliliter buis en meng voorzichtig door pipetteren gedurende een minuut of zo totdat het is opgelost. Plaats verschillende vergelijkbare druppels van de enzymatische oplossing in dezelfde Petrischaal. Breng de bladstukken over op de enzymatische oplossing. Druppels.
Sluit de schaal en verzegel het deksel met een ronde perfil. Drijf de schaal in een waterbad ingesteld op 28 graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg na 20 minuten nog meer druppels van de isotone oplossing toe aan de schaal met behulp van een pincet.
Til elk bladstuk op aan de rand om het over te brengen naar een nieuwe isotone oplossing. Drup en vervolgens achtereenvolgens naar een tweede druppel. Schud het bladstuk in de tweede druppel om de protoplasten los te maken met behulp van een afgesneden 100 microliter pipettip. Verzamel de druppels met de protoplasten in een 1,5 milliliter buis.
Bereid het profusiesysteem voor door één kolom te vullen met de isotone oplossing en een andere kolom met de hypotone oplossing. Open de klep om wat hypotone oplossing te laten stromen om de buis helemaal tot aan het inlaatspruitstuk te vullen. Nadat u zich ervan hebt verzekerd dat er geen luchtbellen zijn opgesloten, sluit u de klep.
Herhaal dit voor de isotone oplossing. Verzegel een dekglas met siliconenvet om een bodem voor de kamer binnen de plexiglasdia te maken om de kamerbodem plakkerig te maken voor protoplasten, bedek hem met protaminesulfaat of poly L lysine met een positieve lading. Gebruik een pipettenpunt om deze lijm over het dekglas te verspreiden.
Wacht een tot twee minuten. Spoel drie tot vier keer af met de isotone oplossing en schud de resterende oplossing weg. Vul de kamer op met de isotone oplossing.
Gebruik vervolgens een afgesneden pipettip om een druppel protoplasten bevattende oplossing toe te voegen aan de kamer. En wacht drie tot vier minuten tot de protoplasten zijn bezonken. Bedek de kamer met een transparant deksel dat de oplossingsoppervlakte raakt.
Vermijd het vangen van luchtbellen eronder. Plaats een dia voorzichtig op een omgekeerde microscooptafel en sluit deze aan op het profusiesysteem en de pomp ter bescherming tegen luchtbellen in de buis. Schakel de isotone oplossingsstroom in voor constante profusie met een snelheid van één milliliter per minuut.
Voor het opnemen van volumeveranderingen, kies een weergaveveld met zoveel mogelijk bolvormige cellen en met een goed scherp gefocuste celcontour op hun grootste omtrek. Neem een 62e video op van geselecteerde onbeweeglijke protoplasten met een snelheid van één beeld per seconde of één hertz. Begin met opnemen met een 15 seconden wassen van de isotone oplossing en schakel over naar de hypertone oplossing gedurende 45 seconden.
Sla de film op in Tiff-formaat om een reeks afbeeldingen van een zwellende cel te analyseren, gebruik de Image Explorer en protoplasten-analyzer plugins in de image J-software. Start image J. Om de film te openen, klikt u op bestand op het Image J-paneel, vervolgens achtereenvolgens op de vervolgkeuzemenu's zoals ze zich ontvouwen importeren. Vervolgens beeldverkenner.
Markeer de gekozen film. Klik er met de rechtermuisknop op en vervolgens met de linkermuisknop. Klik op protoplasten-analyzer.
Gebruik op de eerste afbeelding de muis om cirkels rond de geselecteerde protoplasten te tekenen. Klik vervolgens op oké. In de tabel met detectieparameters die verschijnt om het detectiealgoritme van protoplasten te starten, klikt u op lokaal op het bovenste paneel van de protoplastenafbeelding.
Vervolgens verwerken. In het vervolgkeuzemenu, onderzoek de groene cirkels rond de geselecte
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt de meting van de osmotische waterpermeabiliteitscoëfficiënt (P f ) in protoplasten van plantencellen om de functie van aquaporines te begrijpen. Het proces omvat het isoleren van protoplasten en het analyseren van hun volumeverandering onder osmotische omstandigheden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Celphysiologie
- Watertransportmechanismen
Achtergrond
- Aquaporines (AQPs) zijn integrale membraaneiwitten die het watertransport faciliteren.
- Het begrijpen van P f kan inzicht bieden in de cellulaire waterregulatie.
- Protoplasten zijn nuttige modellen voor het bestuderen van het gedrag van plantencellen.
- Osmotische uitdagingen kunnen meetbare volumeveranderingen in protoplasten induceren.
Doel van de studie
- Om de osmotische waterpermeabiliteits-coëfficiënt (P f ) van plantenprotoplasten te bepalen.
- Om de rol van aquaporines bij watertransport te onderzoeken.
- Om een methodologisch kader te bieden voor toekomstige studies naar celpermeabiliteit.
Gebruikte methoden
- Isolatie van protoplasten uit bladweefsel.
- Incubatie in enzymatische oplossingen om de vorming van protoplasten te vergemakkelijken.
- Meting van volumeveranderingen tijdens osmotische uitdagingen.
- Numerieke analyse van de snelheden van volumeveranderingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levensvatbare protoplasten uit plantenbladeren.
- Kwantitatieve gegevens over de osmotische waterpermeabiliteits係数 (P f ).
- Inzichten in de regulatiemechanismen van aquaporines.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode voor het bestuderen van celpermeabiliteit.
Conclusies
- De studie biedt een betrouwbare methode voor het bepalen van P f in protoplasten van planten.
- De resultaten verbeteren het begrip van de aquaporinefunctie in plantencellen.
- Dit onderzoek kan dienen als basis voor toekomstige studies naar watertransportmechanismen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het meten van de osmotische waterpermeabiliteitscoëfficiënt (Pf) in geïsoleerde protoplasten biedt een kwantitatieve readout van aquaporine-gemedieerde watertransporten, wat mechanische risicoreductie van membraaneiwittargets in vroege discovery mogelijk maakt. Deze assay ondersteunt targetvalidatie door genetische of farmacologische modulatie van aquaporines te koppelen aan functionele waterflux, wat go/no-go-beslissingen in programma's die gericht zijn op ionkanalen en transporters informeert. De methode biedt voorspellende zekerheid over target-engagement door een directe correlatie tussen eiwitexpressie en het biofysische fenotype.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door veranderingen in de waterpermeabiliteit bij aquaporine-modulatie te kwantificeren.
- Operationele waarde: Biedt een functionele read-out die targets minder risicovol maakt door biologische activiteit in een native-achtige membraancontext te bevestigen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt het voorspellende vertrouwen in target-validatie via dosisresponsieve Pf-veranderingen die gecorreleerd zijn met eiwitexpressieniveaus.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, tijdsonderzochte gegevens over volumeveranderingen die geschikt zijn voor hit-bevestiging in screenings van membraaneiwitten.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare metingen via geautomatiseerde perfusie en curve-fitting (PfFit) voor consistentie tussen verschillende laboratoria.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt screening gereed door een detecteerbare fenotypische respons op osmotische uitdaging in geïsoleerde sferische cellen te definiëren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de afstemming van translationele biomarkers door Pf-verschuivingen te koppelen aan aquaporine-activiteit in ziekterelevante cellulaire modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt preklinische continuïteit door een geconserveerd assay-formaat te bieden dat toepasbaar is op plant-, oocyten- en potentieel mammale sferoïde-systemen.
- Wetenschappelijke waarde: Informeert risicogebaseerde beslissingen over verdere voortgang door een mechanische link vast te stellen tussen targetmodulatie en fysiologische output.
Integratie van pipeline en workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-engagement screening tot lead-optimalisatie, waarbij functionele validatie van membraaneiwitten voorafgaat aan geneesmiddelchemische inspanningen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door aquaporine-expressie te correleren met osmotische waterpermeabiliteit als directe functionele readout.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gestandaardiseerde protoplastisolatie, perfusiesturing en videogebaseerde zwelkinetiek.
- Analytics: Levert kwantitatieve Pf-waarden via MATLAB-gebaseerde curve fitting (PfFit), waardoor vergelijking van condities en verbindingen mogelijk is.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit via geconserveerde principes van watertransport die van toepassing zijn op niet-plantaire sferische cellen zoals oocyten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor karakterisering van membraanproteïnen via biofysische fenotypering in geïsoleerde cellen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie door directe meting van aquaporine-gemedieerde waterflux.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde perfusieprotocollen en geautomatiseerde beeldanalyse.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit in de farmacologie van membraaneiwitten.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van bevestigde target engagement in een fysiologische context.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in plantencelisolatie, enzymatische protoplastbereiding en viability-beoordeling via microscopie.
- Instrumentatie voor gecontroleerde perfusie, geïnverteerde microscopie en high-speed videocapture bij 1 Hz.
- Analytische infrastructuur voor beeldbewerking (ImageJ), datasortering en MATLAB-gebaseerde curve-fitting (PfFit).
- Aanpassingen voor niet-plantaardige sferische cellen (bijv. oocyten) waarbij aanpassingen in de kamercoating en osmolariteitsbereiken vereist zijn.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in de protoplastopbrengst en de noodzaak van osmolaliteitsverificatie binnen 3% van de doelwaarden voor de validiteit van de assay.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
2:10
Isolation of Arabidopsis Mesophyll Protoplasts
4:13
The Hypotonic Challenge Assay: Arabidopsis Mesophyll Cell Swelling
6:36
Analysis of Cell Volume Change Using ImageJ
8:12
Modling the Rate of Osmolarity Change in the Experimental Chamber Using ImageJ and the Matlab Program PfFit
11:11
Determining the Pf Using the Matlab Fitting Program PfFit
12:30
Results: Determination of the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) in Plant Protoplasts
13:37
Conclusion
