Name: Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P F) Van Sferische Cellen: Isolated plantenprotoplasten als voorbeeld (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Leer de osmotische waterdoorlaatbaarheid (P_f) meten in geïsoleerde plantenprotoplasten om aquaporinefunctie te onderzoeken. Deze methode biedt inzicht in watertransportmechanismen in plantencellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FNRS), de Interuniversitaire Attractie Polen Programma-Federaal Wetenschapsbeleid en de &quot;Communaute française de Belgique-acties de Recherches Concertées&quot; om FC, uit de Israel Science Foundation Jeruzalem ( ISF) naar MM (Grant # 1311-1312), en NM (Grant # 1312-1312).

1 Voorbereiding van Solutions <ol><li> Bereid isotoon (600 mOsm) en hypotone (500 mOsm) oplossingen bevattende 10 mM KCl, 1 mM CaCl2 en 8 M 2-(N-morfoline) -ethanesulphonic zuur (MES), pH 5,7 en een osmolariteit passen aan de geschikte hoeveelheden D-sorbitol: 540 mm voor de isotone en 440 mm voor de hypotone oplossing. Controleer de osmolariteit van de oplossing (binnen 3% van de doelwaarde) met een osmometer. </li><li> Bereid een droge voorraad &quot;enzymatische mengsel&quot; met de volgende enzymen: cellulase 0,55 g, 0,1 g pectolyase, 0,33 g polyvinylpyrrolidon K 30, 0,33 g BSA (zie tabel 1 hieronder), meng de droge poeder door vortex, maak 5,7 mg aliquots en bewaren bij -20 ° C. </li></ol> 2 Isolatie van Arabidopsis mesofyl Protoplasten <ol><li> Bereid een Petrischaal (10 cm) met ongeveer 6 druppels (ca.. 30 pi elk) isotone oplossing. </li><li> Schil de abaxiale (lagere) Arabidopsis bladepidermis, cut de geschilde blad in vierkanten van ongeveer 4 x 4 mm 2, leg dan de vierkantjes op de isotone oplossing druppels met de blootgestelde abaxiale kant naar beneden, de oplossing te raken. </li><li> Los 5.7 mg van het enzymmengsel in 165 ul isotone oplossing (3,3% w / w) in een 1,5 ml buis, meng voorzichtig door pipetteren van een minuut tot opgelost en door diverse soortgelijke dalingen van de enzymatische oplossing dezelfde Petri dish. </li><li> Breng de bladdelen op de enzymatische oplossing daalt, sluit de schaal afdichten van de klep met een ronde parafilm en incubeer gedurende 20 min, drijven de schotel in een waterbad op 28 ° C. </li><li> Voeg enige druppels van de isotone oplossing van de schaal (2 druppels per elke enzymoplossing druppel). Breng elk blad stuk in nieuw isotone oplossing druppel dan achtereenvolgens een tweede druppel (de enzymatische oplossing wegspoelen). Til het stuk bij de rand met behulp van een tang, schud het in de tweede drop (zoals een theezakje) om de protoplasten los.Verzamel de druppels met de protoplasten (met behulp van een afgeknipt 100 ul pipet tip) in een 1,5 ml tube. </li></ol> 3 De Hypotone Challenge Assay: Arabidopsis mesofyl celzwelling <ol><li> Bereid de perfusie-systeem (figuur 1A) door het invullen van een kolom met de isotone oplossing en een andere kolom met de hypotone oplossing. Open de klep, laat enkele oplossing flow (eerst de hypotone, dan is de isotone) om de slang naar het inlaatspruitstuk (Figuur 1B) vult de hele weg. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen en sluit de klep. </li><li> Seal een dekglaasje, met siliconenvet (tabel 1), een bodem voor de kamer in de plexiglas slide maken (Figuur 1B, zie ook het schema van de kamer in figuur 1C). Naar de kamer beneden &quot;sticky&quot; voor protoplasten, jas maken (de opwaartse gerichte blootgestelde oppervlak van het dekglaasje binnen het vet ring) hetmet positieve-ladingdragende protaminesulfaat (1% in water; tabel 1) of poly-L-Lysine (0,1% in water; tabel 1). Spreid deze &#39;lijm&#39; over het dekglaasje met een pipet tip, wacht 1 - 2 min, spoelen 3 - 4 maal met de isotone oplossing en schud weg de resterende oplossing. </li><li> Vul de kamer met de isotone oplossing. Vervolgens voegt u een druppel protoplasten bevattende oplossing voor de kamer, met een afgeknipt pipettip en wacht 3-4 minuten voor de protoplasten te vestigen. Bedek de kamer met een doorzichtig deksel (figuren 1D, 1E) aanraken van de oplossing oppervlak (vermijd luchtbellen onder). </li><li> Plaats de schuif (zachtjes!) Op een omgekeerde microscoop tafel, sluit deze aan op de perfusie-systeem en de pomp (bewaken tegen luchtbellen in de leidingen!) En zet de isotone oplossing stroom voor constante perfusie bij 1 ml / min (hogere snelheden kunnen worden gebruikt, tot 4 ml / min). </li><li> Voor het opnemenvolume verandert, wordt een omgekeerde microscoop gebruikt, met een 20X objectief en met een CCD-videocamera die is aangesloten op een PC. Gebruik de &#39;CMU 1394 Camera Driver&#39; plugin van de ImageJ software (zie de tabel van specifieke materialen voor het downloaden adressen van deze twee software stuks) om een ​​60 seconden video filmpje van geselecteerde immobiele protoplasten opnemen (vermoedelijk, die vast aan de onderkant) met een snelheid van 1 image / sec (1 Hz). Start de opname met 15 sec wassen van de isotone oplossing (dit betekent dat de basislijn), naar het hypotone oplossing 45 seconden (in totaal 60 seconden vanaf het begin van perfusie in). Sla de film in TIF-formaat. OPMERKING: Kies een veld oog met zoveel cellen mogelijk, voldoen aan de volgende criteria: bolvormig en met een goed gerichte cel contour op hun grootste omtrek (Figuur 2A). </li></ol> 4 Analyse van de Cel Volume wijzigen met ImageJ OPMERKING: Om het analyserenreeks beelden van een zwelling cel, gebruik dan de &#39;Beeld Explorer&#39; en &#39;Protoplast Analyzer&#39; plugins in de ImageJ software (geschreven door Xavier Draye) 14. Beginnend met de gekozen protoplasten bij hun eerste tijdstip, zal het &quot;Protoplast Analyzer&quot; plugin automatisch de protoplasten randen (contouren) detecteren en bereken het tijdsverloop van de gebieden in het experiment (plugins zijn beschikbaar met de PfFit analyseprogramma hieronder) . <ol><li> Start ImageJ. Om de film te openen, klikt u op &#39;Bestand&#39; op het paneel ImageJ, daarna achtereenvolgens op de dropdown menu&#39;s als ze zich ontvouwen: &#39;Import&#39; dan &#39;Afbeelding Explorer&#39;. Markeer de gekozen film, klik met de rechtermuisknop op te klikken en vervolgens met de linkermuisknop op &#39;Protoplast Analyzer&#39;. Blader door de film (met behulp van een schuifknop aan de protoplasten afbeelding onderaan) om protoplasten die grotendeels immobiel blijven tijdens het experiment te identificeren - deze zullen worden geanalyseerd. Terug op de eerste image, met behulp van de muis, trek cirkels (geplukt uit de ImageJ tekengereedschappen) rond de geselecteerde protoplasten (figuur 2B), en klik vervolgens op &#39;OK&#39; in de tabel &#39;Detection parameters&#39; dat verscheen. </li><li> Om de protoplast- detectiealgoritme lanceren, klik op &#39;Local&#39; op de protoplast- afbeelding bovenpaneel, vervolgens &#39;Proces&#39; in het dropdown menu. Onderzoek de groene cirkels rond de geselecteerde protoplasten (figuur 2C) in de hele film. Sla het &#39;resultaat&#39; in een Excel-bestand. Quit ImageJ. OPMERKING: In het geval verschijnt een rode stip (een slechte contour pasvorm geven - meestal te wijten aan een slecht imago contrast), opnieuw uit te voeren met verschillende parameters. </li><li> De leidingen van elke cel scheiden (- indien twee of meer cellen tegelijkertijd geanalyseerd - die worden verweven, omdat de analyse uitgevoerd frame voor frame), in Excel, de opgeslagen gegevens door het kolomnummer cellen (&#39;object&#39; ). </li><li> Aan Determine de pixel-voor-um omzettingsfactor voor het verkrijgen van de werkelijke waarde van P f, snap een afbeelding van een micrometer liniaal via dezelfde 20X microscoopobjectief. Sleep een lijn (geplukt uit de ImageJ tekentools) langs imago van de heerser en lees het aantal pixels gelijk aan de heerser lengte aan de onderkant van het hoofdpaneel ImageJ. Zetten de willekeurige pixelgebied waarden in het Excel-bestand in micrometer 2. Sla de gebieden tijdsverloop (voor elke cel afzonderlijk) als een tekstbestand (twee kolommen met getallen alleen). OPMERKING: Dit zal een ingang aan de volume-fitting programma &#39;PfFit&#39; zijn. </li></ol> 5 Modelleren van de Rate of Change Osmolariteit in de experimentele kamer met behulp van ImageJ en de Matlab-programma P f Fit <ol><li> Voeg 2 mg xyleencyanol (tabel 1, hieronder) tot 100 ml van de isotone oplossing (de &#39;indicatorkleurstof&#39; produceren). </li><li> Bereid de perfusie-systeem (zoals in 3.1) met de indicator Dye en de niet geverfde hypotonic oplossing. </li><li> Zegel een dekglas met siliconen vet op de bodem van de kamer van plexiglas, dan voorzichtig vullen de kamer met de Indicator Dye, bedek het met een dekglaasje (net als bij de protoplasten vóór) en plaats het op de microscoop podium. </li><li> Sluit de kamer naar de perfusie-systeem en de pomp, en zet de indicator Dye flow voor een constante perfusie bij l ml / min. </li><li> Het opnemen van een 60 sec film met een snelheid van 1 Hz. Start de opname met 15 sec van Indicator Dye, schakelen naar de hypotone oplossing voor 45 sec. Stop met filmen. Gelijk met de Indicator Dye (minimaal 30 seconden), daarna start een nieuwe film. Herhaal ongeveer 5-6 keer en bewaar alle films </li><li> Gebruik de ImageJ software om de videobeelden van de indicatorkleurstof transmissie analyseren een gemiddelde tijdsverloop van de veranderende transmissie verkrijgen. <ol><li> Start ImageJ, klik op &#39;Bestand&#39; en vervolgens &#39;Open&#39;, en blader naar de film. Voor elke film, trek je een 10 pixel brede verticalerechthoek overal op de 1 ste beeld van de film. Klik op &#39;Beeld&#39; op het hoofdpaneel ImageJ, klik dan op &#39;Crop&#39; in het dropdown menu. </li><li> Om de 60 frames (van de 60 sec film) sluiten in een rij, klik nogmaals &#39;Beeld&#39; en klik achtereenvolgens in de dropdown menu&#39;s als ze zich ontvouwen: &#39;Stacks&#39; en &#39;Make Montage&#39; (kolommen 60, rij 1). Teken een 1 pixel hoge horizontale rechthoek overal langs de hele rij van beelden en klik op &#39;Analyseren&#39; in het hoofdpaneel ImageJ, klik dan op &#39;plot profiel&#39; in het dropdown menu. NB: Een &#39;Perceel van Montage&#39; venster verschijnt (niet getoond), en een lijst van de transmissie van gegevens kan worden geopend vanuit het menu. Elk beeld van de film is vertegenwoordigd in deze lijst met 10 transmissiewaarden uit haar 10 pixels breed rechthoek en dus ook de &quot;time basis&quot; (het beeld volgnummer) is 10 keer langer mee. </li><li> Kopieer de lijsten van de transmissie DATeen (een lijst per film) naar een Excel-bestand. Het gemiddelde van de transmissie tijdsverloop verkregen uit de verschillende films van de Indicator Dye flushes. Genereer een real-time basis door het beeld volgnummer vermenigvuldigen met 0,1. Sla het gemiddelde tijdsverloop (twee kolommen) naar een tekstbestand. OPMERKING: Voordat middeling, indien gewenst, plot de individuele tijd cursussen, om eventuele onregelmatigheden te weigeren. Zorg ervoor dat de film bevat minstens 5 laatste seconden van de steady-state-transmissie van de Indicator Dye. </li></ol></li><li> Start het Matlab fitting programma P f Fit (het &quot;Indicator Fit&quot; paneel, figuur 3) van de verschillende parameters van de osmolariteit tijdsverloop berekenen. OPMERKING: gebaseerd op de bekende aanvankelijke en eindwaarden van de oplossing in het bad, wordt het tijdsverloop van de verandering osmotische concentratie van de oplossing berekend uit de concentratie tijdsverloop (berekend beurt de indicatorkleurstof transmissie), zo deze volgt dezelfde dynamiek als dekleurstofconcentratie. P f Fit is een programma beschikbaar voor gratis gebruik. De &#39;PfFit_Installer_web.exe&#39; kan worden gedownload van: P f Fit User Guide &#39;met gedetailleerde uitleg en definities is bereikbaar via Jupiter als een aanvullend bestand, dat helpt om de gebruiker met de P f Fit programma vertrouwd. </li><li> In het &quot;Indicator Fit&quot; paneel importeren de gegevens van de gemiddelde tijdsverloop van de indicatorkleurstof transmissie (Indicator gegevensbestand, figuur 3A) en plaats handmatig huidige experiment parameters en de initiële gissingen van de parameters &quot;breedte&quot; en &quot; t_half &#39;het tijdsverloop van de Indicator Dye concentratie (Figuur 3B beschrijven. Klik op&#39; Uitvoeren &#39;om de percelen van het tijdsverloop van de Indicator Dye concentratie (echte gegevens en fit, figuur 4A) te bekijken, en van de gemodelleerde (berekend) bad osmolariteit (Figuur 4B). OPMERKING: agood fit aan de gegevens onontbeerlijk (aanbeveling: begin met de in figuur 3 waarden). </li></ol> 6 Het bepalen van de P f met behulp van de Matlab Fitting Program P f Fit OPMERKING: Naast de uitgangspunten met betrekking tot het gedrag van een protoplast als ware en volmaakte osmometer 11, de bepaling van P f berust op de veronderstelling dat Pf kan veranderen met de tijd, dat deze dynamiek van P f grondslag tijd Tijdens het celvolume veranderingen en dat drie parameters voldoende te beschrijven: P fi (de beginwaarde van P f) Helling Pf (het percentage van de lineaire verandering van P f) en Delay (de periode vanaf het begin van het bad osmolariteit verandering tot het begin van de cel volumeverandering). Verschillende modellen kunnen worden getest, waaronder verschillende combinaties van deze parameters en hun waarden, met inbegrip van null-waarden 11. P <sub&gt; f Fit zoekt de beste combinatie van deze parameters ter verkrijging - berekent - de meest getrouwe weergave van de experimentele tijdsverloop van de cel volumeverandering 11 berekend op zijn beurt uit de ingevoerde reeks van cel-contour gebieden (zie ook de Aanvullende &#39;P f Fit Handleiding&#39;). <ol><li> Schakel over naar de &#39;Volume Fit&#39; (zie figuur 5). Kies voor invoer in het gebied gegevensbestand (het tekstbestand met het tijdsverloop van de &quot;gebieden&quot; van de geanalyseerde protoplasten figuur 5A). Kies &#39;Laatste Indicatorfitting&#39; als de parameter source (figuur 5B, zie de &#39;P f Fit User Guide&#39; voor alternatieven). Opmerking: Deze parameters (figuur 5D) worden dan gebruikt om de osmoticum verandering in het bad voor de volumes montage procedure regenereren. </li><li> In de &#39;Volume Fit&#39; (zie figuur 5C), initialiseren (in de initiële schattingen van) de P f-parameters in te vullen: P f, Helling Pf en Delay (een aanbeveling: beginnen met 1, 1, en ​​30, respectievelijk), koos het model &#39;Class&#39; (aanbeveling: begin met II en mark &#39;checks&#39; voor alle drie de parameters te worden gemonteerd). Klik op &#39;Uitvoeren&#39;, dan oogbol de interim-figuur (Figuur 5E) en indien nodig de parameter Delay en de lengte van de plaat, aan te passen. </li><li> Onderzoek de resultaten grafiek (figuur 6) om de pasvorm kwaliteit evalueert en noteer de fit fout. Verander het initialiseren van parameters een paar klappen elk, en re-&#39;Run &#39;. LET OP: Laat je niet ontmoedigen als het programma loopt vast - gewoon het programma opnieuw te starten! </li><li> Herhaal deze procedure meerdere malen, te beginnen met verschillende combinaties van initialisatie parameters, streven naar de laagste waarde van de fit fout. </li><li> Kopieer de lijst van de fit resultaten direct van het scherm, of ze vinden in thij PfFit-generated &#39;_FIT_Vol_Results.txt&#39; bestand. </li></ol>

<ol><li>Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+multifunctional+water+and+solute+channels+with+expanding+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles.</a> Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).</li>
<li>Maurel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+Novel+functions+and+regulation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Letters%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties.</a> Febs Letters. 581, 2227(2007).</li>
<li>Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+Membrane+channels+with+multiple+integrated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 595(2008).</li>
<li>Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plant+aquaporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Of+The+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of plant aquaporin activity.</a> Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).</li>
<li>Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+water+permeability+of+isolated+protoplasts.+Modifications+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development.</a> Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).</li>
<li>Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+aquaporin+levels+among+cell+types+of+radish+and+measurement+of+osmotic+water+permeability+of+individual+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts.</a> Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).</li>
<li>Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bundle-sheath+cell+regulation+of+xylem-mesophyll+water+transport+via+aquaporins+under+drought+stress%3A+a+target+of+xylem-borne+ABA%3F%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?</a> The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).</li>
<li>Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+quantification+of+plasma+membrane+aquaporin+expression+in+maize+primary+root%3A+A+clue+to+understanding+their+role+as+cellular+plumbers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers.</a> Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).</li>
<li>Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+pattern+of+plasma+membrane+aquaporins+in+maize+leaf+highlights+their+role+in+hydraulic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation.</a> Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).</li>
<li>Besserer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+maize+plasma+membrane+aquaporin+trafficking+and+activity+by+the+SNARE+SYP121%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121.</a> The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).</li>
<li>Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+osmotic+water+permeability+of+protoplast+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane.</a> Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).</li>
<li>Moshelion, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+water+permeability+and+aquaporin+expression+increase+during+growth+of+maize+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells.</a> Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).</li>
<li>Sade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+plant+stress+tolerance+and+yield+production%3A+is+the+tonoplast+aquaporin+SlTIP2%3B2+a+key+to+isohydric+to+anisohydric+conversion%3F%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?</a> New Phytologist. 181, 651-661 (2009).</li>
<li>Volkov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+permeability+differs+between+growing+and+non-growing+barley+leaf+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues.</a> J. Exp. Bot. 58, 377(2007).</li>
<li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).</li>
<li>Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+localisation+and+electrophysiological+characterisation+of+ion+channels+heterologously+expressed+in+a+plant+context%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context.</a> Plant Methods. 19, (2005).</li>
<li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Recombinant+Type+I+Collagen+Produced+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants.</a> Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Hier beschreven is een eenvoudige en zeer efficiënte procedure voor het meten van de P f van geïsoleerde plantenprotoplasten in principe ook toepasbaar op andere bolvormige cellen, bijvoorbeeld., Kikker eicellen 11. Deze methode is gebaseerd op het meten van de P f in reactie op een osmotische uitdaging voor de cel. In tegenstelling tot de andere methoden op basis van deze benadering is echter de verandering van oplossingen, dat wil zeggen van de osmolariteit, niet onmi...

Opname van water en stroom over cellulaire membranen is een fundamentele vereiste voor planten bestaan ​​op zowel de cellulaire en de hele plant niveaus. Op cellulair niveau, aquaporines (AQPs) spelen een belangrijke rol in de regulatie van de osmotische waterdoorlatendheid coëfficiënt (P f) van de celmembraan 1-3. Tot op heden zijn verscheidene werkwijzen toegepast bij het ​​meten van de endogene P f protoplast van verschillende plantenorganen (bijvoorbeeld wortels, mesofyl, endodermis, etc., Beoordeeld door Chaumont et al. 4). Een van de benaderingen P f meten is de protoplasten blootgesteld aan een osmotische uitdaging en de initiële snelheid van de volumeverandering monitor (dwz. De helling van het eerste lineaire fase van de volumeverandering). Twee verschillende methoden eerder beschreven op basis van deze aanpak, beide betrokken op het direct uitwisselen van oplossingen. De eerste bestaat uit immobilizing de protoplast met een zuig micropipet en schakelen de vloeistoftoevoer 5 en de tweede overdracht van de protoplast van de ene naar de andere oplossing met een micropipet 6. Deze micropipet zuig en micropipet overdracht methoden die beeldacquisitie aan het begin van de snelle oplossing uitwisseling mogelijk maakt (naar de eerste lineaire fase van volumeverandering vangen), zal leiden tot een fysieke stress protoplasten en vereisen gespecialiseerde apparatuur en expert micromanipulatie. De hier beschreven methode minimaliseert de verstoring van de cellen, omvat geen micromanipulatie en maakt afleiding van P f bij het ​​bad perfusie niet onmiddellijk. Na de enzymatische vertering, de protoplasten, ondergedompeld in een isotone oplossing, worden geïmmobiliseerd op het dekglaasje-glazen bodem van een plexiglas (aka Lucite of perspex) kamer door lading interactie. Vervolgens, tijdens een constante bad perfusiede isotone oplossing wordt weggespoeld door een hypotonische oplossing genereren van een hypoosmotic uitdaging voor de protoplasten. De zwelling van de protoplast is video opgenomen en vervolgens, door het combineren van de informatie over het tijdsverloop van het bad perfusie en het tijdsverloop van de cel zwelling wordt de P f bepaald door beeldverwerking en curve fitting procedures. De voordelen van deze methode zijn dat de experiment is zeer efficiënt, Het is mogelijk om enkele cellen kan waarnemen in een enkele assay, en dat het geen speciale apparatuur of bijzondere micromanipulatie vaardigheden. Verschillende toepassingen voor deze methode mogelijk. Bijvoorbeeld, bepaling van de natieve P f van een verscheidenheid van cellen van verschillende weefsels en planten, zoals mesofyl en bundelschede cellen van Arabidopsis leaf 7, maïs bladmesofylcellen of wortelcortex cellen 8-10 of suspensie gekweekte cellen 11,12. In additiop, is het mogelijk om P f bolvormige dierlijke cellen te bepalen zoals eicel cellen 11. Een ander voorbeeld betreft onderzoek AQP-activiteit door tijdelijke expressie van het gen in de protoplasten (of andere genen die deze kunnen beïnvloeden, bijvoorbeeld genen kinasen) en bepaling van hun bijdrage aan P f; bijvoorbeeld expressie van tomaat AQP SlTIP2; 2 in Arabidopsis mesophyll protoplasten door PEG transformatie en de vastberadenheid van de SlTIP2; 2-gerelateerde P f 13. Tenslotte onderzoek van het effect op P f van verschillende moleculen / stoffen (drugs, hormonen, etc.) aan de oplossingen toegevoegd kan worden onderzocht, bijvoorbeeld van de AQP blocker HgCl2 7. Het volgende protocol beschrijft de isolatie van protoplasten van Arabidopsis mesofylcellen en bepaling van de P f.

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247-1</td><td><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> Any source, anal. grade</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>11718006</td><td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> Any source, anal. grade</td></tr><tr><td>2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td><td>Sigma</td><td>15152002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>18032003</td><td>http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td><td>LS002603</td><td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Karlan,&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Phonix, AZ, USA</td><td>8006</td><td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td></tr><tr><td>Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)</td><td>Sigma</td><td>81420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Bovine Serum Albumin (BSA)</a></td><td>Sigma</td><td>A9418-5G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Protamine sulphate</td><td>Sigma</td><td>P4380</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Xylene cyanol</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Silicone vacuum grease heavy</td><td>Merck</td><td>107921</td><td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA</a></td></tr><tr><td>Inverted microscope&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100/TS100F</td><td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>BIO-RAD</td><td>EP-1 Econo&nbsp;Pump</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Grayscale digital camera</td><td>Scion Corporation</td><td>CFW-1308M</td><td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td></tr><tr><td>CMU 1394 Camera Driver&rsquo; plugin for ImageJ</td><td>Carnegie Mellon</td><td></td><td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> Gratis software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> Gratis software</td></tr><tr><td>Econo Gradient Pump Fittings Kit</td><td>BIO-RAD</td><td>731-9006</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Connectors, manifold</td><td>DirectMed</td><td></td><td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td></tr><tr><td>Burette infusion sets (columns)</td><td>Welford</td><td>IF-BR-001</td><td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td></tr><tr><td>Tubing</td><td>TYGON</td><td>R-3603</td><td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td></tr><tr><td>3M packaging Scotch tape 1'', clear</td><td>Viking Industrial, UK</td><td>VKMONO25</td><td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8</a> any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK</td></tr></tbody></table>

het meten van de osmotische waterdoorlaatbaarheid (p<sub&gt; f</sub&gt;) van sferische cellen: isolated plantenprotoplasten als voorbeeld

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studeren AQP regulatiemechanismen is cruciaal voor het begrip van water relaties bij zowel de cellulaire en de hele plant niveaus. Hier voorgesteld is een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor de bepaling van de osmotische water permeabiliteit coëfficiënt (P f) in plantenprotoplasten, in principe ook toepasbaar op andere sferische cellen zoals kikker oocyten. De eerste stap van de assay is de isolatie van protoplasten uit het plantenweefsel plaats door enzymatische digestie in een kamer met een geschikte isotone oplossing. De tweede stap bestaat uit een osmotisch challenge test: protoplasten geïmmobiliseerd op de bodem van de kamer wordt onderworpen aan een constante perfusie start met een isotone oplossing en vervolgens een hypotone oplossing. De cel zwelling is video opgenomen. In de derde stap worden de beelden offline bewerkt om volumeveranderingen opleveren, en het tijdsverloop van de volumeveranderingen samenhangt met het tijdsverloop van de verandering in osmolaligheid van de kamer perfusie medium, met behulp van een curve fitting procedure geschreven in Matlab (de &#39;PfFit&#39;), naar P f opleveren.

Om de P f bepalen en vergelijken van de activiteit van verschillende AQPs worden mesofyl protoplasten van Arabidopsis leaf gebruikt. Deze protoplasten bleken lage basale (achtergrond) P f niveaus 7 en kan dienen als een functionele expressiesysteem reproduceerbare P f maatvoering. Protoplasten van een volwassen blad van een 6 weken oude Arabidopsis planten werden geïsoleerd en drie gen-constructen met AQP genen van Arabidopsis (AtPIP2; 1) ...

Het meten van de osmotische waterdoorlatendheid coëfficiënt (P f) van de cellen kan helpen begrijpen van de regelgeving van aquaporines (AQPs). F bepaling P sferische plantencel protoplasten gepresenteerde omvat protoplasten isolatie en numerieke analyse van de initiële snelheid van volumeverandering als gevolg van een osmotische uitdaging bij constant bad perfusie.

Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P<sub&gt; F</sub&gt;) Van Sferische Cellen: Isolated plantenprotoplasten als voorbeeld

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om meer te weten te komen over de functie van aquaporines door de osmotische waterdoorlaatbaarheidscoëfficiënt, of PF van plantenprotoplasten te bepalen. Knip een stuk uit een blad zonder axiale epidermis en leg het op een isotone oplossing. Breng de stukken over naar een enzymatische oplossing en incubeer gedurende 20 minuten in 28 graden Celsius, vervolgens naar een verse isotone oplossing.Verzamel vervolgens de protoplasten bevattende oplossing met een afgesneden punt. Als tweede stap, bereid een experimentele kamer voor. Bevestig een dekglas op de bodem van de dia met siliconenvet.Bekleed vervolgens de bodem van de kamer met een lijm met een positieve lading en vul de kamer met een isotone oplossing. Geïsoleerde protoplasten worden vervolgens toegevoegd aan de kamer en de kamer wordt delicaat op de microscooptafel geplaatst. Vervolgens worden de protoplasten blootgesteld aan een hypotone oplossing terwijl video's worden opgenomen om hun zweltijdsverloop vast te leggen.Vervolgens wordt het zweltijdsverloop numeriek geanalyseerd door software, inclusief curvefitting procedures, om de PF van elke protoplast te bepalen op basis van d

measuring-osmotic-water-permeability-coefficient-pf-spherical-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de geoptimaliseerde extractie van apoplastwasvloeistof uit plantenbladeren, waarbij Franse bonenplanten (Phaseolus vulgaris) als modelvoorbeeld worden gebruikt.

De Infiltratie-centrifugeren Techniek voor de extractie van apoplastische Fluid uit bladeren van de planten met behulp van Phaseolus vulgaris Als een voorbeeld

Dit protocol beschrijft het gebruik van uitgesneden darmweefselpreparaten of 'darmzakken' als een ex vivo model van de darmwandfunctie. Dit model kan worden gebruikt om de integriteit van zowel de epitheliale barrière als de slijmvlieglaag op specifieke darmlocaties in diermodellen van spijsverteringsziekten te beoordelen.

Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

Hier wordt een simpele techniek voor de confocal time-lapse beeldvorming van wortel- en hypocotyloplossing met hoge resolutie voor maximaal 3 dagen gegeven met behulp van hoge numerieke diafragma-doelstellingen en perfluorodecaline als onderdompelingsmedium.

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Dit artikel beschrijft praktische methoden om hydrogels te bereiden in vrijstaande films en geïmpregneerde membranen en om hun fysische eigenschappen te karakteriseren, inclusief watertransporteigenschappen.

Synthese van Hydrogels met Antifouling eigenschappen membranen voor waterzuivering

Een methode voor de bepaling van de permeabiliteit in een membraan invoegen systeem voor multi goed platen en in silico parameter optimalisatie voor de berekening van diffusie coëfficiënten met behulp van de simulatie worden gepresenteerd.

Een methode voor de bepaling en simulatie van permeabiliteit en verspreiding in een Model van 3D weefsel in een membraan invoegen systeem voor multi goed platen

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

Hier presenteren we atomaire kracht microscopie (AFM), die wordt gebruikt als een nano-en micro-indentatie tool op cellen en weefsels. Het instrument maakt gelijktijdige verwerving van 3D-oppervlaktetopografie van het monster en de mechanische eigenschappen mogelijk, met inbegrip van de modulus van de celwand Young en de turgor-druk.

Gebruik van atoom kracht microscopie om mechanische eigenschappen en turgor druk van plantencellen en Plantenweefsels te meten

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Dit rapport biedt protocollen voor assemblage, celkweek en assays op het μSiM-platform voor de constructie van bloed-hersenbarrièremodellen.

Gebruik van het MicroSiM (μSiM) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière

Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan ​​dat vergemakkelijkt de behandeling...

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

Leer de osmotische waterdoorlaatbaarheid (P_f) meten in geïsoleerde plantenprotoplasten om aquaporinefunctie te onderzoeken. Deze methode biedt inzicht in watertransportmechanismen in plantencellen.

Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P

Meer video's verkennen