Niet-invasieve evaluatie van cardiale afwijkingen in experimentele autoimmuun Myocarditis door Magnetic Resonance Imaging Microscopy in de muis

Het algemene doel van deze procedure is om functionele afwijkingen van het hart vast te stellen door middel van beeldvorming van de harten in levende dieren die lijden aan inflammatoire hartaandoeningen. Dit wordt bereikt door eerst de ziekte te induceren, bijvoorbeeld myocarditis. De tweede stap is om het dier voor te bereiden op beeldvorming met magnetische resonantie microscopie en het in de dierhouder te plaatsen.

Vervolgens wordt de muis in de magneet geplaatst om de beelden van het hart te verkrijgen. De laatste stap is het analyseren van de cardiale functionele parameters met behulp van de segmentsoftware. Uiteindelijk wordt deze techniek gebruikt om het einddiastolisch volume en de ejectiefractie te berekenen bij muizen met auto-immuunmyocarditis.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals histopathologie is dat deze non-invasief is en een driedimensionaal beeld van het hart met een hoge resolutie biedt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het vakgebied cardiologie met betrekking tot de diagnose van inflammatoire hartaandoeningen. Over het algemeen zullen personen die nog niet bekend zijn met deze methode moeite hebben vanwege een gebrek aan ervaring met de voorbereiding van dieren voor magnetische resonantie micro-beeldvorming.

Daarom is een visuele demonstratie van deze methode cruciaal. Begin dit protocol door eerst een peptide-oplossing te bereiden om auto-immuun myocarditis op te wekken; los cardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 tot 3 52 op in fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg per 1,5 ml. Bereid vervolgens het pertussis-toxine door 1 ml steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing toe te voegen aan een vial met 50 µg gelyofiliseerd pertussis-toxine.

Om een voorraadconcentratie van 50 nanogram per microliter te verkrijgen. Neem vervolgens 20 microliter van de voorraad in een steriele buis van 1,5 milliliter en voeg 980 microliter steriele één x fosfaatgebufferde zoutoplossing toe om een werkconcentratie van één nanogram per microliter te verkrijgen. Bereid daarnaast compleet Freunds adjuvans of CFA voor door 40 milligram mycobacterium tuberculosis, H 37 RV of MTB-extract toe te voegen aan 10 milliliter CFA om een uiteindelijke concentratie van vijf milligram per milliliter te verkrijgen.

Bereid nu de peptide CFA-emulsie voor om een emulsie-aliquot van 1,5 milliliter te maken: doe 750 microliters peptide-oplossing van cardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 tot 3 52 in een buisje van 1,5 milliliter en breng een gelijk volume CFA aangevuld met MTB-extract over in een ander buisje van 1,5 milliliter. Trek vervolgens met een lure lock-spuit van drie milliliter eerst de peptide-oplossing op, gevolgd door het C-F-A-M-T-B-extract. Bevestig de spuit aan een driewegkraan en verbind de andere uitlaat van de kraan met een lege spuit van drie milliliter.

Stel de opening van de stopkraan in, zodat het peptide-CFA-mengsel met een redelijk goede weerstand van de ene spuit naar de andere stroomt. Meng door de inhoud gedurende ongeveer één minuut herhaaldelijk van de ene spuit naar de andere te duwen en plaats vervolgens de gehele opstelling ongeveer drie minuten op ijs.

Herhaal deze procedure minimaal 10 keer. Bepaal de consistentie van de emulsie door voorzichtig een klein druppeltje op stilstaand water in een glazen bekerglas van 100 milliliter te plaatsen. De druppel mag niet verspreiden in het water; zo ja, ga door met mengen totdat de gewenste consistentie is bereikt.

Breng de inhoud van de emulsie over van spuiten van drie milliliter naar spuiten van één milliliter. Gebruik hiervoor Luer-lock spuiten door een van de twee spuiten van drie milliliter die aan de driewegkraan zijn bevestigd, te vervangen door de spuit van één milliliter. Bevestig vervolgens een naald van 27,5 gauge.

Injecteer 150 µL van de peptide CFA-emulsie in gesplitste doses subcutaan in de twee liesregio's van vrouwelijke aj.-muizen van zes tot acht weken oud. Dien vervolgens op dag nul en dag twee na de immunisatie 100 µL pertussistoxine-suspensie intraperitoneaal toe aan elk dier. Herhaal de immunisatieprocedure op dag zeven door 150 µL peptide CFA-emulsie in gesplitste doses subcutaan aan weerszijden van het borstbeen toe te dienen.

Bereid deze emulsie vers voor zoals beschreven. Onderwerp de dieren vervolgens op dag 21 aan MRM-beeldvorming. Plaats ter voorbereiding op de beeldvorming elke muis in een inductiekamer voor anesthesie met een mengsel van 2% ISO-fluorine en lucht, voorzien van een warmtemat om de lichaamstemperatuur op peil te houden.

Plaats het dier vervolgens in een speciaal ontworpen dierhouder. Bevestig de kop met een beetstrip om het dier in buikligging te immobiliseren. De snuit moet in de neusmasker passen om de anesthesie in stand te houden.

Zet de luchtverwarming aan met de uitlaatslang in het verticale gat van de scanner geplaatst om de lichaamstemperatuur van het dier tijdens het experiment op peil te houden. Handhaaf de anesthesie op 1 tot 2% isofluraan met een stroomsnelheid van 2 mL per minuut gedurende de gehele imagingsessie. Bevestig de anesthesie door een knijptest bij de teen uit te voeren.

Stel vervolgens een pneumatische kussensensor en een rectale temperatuurprobe in om de ademhaling en de lichaamstemperatuur gedurende de gehele imagingsessie te bewaken. Een glasvezel pulsoximetriesensor moet tevens aan de linkerenkel worden bevestigd en de voet moet met een draadlus worden vastgezet en afgeplakt om de positie te behouden. De beeldvorming zal worden gerealiseerd door gating van de ademhalings- en cardiale signalen zonder gebruik van contrastmiddelen.

Een verticale bore-magneet van 9,4 Tesla met een brede boring moet worden gebruikt om driedimensionale magnetic resonance microscopy-beelden met een hoge resolutie te verkrijgen. Plaats de muis, na voorbereiding van het dier, in de scanner zodanig dat het hart zich in het centrum van het gezichtsveld bevindt. Start vervolgens de imaging-interface, selecteer het menu 'new study type' in de opdrachtbalk, open de tune-pagina en selecteer vervolgens 'start probe', 'tune' en 'autoscale'.

Gebruik de knoppen voor het afstemmen en matchen aan het uiteinde van de spoel om de RF-spoel af te stemmen op de protonresonantie Frequentie van 400 megahertz. Ga vervolgens naar de pre-scanpagina. Om de frequentie- en vermogenskalibratie uit te voeren, drukt u op de x, Y, Z-snelknop om de shimming-pagina te openen.

Selecteer vervolgens alle iteraties en voer auto-shimming uit. Selecteer een scout-sequentie. Wijzig het gezichtsveld naar 35 millimeter.

Behoud de overige standaardinstellingen en start de sequentie. Als het hart niet in het centrum van het gezichtsveld staat, pas dan de positie van de dierenhouder aan, stem de RF-spoel opnieuw af en neem de scout opnieuw op. Selecteer vervolgens de gem-sequentie.

Voer de acquisitieparameters in die hier in het tabblad 'acquire' worden getoond om twee orthogonale vlakken langs de korte en lange as van het hart te verkrijgen. Selecteer vervolgens de cine-sequentie om de pulse-oximetrie-meting van de korte as cine-beelden te verzamelen en meet de anatomische en functionele parameters van de linker ventrikel. Voer de parameters in die hier worden getoond om de gradiënt-echo cine-sequentie te verkrijgen.

Pas de positie en hoek van de beeldvormingscoupes aan op basis van het longaxe-beeld van het hart. Start vervolgens de sequentie. Zodra de beeldvorming is voltooid.

Zet de verkregen beelden om naar DICOM-formaat via het IO-tabblad en transfer de overeenkomstige bestanden naar het datacentrum voor verwerking. Laat het dier aan het einde van de beeldgevingsprocedure herstellen van de anesthesie in een kooi met filtertop. Laat de muis niet onbeheerd achter totdat deze voldoende bij bewustzijn is om de sternale recumbens te behouden.

Hier wordt segment-software gebruikt om de anatomische en functionele parameters van de linker ventrikel te analyseren. Begin met het laden van de cine-beelden in DICOM-formaat in de software. Selecteer vervolgens MRGE als beeldtechniek, cine als beeldtype en short axis mid ventricular.

Specificeer in het beeldvlak de tijdvakken die gebruikt moeten worden voor de einddiastole en eindsystole via de submenu's 'set current timeframe to end diastole' en 'set current timeframe to end systole' van het bewerkingsmenu. Gebruik vervolgens de knoppen LV en daarna endo en EPI op het paneel rechtsonder. Om respectievelijk de linker Ventrikel, het endocard en het epicard handmatig te tekenen, verwijdert u de papillaire spieren door op de overeenkomstige opdrachtknop te klikken.

Om de nauwkeurigheid van de berekeningen te verhogen, leest u de gekwantificeerde parameters van de linker ventrikel, zoals het diastolisch volume, systolisch volume, slagvolume en de ejectiefractie, af in het paneel rechtsboven. Gebruik vervolgens de opdrachtknop mis en daarna de opdrachtknop voor de meetschuif om de parameters van de linker ventrikel te meten, zoals de wanddikte en de ventriculaire diameter. Gebruik tot slot de optie save both image stacks and segmentation om de beelden op te slaan, inclusief de segmentaties in dot mat-formaat, zodat de beelden indien nodig opnieuw kunnen worden verwerkt.

De hoek waaronder het hart is doorsneden voor de acquisitie van beelden in het tweekamer-gezicht is hier te zien. Hier zien we een geschatte 1,5-voudige toename in de dikte van de linker ventrikel, wat duidt op structurele defecten in de harten van muizen met experimentele auto-immune myocarditis in vergelijking met gezonde muizen. Het hartminuutvolume, gemeten op basis van het volume van de linker ventrikel tijdens de diastole en de ejectiefractie, was verlaagd bij muizen met auto-immune myocarditis in vergelijking met gezonde muizen.

Ten slotte werden de harten van de bovenstaande behandelingsgroepen geëvalueerd op ontsteking via hematoxyline, toymuline en eosine-kleuring; histologische evaluatie van de harten van muizen met myocarditis, maar niet van gezonde muizen, toonde multifocale lymfocyteninfiltraten aan. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur van het dier constant blijft, zodat de hartslag en ademhalingsfrequentie tijdens de experimenten niet significant veranderen. Dit is cruciaal voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in de magnetische resonantie microscopische techniek om functionele afwijkingen van inflammatoire hartaandoeningen, zoals myocarditis in muizen, te evalueren. Vergeet echter niet dat werken met sterke magnetische velden extreem gevaarlijk kan zijn, waardoor de dierhouder en andere componenten non-magnetisch moeten zijn.