Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Het algemene doel van deze procedure is om eiwit-interactiepartners te identificeren voor een bepaald eiwit van belang. Dit wordt bereikt door eerst de cellen te kweken in celcultuurmedia die arginine en lysine bevatten, gelabeld met verschillende stabiele isotopen van koolstof en stikstof. De tweede stap is om plasmiden en een eiwit van belang of een controleplasmide te transfecteren en in de gelabelde cellen te coaten.

Vervolgens worden de cellen gelyseerd en worden monsters immunoprecipiteerd uit de lysaten. Daarna worden gelijke volumes van controle- en monsterimmunoprecipitaten gecombineerd en ingediend voor lc MS MS-analyse. De laatste stap is om de massaspectrometriegegevens te analyseren om eiwitten te identificeren die interageren met het eiwit van belang.

Uiteindelijk zijn stabiele isotooplabeling van aminozuren in celcultuur of silac aminoprecipitaties in staat om grote aantallen zowel directe als indirecte interacties met een eiwit van belang uit weefselcultuurcellen te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals tap tagging, is dat het de noodzaak voor de onderzoeker verwijdert om individuele banden van massaspectrometrie weg te sturen. Dit verwijdert een belangrijke bron van bias en verhoogt tegelijkertijd de gevoeligheid.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in cellulair eiwit, kunnen eiwitinteracties ook worden toegepast op andere systemen, zoals het bestuderen van gastheer-pathogeeninteracties. Om te beginnen schraap SLAC-gelabelde HEK 2 93 T-cellen, die het GFP-gelabelde eiwit van belang of GFP-controle uit de celcultuurschaal uitdrukken, in ijskoud PBS en centrifugeer de celsuspensie bij 220 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, was de cellen drie keer extra in 10 milliliter ijskoud PBS, resuspendeer het cellenpellet in 200 microliter cellysebuffer die vers toegevoegde proteaseremmerscocktail drie bij één X-concentratie bevat en voeg vijf microliter RNAs-cocktail toe per milliliter lysebuffer, incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens het cellysaat bij 13.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en bewaar de supernatant als het oplosbare cellysaat.

Meet de eiwitconcentratie van het cellysaat met behulp van een BCA-test. Normaliseer vervolgens de eiwitconcentratie in elk monsterlysaat in een eindvolume van 500 microliter met behulp van de lysebuffer die proteaseremmers bevat. Voeg 500 microliter verdunningsbuffer met één x proteaseremmerscocktail drie toe aan elk van de genormaliseerde cellysaten om het totaalvolume aan te passen tot één milliliter.

Houd lysaten op ijs terwijl u anti-GFP-kralen voorbereidt en bewaar een 50 microliter-aliquot van elk monster voor gebruik als monsterinput. Vortex de kralenslurry om de kralen opnieuw te suspenderen. Gebruik vervolgens een 200 microliter-pipettip met het uiteinde afgesneden om 25 microliter kralen per monster over te brengen naar een verse buis.

Voeg voor elke 25 microliter kralenslurry 20 volumes verdunningsbuffer toe om te wassen, centrifugeer de kralen bij 2.700 keer G gedurende vijf minuten. Was de kralen extra keer met 20 volumes verdunningsbuffer. Voeg vervolgens 100 microliter verdunningsbuffer toe per 25 microliter kralenslurry.

Gebruik vervolgens een 200 microliter-pipettip met het uiteinde afgesneden om 85 microliter van de resuspendeerde kralenslurry over te brengen naar elk van de SLAC-gelabelde monsterlysaten. Incubeer de monsters met kralen op een rotator bij vier graden Celsius gedurende twee uur nadat de monsters met de kralen zijn geïncubeerd, centrifugeer de monsters bij 2.700 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Bewaar 50 microliter van de supernatant als de ongebonden monster en gooi de rest van de supernatant weg.

Resuspendeer de kralen in elk buisje in één milliliter verdunningsbuffer en centrifugeer vervolgens bij 2.700 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Herhaal deze wasstap twee keer om het eiwit van de kralen te elueren. Voeg 50 microliter van twee XSDS-laadbuffer toe aan elk monster en verhit gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius.

Zodra het verhitten is voltooid, centrifugeer elk monster bij 2.700 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar voorgesmeerde buizen en bewaar bij min 80 graden Celsius totdat het klaar is om in te dienen voor MS-analyse. Meng vervolgens gelijke volumes van controle- en monsteraminoprecipitaten en dien het gecombineerde monster in bij een massaspectrometriefaciliteit voor lc ms MS-analyse.

Voordat u de massaspectrometriegegevens analyseert, kopieert u de ruwe gegevens naar een nieuwe spreadsheet. Vervolgens verwijdert u in deze spreadsheet alle kolommen behalve de kolommen met het toegangsnummer, het aantal unieke peptidenverhoudingen, het vergelijken van monsters, de verhoudingsvariabiliteit en de eiwitbeschrijving. Gebruik de Excel-sorteerfunctie om de gegevens te ordenen op het aantal peptiden en verwijder de vermeldingen voor eiwitten die minder dan één peptide hebben.

Sorteer vervolgens op verhouding en verwijder eiwitten die geen SLAC-verhoudingen hebben. Converteer vervolgens slac-verhoudingen naar log twee-waarden. Gebruik de formule gelijk aan log (haakjes, SLAC-verhouding twee en haakjes waar SLAC-verhouding wordt vervangen door de cel-id.

Maak vervolgens een nieuwe kolom in het Excel-bestand en bereken Log twee SLAC-verhoudingen voor alle monster-mock-kolommen voor conversie van een mock-monsterverhouding naar een monster-mock-verhouding. Gebruik de formule gelijk aan één gedeeld door verhouding. Open GraphPad prism.

Selecteer nieuwe gegevenstabel en grafiek Selecteer kolom uit de lijst aan de linkerkant van het venster en selecteer de invoer gegevens importeren. Voer replicawaarden in, gestapeld in kolommen, opties. Druk op maken.

Selecteer vervolgens en kopieer een bepaalde log twee monster-mock SLAC-verhouding kolom uit de Excel-spreadsheet naar het nieuwe prism-bestand. Klik vervolgens op het dropdown-menu invoegen en selecteer nieuwe analyse. Onder kolomanalyse selecteert u frequentieverdeling.

Behoud de standaardopties en k