Name: Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Leer SILAC-immunoprecipitatie voor kwantitatieve proteomics in zoogdiercellen. Deze methode identificeert eiwitinteractiepartners met hoge gevoeligheid en minimaliseert bias bij massaspectrometrie-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Wellcome Trust en BBSRC IG. IG is een Wellcome Senior Fellow.

1. Generatie en Passage van SILAC gemerkte cellijnen Let op: het gebruik van trypsine-EDTA moet worden vermeden in alle stadia van passage en voorbereiding van experimentele monsters voor analyse als de trypsine ongelabelde aminozuren, die zou leiden tot onvolledige etikettering van de monsters kunnen bevatten. <ol><li> Een fles SILAC media bereiden voeg 0,5 ml van een geschikt SILAC gemerkt arginine (84 mg / ml in PBS) en lysine (146 mg / ml in PBS) om een ​​fles van 500 ml van Arg / Lys DMEM (met L-glutamine). </li><li> Voeg daarna 50 ml gedialyseerd FBS en 5 ml penicilline / streptomycine om de fles van 500 ml. Opmerking: HEK 293T-cellen (ATCC) moet worden gehandhaafd in DMEM media ontbreekt arginine en lysine en aangevuld met licht (R0K0), medium (R6K4) of zware (R10K8) aminozuren, gedialyseerd foetaal bovine serum (10 kDa) en penicilline / streptomycine. Cellen moeten media worden gedurende minstens 5 celdelingen te zorgen voor volledigelabeling. Meestal cellen worden gemakkelijk gelabeld ≥ 2 weken. </li><li> Om cellen voor passage gesplitst moeten de cellen worden losgemaakt uit de monolaag door het raken van de kolf. Alternatieven omvatten het gebruik van mobiele schrapers of met enzymvrij, PBS-gebaseerde cel-dissociatie-buffer. Opmerking: Om de media te behouden, moeten de cellen worden gepasseerd in T25 flessen en grotere aantallen cellen gegenereerd alleen onmiddellijk voorafgaand aan een experiment. </li><li> 24 uur voorafgaand aan transfectie van cellen zaad 3,5 x 10 6-SILAC gelabelde cellen in een 10 cm2 schaal voor elke experimentele conditie onderzocht. </li></ol> 2. Transfectie van gelabelde cellen met pEGFP-fusieconstructen <ol><li> Verwijder het papier uit de cellen en het vervangen met 9 ml-antibiotica vrij SILAC DMEM (Light, Medium of Zwaar) media. Opmerking: Antibiotica mag niet worden toegevoegd aan het medium omdat hierdoor interferentie met de efficiency van liposoom gebaseerde transfectie reagentia. </li><li> Prepaopnieuw een mix van 10 ug van het juiste plasmide (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) in 500 pi van antibiotica-vrij SILAC DMEM en meng het met 500 ul van antibiotica-vrij SILAC DMEM met 10 ui transfectie reagens (bijvoorbeeld Lipofectamine 2000). Meng de reactie goed door pipetteren op en neer meerdere malen. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten en voeg druppelsgewijs aan de cel monolaag. Rock de plaat zachtjes van links naar rechts. </li><li> Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 ° C en 10% CO2 gedurende 24 uur. Opmerking: Als de expressie van een eiwit van interesse resulteert in enige duidelijke toxiciteit, dan kan het noodzakelijk zijn de hoeveelheid plasmide getransfecteerd en / of de duur van de daaropvolgende expressie verkorten. </li></ol> 3. Oogsten cellysaten <ol><li> Oogst cellen van de schotel in ijskoude PBS met behulp van een cel schraper. Verzamel cellen door centrifugatie bij 220 xg, 476, C gedurende 5 minuten. Was de cellen nog eens 3x in 10 ml ijskoude PBS. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 200 ui lysis buffer (10 mM Tris-Cl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP40) met vers toegevoegde proteaseremmer cocktail III 1x de concentratie en RNase cocktail (optioneel) en 5 gl per ml. Opmerking: voor eiwitten met bekende nucleïnezuur bindingsactiviteit, kan het nodig zijn om nucleasen toevoegen lysaat voorafgaand aan precipitatie. Wanneer nuclease toegevoegd, moeten de monsters worden geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten op ijs, met pipetteren elke 10 minuten. Extraheren totaal nucleïnezuur uit een fractie van het monster en analyse met agarosegelelektroforese kan de effectiviteit van de nuclease testen. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 13.000 x g, 4 ° C gedurende 10 min handhaven van de supernatant als oplosbare cellysaat. </li><li> De concentratie van het cellysaat worden beoordeeld door BCA bepaling volgens de instructies van de fabrikant. </li><li>Gebruik lysisbuffer die proteaseremmer cocktail III eiwitconcentratie normaliseren in een eindvolume van 500 pi. </li><li> Stel het volume met de toevoeging van 500 pl verdunningsbuffer (10 mM Tris-Cl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) met proteaseremmer cocktail III bij uiteindelijke concentratie van 1 x 1 ml. Een 50 pi aliquot van het monster te handhaven zoals het in-en het lysaat op ijs gehouden tijdens het bereiden van anti-GFP kralen (bijv. GFP-val). Opmerking: Typisch rendementen variëren tussen 1-3,5 mg eiwit in de finale 1 ml monster. Terwijl de bovenstaande buffers zijn geschikt voor vele eiwitten van belang voor derden noodzakelijk kan zijn om buffercomponenten wijzigen om te waarborgen het aas eiwit oplosbaar en eiwit-eiwit interacties handhaven. Mogelijke wijzigingen omvatten de buffer (fosfaat, HEPES), zoutconcentratie (150-500 mM), de keuze van het wasmiddel of andere additieven. </li></ol> 4. Binding aan Anti-GFP Beads <ol><li> Kort geschud kraal slurry om de kralen te resuspenderen. Met een 200 ul pipet tip met het uiteinde afgesneden, overdracht 25 ul van kralen per monster naar een nieuwe buis. Opmerking: De gebruiker moet de kralen voor te bereiden op een enkele SILAC experiment als een mastermix om sample-to-sample variatie te minimaliseren. </li><li> Voor elk 25 pi kraal slurry, voeg 20 volumes (1500 ul per 75 pl suspensie) van verdunning buffer en centrifugeer de kralen aan 2700 xg gedurende 5 minuten. Vervolgens was de korrels nog 2x in 20 volumes verdunningsbuffer. </li><li> Voeg 100 ul verdunning buffer per 25 pl kraal slurry. Met een 200 ul tip met het uiteinde afgesneden, overdracht 85 ul van deze suspensie geresuspendeerd elk van de SILAC gemerkte monsters van stap 3.6. </li><li> Incubeer de monsters met kralen op een rotator bij 4 ° C gedurende 2 uur. </li></ol> 5. Wassen, elutie, en voorbereiding van de monsters voor MS Analysis <ol><li> Centrifugeer monsters bij 2700 xg, 46, C gedurende 5 minuten. 50 ul van de supernatant worden gehandhaafd als de ongebonden monster, waarbij de rest van het supernatant weggegooid. </li><li> 1 ml verdunningsbuffer worden toegevoegd aan elke buis om de kralen te resuspenderen en bij 2700 xg het monster gecentrifugeerd, 4 ° C gedurende 5 minuten. De bovenstaande vloeistof moet worden weggegooid. Dit moet tweemaal worden uitgevoerd. </li><li> Elueer eiwitten van de bolletjes door de toevoeging van 50 ui 2x SDS-laadbuffer en verwarmen bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Pellet de kralen door centrifugering bij 2.700 g gedurende 2 min bij 4 ° C </li><li> Bewaar het supernatant gesmeerd buizen, waar het dan kan worden opgeslagen bij -80 ° C totdat ze nodig waren. Voor indiening bij een massaspectrometrie faciliteit, meng gelabelde monsters 01:01:01 (bv. 10 pi van elk) en de gemengde monster dienen. NB: Op dit punt monsters kan worden getest door western blot, zilver-kleuring of andere middelen te testen voor interactie met bekende / onbekende bindende partners. Een voorbeeld wordt gegeven in Figure 2 toont specifieke binding van een bekende interactie partner - eIF4G door western blot, en de verschijning van zilverkleuring bands aanwezig in pulldown monsters uit een eiwit van belang, maar niet een controle monster. </li><li> Leg voorbeelden voor LC-MS/MS analyse. Let op: zodra zij constateren dat de gelabelde eiwit van belang met succes is bindend interactie partners, gelijke volumes van elk gemerkt monster (lichte, middelzware en zware) worden gecombineerd en voor LC-MS/MS analyse voorgelegd. Het is gebruikelijk om 30 ul totaal een IP monster dienen voor analyse. Dit zou inhouden mengen 10 ul Licht-gemerkte monster met 10 ul medium-gelabelde en 10 ul zwaar-gemarkeerde monsters een 30 pi totaal geven. </li></ol> 6 Data-analyse I:. Inzicht in de resultaten, en verwijdering van de Low-vertrouwen Identifications Opmerking: Een lijst van de kolomkoppen geretourneerd door de Proteome Discoverer software wordt gegeven in tabel 1 Dif.schillende software (bijv. MSQuant, MaxQuant) worden verschillende posten terugkeren echter slechts een subset van deze zijn voor de analyse en deze zijn gemeenschappelijk voor de verschillende softwarepakketten. Gegevens dient altijd een volgnummer voor elk eiwit geïdentificeerd, verhoudingen vergelijken van elk monster ratio (licht versus medium, licht versus zwaar, medium vs zware etc), het aantal unieke peptiden geïdentificeerd, en een vorm van valse meldingen of indicatie vertrouwen. <ol><li> Alvorens in te gaan door de gegevens, eerst de ruwe data te kopiëren naar een nieuw werkblad. Van deze spreadsheet verwijdert alle kolommen behalve die het geven van de toetreding, aantal unieke peptiden, ratio&#39;s vergelijken van monsters, verhouding variabiliteit, en het eiwit beschrijving. Als replica experimenten werden uitgevoerd, moeten deze worden gecombineerd in een enkel Excel-bestand, met elk experiment zijn opgenomen in een apart tabblad. Opmerking: Lage vertrouwen data bevat eiwitten die door slechts een enkele unieke peptide, en die whier kwantificering niet mogelijk was. </li><li> Gebruik functie Blinkt &#39;&#39; soort &#39;om de gegevens te bestellen door het aantal peptiden en verwijder de tekst voor eiwitten ontbreekt meer dan een peptide. Vervolgens sorteren door ratio en eiwitten die SILAC ratio&#39;s (niet gekwantificeerde eiwitten) ontbreekt verwijderen. </li><li> Converteren SILAC ratio&#39;s om een log 2 waarden met behulp van de formule: &#39;= log (SILAC Ratio, 2)&#39;, waarbij &#39;SILAC Ratio&#39; wordt vervangen door de cel identifier. Opmerking: Als SILAC verhouding resulteert in gegevens voor eiwitten die een afname in overvloed wordt beperkt tot waarden tussen 0 en 1, is het gebruikelijk om een SILAC verhouding converteren naar een log 2 SILAC verhouding, hetgeen impliceert eiwitten zowel verhoogd of verlaagd in een monster worden weergegeven op een log schaal, waar 2 of -2 is een 4-voudige toename of afname in overvloed, en 3 of -3 een 9-voudige toename respectievelijk afname in overvloed. Na deze transformatie, moeten de gegevens passen een GAussian verdeling rond een log2 SILAC verhouding 0. Een voorbeeld hiervan is gegeven in figuur 3. </li><li> Maak nieuwe kolommen in de Excel-bestand en bereken log 2 SILAC verhoudingen voor alle monster / mock kolommen. Voor omzetting van een mock / monster verhouding tot een monster / mock-ratio, gebruik dan de formule: &quot;= 1/ratio&quot; </li></ol> 7 Data-analyse II:. Selectie van hoog vertrouwen Interacties voor verdere studie <ol><li> Open Graphpad Prism, selecteer Nieuw&gt; Gegevens Tabel en grafiek ... Selecteer &#39;kolom&#39; uit de lijst aan de linkerkant van het venster, en kies de Enter / Gegevens importeren&gt; Voer replica waarden, gestapeld in kolommen opties. Druk op &#39;Create&#39;. </li><li> Selecteer en kopieer een bepaald log 2 Sample / Mock SILAC verhouding kolom van het Excel-werkblad in de nieuwe Prism-bestand. </li><li> Klik op de dropdown menu &#39;Invoegen&#39; en selecteer &#39;Nieuwe analyse&#39;. Onder kolom analyse te selecteren &#39;Frequentieverdeling &#39;. Het houden van de standaard opties klik op &#39;OK&#39;. Opmerking: Deze stap genereert een histogram illustreert het aantal eiwitten geïdentificeerd in een gegeven verhouding. Dit moet een Gauss-verdeling vormen. </li><li> In de map &#39;Resultaten&#39; wordt een nieuwe sectie &#39;Histogram&#39; zijn gegenereerd. Selecteert u de sectie frequentieverdeling. </li><li> Klik op de dropdown menu &#39;Invoegen&#39; en selecteer Nieuwe analyse&gt; XY&gt; Niet-lineaire regressie (curve fit). Klik op &#39;Gauss-verdeling&#39; en klik op OK. Opmerking: Deze stap past een bocht naar frequentieverdeling gegevens gegenereerd in stap 7.3, waarbij waarden die vervolgens kan worden gebruikt om drempels voor significantie berekenen. </li><li> In de resultaten venster dat verschijnt, het gemiddelde en de standaarddeviatie worden gegeven. Genereer een drempel door toevoeging 1,96 standaardafwijkingen van het gemiddelde. Opmerking: Deze waarden geven het gemiddelde en de standaarddeviatie van de Gauss-distribution, niet de totale dataset. 1,96 standaardafwijkingen zou een drempel plaatsen op het 95% betrouwbaarheidsinterval (p ≤ 0,05). 2.58 SD zou geven 99% en 3,3 SD 99,9%. De drempel moet individueel worden bepaald voor elk replica experiment ze kunnen variëren. </li></ol> 8 Data Analysis III:. Samenvoegen Replica Datasets Opmerking: Als u vertrouwen in het identificeren van interactie partners een typisch SILAC pulldown experiment moet idealiter drie keer worden uitgevoerd, met het medium en zware gelabelde monsters ingeschakeld voor een van de herhalingen te controleren voor elk effect van de media op de resultaten. Een proteïne die verschijnt als onderling in ten minste twee van de drie experimenten met &quot;switched&#39;-mediavoorbeeld ideaal voor een van deze, is een hoge interactie vertrouwen. <ol><li> Terug naar het Excel-bestand, maakt u een nieuw tabblad genaamd &quot;gecombineerde &#39;. Label kolom A &#39;toetreding&#39; en kopieer alle toetredingscriteria nummers van elkaar of de individuele experimenten in deze kolom. </li><li> Selecteer het tabblad &#39;Data&#39;, en vervolgens de optie &#39;Duplicaten verwijderen&#39;. </li><li> Kolommen voor SILAC verhoudingen en verhouding variabiliteit van elk experiment en voor het eiwit naam / beschrijving kolom. </li><li> In het tabblad beschrijving, gebruik de VLOOKUP formule om de beschrijving van elke toetreding nummer te verzamelen. Sleep de formule door de kolom in het eiwit beschrijving in te vullen. De VLOOKUP formule is: &quot;= VLOOKUP (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)&quot;, waarbij: AccessionNo is $ aX met X de rijnummer WheretoLook is het tabblad &#39;Experiment Naam&#39; $ A $ 2:.! $ Y $ Z waar Y en Z rechtsonder stuk van de gegevens op het werkblad waarnaar wordt verwezen. ColumnsAccross is het aantal kolommen tegenover de toetreding number in kolom A een gewenste waarde ligt. Opmerking: Als bijvoorbeeld het toegangsnummer wordt in kolom A, en de gegevens van interesse ligt in kolom E de waarde hier zou 5 zijn (kolom A telt met 1). Als toegangsnummers werden samengevoegd in stap b, is het zeer waarschijnlijk dat VLOOKUP niet alle vereiste namen ve experiment krijgen. Wanneer het terugkeert N / A, wijzigen van de formule om de beschrijving te verkrijgen van elk experiment op zijn beurt tot alle beschrijvingen zijn verworven. </li><li> Om interagerende eiwitten in de gecombineerde dataset markeren, selecteert u elke verhouding kolom afzonderlijk en klik op het tabblad Start, gevolgd door Voorwaardelijke opmaak&gt; Highlight cellen regels&gt; Meer regels. </li><li> Selecteer stijl &#39;Classic&#39;. Formaat alleen cellen die &#39;Cell waarde&#39; bevatten, &#39;Groter dan of gelijk aan&#39;. In het vak, typ de 1,96 standaarddeviatie waarde, en klik op &#39;OK&#39;. </li><li> Beoordeel de verhouding variabiliteit voor elke positieve interactie. Als aftrekken van de% varANSPRAKELIJKHEID zou dalen een &#39;hit&#39; onder de drempelwaarde, moet deze met voorzichtigheid worden behandeld. Opmerking: Dit is hoe consistent de individuele ratio voor elk peptide die samen SILAC verhouding een eiwitten &#39;zijn, en wordt gegeven als een percentage. Wanneer de verhouding variabiliteit in aanmerking wordt genomen en dat een eiwit geeft een SILAC verhouding boven de drempel, dit eiwit is een hit. Als de verhouding variabiliteit geeft een bereik dat lager is dan de drempel, de &#39;hit&#39; kan een verontreiniging vertegenwoordigen. </li><li> Herhaal deze procedure voor elk van de kolommen en de resultaten te vergelijken over de experimenten. Gemarkeerd eiwitten geïdentificeerd in twee of meer experimenten vormen een interactie groot vertrouwen. Opmerking: Afhankelijk van de database die wordt gebruikt om eiwitten toetreding nummers toe te wijzen, in verschillende experimenten een eiwit kan zijn geïdentificeerd onder een andere, of zelfs meerdere toetreding nummers. Het is belangrijk om deze te controleren of eiwitten niet per ongeluk weggelaten. </li&gt; </ol>

<ol><li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions.</a> Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).</li>
<li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+protein+interactions+and+complexes+by+affinity+purification+followed+by+label-based+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry.</a> Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).</li>
<li>Emmott, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+interactome+of+the+coronavirus+infectious+bronchitis+virus+nucleocapsid+protein+and+functional+implications+for+virus+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology.</a> J Virol. 87, 9486-9500 (2013).</li>
<li>Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+initiation+factors+4A+%28eIF4A%29+and+4G+%28eIF4G%29+mutually+interact+in+a+1%3A1+ratio+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo.</a> J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).</li>
<li>Nielsen, P. J., Trachsel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+protein+synthesis+initiation+factor+4A+gene+family+includes+two+related+functional+genes+which+are+differentially+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed.</a> EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).</li>
<li>Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+response+linking+eIF4AI+activity+to+eIF4AII+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription.</a> RNA. 18, 1373-1384 (2012).</li>
<li>Zakowicz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+DEAD-box+RNA+helicase+eIF4AII+characterizes+its+interaction+with+transformation+suppressor+Pdcd4+and+eIF4GI%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI.</a> RNA. 11, 261-274 (2005).</li>
<li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+nanotrap+for+biochemical+and+functional+studies+with+fluorescent+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
<li>Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+integrin-linked+kinase+interactome+using+SILAC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC.</a> J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).</li>
<li>Mittler, G., Butter, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SILAC-based+DNA+protein+interaction+screen+that+identifies+candidate+binding+proteins+to+functional+DNA+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements.</a> Genome research. 19, 284-293 (2009).</li>
<li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+QUICK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li>
<li>Boulon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+protein+frequency+library+and+its+application+in+the+reliable+identification+of+specific+protein+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).</li>
<li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+dynamic+interactors+of+protein+complexes+by+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+COP9+signalosome+complex+using+affinity+purification+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De SILAC pulldown strategie die hier beschreven is een zeer gevoelig en krachtig middel voor het opsporen van nieuwe eiwit: eiwit interacties, en bovendien maakt een snelle en eenvoudige discriminatie van veranderde bindingspatronen tussen nauw verwante monsters van belang. In dit voorbeeld werd deze techniek gebruikt om het eiwit te onderzoeken: eiwit interacties van de eIF4AI en eIF4AII eiwitten 6. Voor zover de auteur, dit is de eerste studie in de literatuur benutten het nut van SILAC proteomics de cellulaire interactoom van deze twee isovormen van eIF4A onderzoeken. De benadering zoals boven beschreven maakt gebruik van een GFP-tag en anti-GFP kralen 9, 10 en derhalve wijzigingen kunnen nodig zijn om deze aanpak te gebruiken voor een bepaalde proteïne van belang, bijvoorbeeld of de markering wordt geplaatst op de N-of C-terminus van een eiwit. Waar mogelijk, western blots of functionele testen moetenworden uitgevoerd om te detecteren binding van een bekende eiwit interactiepartner. Indien een eiwit fusie niet tolereren met een GFP-tag, andere tagging of pulldown strategieën zijn toegepast SILAC pulldown met beide andere tags (FLAG 11, biotine 12, STREP (eigen gegevens, ongepubliceerd)), of met primaire antilichamen tegen een eiwit van belang waar siRNA knock-down van het doelwit eiwit zorgt voor een controle monster 13. Dergelijke experimenten zijn elders beschreven in de literatuur, maar kort, stap 1 en stap 5,4-8 worden zoals hierboven toegepast, met stappen 2-5,3 als geschikt zijn gemodificeerd voor de expressie / pulldown gekozen systeem met gelijke eiwit inputs zoals beschreven in stappen 2,4-2,5. Aangezien de kwantificering fasen mogelijk niet-specifieke binding eiwitgehalte bij de analyse niveau te verwijderen, is het raadzaam om pre-incubatie weglaten controlekorrels of hoge zout wast om een ​​lage-affiniteit proteïne behouden: eiwit interacties met een eiwit van interesse . Een nuclease may worden opgenomen of weggelaten uit dit protocol overeenkomstig de specifieke kenmerken van een bepaald experiment. Bijvoorbeeld: als de eiwitten in deze methode RNA helicases, RNase cocktail werd opgenomen in het protocol indirecte interacties gemedieerd via RNA (stap 3.2) te verwijderen. In sommige gevallen echter, kunnen er profiteren parallel experimenten met en zonder nuclease nucleïnezuur afhankelijke interacties identificeren. Binnen dit protocol, is de omschakeling van &#39;medium&#39; en &#39;zware&#39; monsters in duplo experimenten aangeraden om te controleren voor variatie geïntroduceerd door verschillen in de SILAC media of celgroei. Een alternatief controlesysteem omvat de sequentiële schakeling van alle drie (&#39;light&#39;, &#39;medium&#39; en &#39;zware&#39;) media in replica experimenten. Hoewel deze aanpak is potentieel strengere ofwel verhogen de complexiteit van de analyse, zoals in ten minste een herhaling, een eiwit van interesse worden geproduceerd in &#39;light&#39; gelabelde cellen en dus is het noodzakelijk onderscheid te maken tussen eiwitten steeds geïdentificeerd light-monsters (milieuverontreinigende stoffen zoals keratine) en die alleen verrijkt &quot;lichte&quot; monsters wanneer gebonden aan een eiwit van belang. Hoewel het gebruik van kwantitatieve gegevens maakt onderscheid van specifieke van niet-specifieke interacties door het gebruik van een drempel onvermijdelijk enige echte interacties kunnen worden weggegooid. De bovenstaande aanpak is een eenvoudige en snelle wijze te werk om eiwit: eiwit interacties die gemakkelijk kan worden geprobeerd door onderzoekers zonder eerdere ervaring met massaspectrometrie of analyse van grote eiwit: eiwit interactie datasets. Voor de meeste toepassingen is dit meer dan voldoende voor het identificeren van nieuwe eiwitten van belang. Verdere modificaties deze benadering om dit verlies van gegevens te beperken worden elders in de literatuur beschreven en omvatten het gebruik van een protein frequentie bibliotheek waar bekend verontreinigende eiwitten voor een specifieke set van experimentele parameters (cellijn, kraal matrix, buffer voorwaarden) kunnen worden uitgesloten 10, 14. Afhankelijk van de specifieke experimentele parameters noodzakelijk kan zijn om een ​​aantal controle-experimenten uitgevoerd om een ​​kraal proteoom genereren, kan daardoor stijgt zowel de kosten en complexiteit van het experiment. Meer informatie over deze techniek is beschikbaar op de website www.peptracker.co.uk 14. Voorts zij opgemerkt dat de hierboven beschreven protocol het mengen verschillend gemerkte monsters aan het einde van de immunoprecipitatie werkwijze (aangeduid als een mixing na zuivering - MAP SILAC experiment). Dit gebeurt als eiwit: eiwit interacties optreden bij een bepaalde evenwichtstoestand 15. Opgemerkt moet worden dat andere groepen deze map SILAC benadering in dit protocol beschreven incubatie van de monsters gecombineerdevóór pulldown (Zuivering na mengen - PAM SILAC) gedurende een langere tijd (20 min tot 2 uur zijn in de literatuur) 15, 16. Gebaseerd op hoe snel een eiwitverhouding daalt tot 01:01, is het mogelijk kwalitatief onderzoek bindingsaffiniteiten en eiwitten stabiele of dynamische interagerende eiwitten 15 definiëren. Samengevat, SILAC pulldowns vertegenwoordigen een zeer krachtig middel ter identificatie van eiwitten die interageren met een bepaald eiwit van belang, in een fysiologisch relevante instelling. De techniek kan gemakkelijk worden aangepast om een ​​aantal verschillende strategieën zuivering, waardoor de toepassing ervan op een bepaalde proteïne van belang. Kwantificering van resultaten sterk vereenvoudigt identificatie van echte interacties en laat relaxatie stringente buffer omstandigheden gebruikt om niet-specifieke binders te verwijderen en daardoor behoudt lage affiniteit interacties. Als maximaal drie monsters kunnen worden vergeleken in de bovenstaandestrategie, de techniek heeft duidelijke troeven bij het vergelijken van de verschillen in eiwit binding tussen verschillende eiwit isovormen, mutante eiwitten, of het effect van farmacologische remmers. Als geheel gelstukjes worden geanalyseerd in plaats van individuele bands die vlek door Coomassie, het aantal eiwitten geïdentificeerd op groot vertrouwen zijn meestal hoger dan die welke in een standaard GST / TAP-pulldown, en experimentator bias bij het selecteren van eiwitten van belang wordt verwijderd. De techniek vergelijkt daarom zeer gunstig af bij andere veelgebruikte technieken die worden gebruikt bij de identificatie van nieuwe proteïne-interacties (gist 2-hybride, GST / Zijn TAP pulldowns).

Een essentiële stap in het begrip eiwitfunctie is identificatie van relevante interagerende eiwitten. Wanneer dergelijke eiwitten onbekend zijn er een aantal technieken, elk met hun eigen voor-en nadelen. Deze omvatten de gist twee-hybride systeem, pulldown analyses toepassing van recombinant eiwit en tandem affiniteitszuivering of TAP-tagging 1, 2. Een recentere Naast deze technieken is de combinatie van affiniteit zuivering van een eiwit van interesse van een relevante zoogdiercellijn, gevolgd door kwantitatieve massaspectrometrie met stabiele isotopen van aminozuren in celcultuur (SILAC) 3. Dit heeft voordelen boven de gist twee-hybride benadering in die cel lokalisatie en post-translationele modificaties zijn niet verstoord, alsmede voordelen boven traditionele TAP tagging doordat het kwantitatieve dan kwalitatieve benadering waardoor de gebruiker reaDily onderscheiden niet-specifiek interagerende eiwitten en verontreinigingen vanuit gastheer factoren die specifiek binden. Verder werd als monster typisch geanalyseerd geheel en niet als afzonderlijke eiwitbanden, eiwitten van belang zijn niet gemaskeerd door soortgelijke migreren eiwitten op een gel, en dat hoeft typisch aanwezig zijn in voldoende hoge niveaus zichtbaar na kleuring, waardoor verhoogde aantallen vol geïdentificeerde eiwitten 4. Om deze techniek te demonstreren, GFP fusies van de nauw verwante eukaryotische translatie-initiatie factor eIF4AI en eIF4AII dat aandeel meer dan 90% aminozuuridentiteit werden onderzocht door SILAC-immunoprecipitaties kwantitatieve proteomics. Menselijke eIF4AI en II werden gekloneerd in pEGFP-C1 een fusieproteïne waarin GFP gefuseerd aan de N-terminus van eIF4A vormen. Om te voorkomen dat de noodzaak voor het genereren van stabiele cellijnen transiënte transfectie werd gebruikt om deze constructen te leveren aan stabiele isotoop gemerkte 293T cellen. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Cellen werden eerst gelabeld voor twee weken SILAC celkweekmedium, gevolgd door transfectie van plasmide DNA dat codeert voor een eiwit van interesse. Cellen werden vervolgens gelyseerd, de eiwitconcentratie genormaliseerd en gelijke hoeveelheden lysaat affiniteit gezuiverd anti-GFP agarose. Gelijke hoeveelheden eluaat werden vervolgens gecombineerd en LC-MS/MS analyse worden aangeboden. De resultaten van deze analyse worden vervolgens naar hoog vertrouwen eiwitten te identificeren: eiwit interacties (figuur 1). SILAC immunoprecipitatie maakt de identificatie van niet alleen rechtstreekse interacties maar ook lage affiniteit of indirecte interacties met eiwitcomplexen 4. Met dit systeem eIF4AI en II immunoprecipitaties toegestaan ​​reproduceerbare en zekere identificatie van de primaire bindingspartner eIF4G (isovormen I / II en III) 5, alsook indirecte interacties met eIF4E en talrijke onderdelen van de eIF3 complex.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium &nbsp;(DMEM)</td><td>Dundee Cell Products</td><td>LM010</td><td>DMEM zonder Arginine en Lysine. (en bevat L-glutamine)</td></tr><tr><td>Dialysed FBS (10 kDa cutoff) 500 ml</td><td>Dundee Cell Products</td><td>DS1003</td><td></td></tr><tr><td>Arginine (R0) 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094</td><td>Resuspendeer 0,5 g in 6 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 84 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Arginine (R6) 0,5 g</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>CLM-2265</td><td>Resuspendeer 0,5 g in 6 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 84 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Arginine (R10) 0,5 g</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>CNLM-539</td><td>Resuspendeer 0,5 g in 6 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 84 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Lysine (K0) 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8662</td><td>Resuspendeer 0,5 g in 3,5 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 146 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Lysine (K4) 0,5 g</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>DLM-2640</td><td>Resuspendeer 0,5 g in 3,5 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 146 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Lysine (K8) 0,5 g</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>CNLM-291</td><td>Resuspendeer 0,5 g in 3,5 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 146 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine, vloeibaar. 100 ml</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 transfectie reagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>GFP-trap Agarose (500 &mu;l hars)</td><td>Chromotek</td><td>gta-20</td><td></td></tr><tr><td>5x SDS Sample loading buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>PN39000</td><td>Het gebruik van gekochte in plaats van zelfgemaakte monsterbuffer wordt aanbevolen om keratinecontaminatie te minimaliseren.</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail set III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml voorgesmeerde buizen</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>BCA eiwit analyse kit (1 L)</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Trizma)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Rnase cocktail</td><td>Ambion</td><td>AM2286</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 alternatief</td><td>Millipore</td><td>492016</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van eiwit interacties partners in zoogdiercellen behulp silac-immunoprecipitaties kwantitatieve proteomics

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Kwantitatieve proteomics gecombineerd met immuno-affiniteitszuivering, SILAC immunoprecipitatie, vormen een krachtig middel voor de ontdekking van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, kan waar interacties gemakkelijk worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen. Lage affiniteit interacties kunnen worden bewaard door het gebruik van minder stringente bufferomstandigheden en gemakkelijk herkenbaar blijven. Dit protocol beschrijft de kenmerken van weefselkweek cellen met stabiele isotoop gemerkte aminozuren, transfectie en immunoprecipitatie van een affiniteit gelabeld eiwit van belang, gevolgd door de voorbereiding van opname in een massaspectrometrie faciliteit. Dit protocol bespreekt vervolgens hoe u het terug van de massaspectrometer om cellulaire partners interactie met een eiwit van belang vast te stellen gegevens te analyseren en te interpreteren. Als voorbeeld van deze techniek wordt toegepast identiteitTify eiwitten binden aan de eukaryote translatie initiatie factoren: eIF4AI en eIF4AII.

In een typisch experiment SILAC pulldown, de overgrote meerderheid van de geïdentificeerde eiwitten (&gt; 90%) te vertegenwoordigen verontreinigingen en eiwitten binden niet specifiek aan de affiniteitsmatrix en dit wordt geïllustreerd in figuur 2B, zelfs bij het ​​wassen protocollen de meerderheid van cytoplasmatische contaminanten zoals GAPDH (Figuur 2A). De clustering van niet-specifiek bindende eiwitten in een normale verdeling maakt eiwitten die specifiek binden aan een eiwit van belang kunnen worden onderscheiden deze hogere sample / mock verhoudingen dan de achtergrond. Terwijl verontreinigingen theoretisch zou zich rond een log2 SILAC verhouding van 0, is dit niet noodzakelijkerwijs het geval, wordt een voorbeeld gegeven in figuur 3. Mogelijke redenen hiervoor zijn onvolmaakte SILAC labeling van cellen laden ongelijke hoeveelheden of concentraties lysaat op de anti-GFP kralen, toevallig verlies van kralen bij zuiverings-of ongelijke mixing van de monsters aan het einde van de zuiveringsprocedure 3. Echter uitgaande data geanalyseerd op basis van een drempel standaard afwijking van het gemiddelde van de normaal verdeelde verontreinigingen dienen kleinere verschuivingen in de centrering van de gegevens niet de kwaliteit van de resultaten. Bij het vergelijken van verschillen in eiwitinteracties tussen twee verwante eiwitten, kan een soortgelijke situatie voordoen waarin een eiwit van belang wordt geproduceerd om hogere niveaus in cellen dan een seconde (hetzij door variatie in transfectie-efficiëntie, of een intrinsieke eigenschap van het eiwit of mRNA) . Enige variatie in expressie (bijvoorbeeld figuur 2A) kan worden gecorrigeerd door het analyseren van de SILAC verhouding voor deze twee monsters. In dit voorbeeld zouden dit de GFP-eIF4AI en GFP-eIF4AII monsters. Door het analyseren van de 4AI/4AII SILAC verhouding zoals besproken in hoofdstuk 7, is het mogelijk om eiwitten waarvan de binding verschilt aanzienlijk tussen isovormen identificeren. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; In figuur 4 is een weergave van de eIF4A-bindende eiwitten die in een van de replica experimenten getoond dat het bereik van de opening factor complex dit protocol verkregen. De hoogste verhoudingen werden meestal waargenomen met eIF4G, die direct bindt aan eIF4A, met lagere verhoudingen voor eIF4E, dat bindt aan eIF4G op een plaats verwijderd van de eIF4A bindingsplaats. Lagere ratio&#39;s werden waargenomen voor de leden van de eIF3 complex. Echter, dit geeft duidelijk aan dat het experiment bevredigende geïdentificeerd zowel directe als indirecte binding partners van eIF4AI en II. Zoals kan worden verwacht uit de hoge sequentie identiteit 6, eiwit: eiwit interacties bleek grotendeels geconserveerd tussen de twee isovormen in dit experimentele systeem 7, 8. Een greep uit de interagerende eiwitten worden in Tabel 2 illustreert de gegevensindeling. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Kolomkop </td><td> Beschrijving </td></tr><tr><td> Toetreding </td><td> Geeft het toegangsnummer voor de reeks </td></tr><tr><td> Dekking </td><td> Deel van de eiwitsequentie onder de geïdentificeerde peptiden </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> Peptide spectrale wedstrijd </td></tr><tr><td> ♯ peptiden </td><td> Totaal aantal unieke peptiden geïdentificeerd voor een eiwit </td></tr><tr><td> ♯ AA </td><td> De lengte van een eiwit aan aminozuren </td></tr><tr><td> MW (Da) </td><td> Het molecuulgewicht van een eiwit in Dalton. Exclusief wijzigingen </td></tr><tr><td> calc. PI </td><td> Het theoretische iso-elektrische punt van een eiwit </td></tr><tr><td> Partituur </td><td> De totale score van een eiwit (die de som van de indiv vertegenwoordigtidual peptide scores). De exacte score die nodig zijn voor betekenis zal variëren tussen de experimenten. Een MS faciliteit zal gelden doorgaans een 5% valse ontdekking tarief cutoff. </td></tr><tr><td> Sequentie </td><td> De sequentie van aminozuren die het eiwit </td></tr><tr><td> Verhouding </td><td> De relatieve intensiteit van peptiden in een benoemde gemerkte monster vergeleken met een tweede monster gelabeld </td></tr><tr><td> Ratio Aantal </td><td> Het aantal peptide ratio&#39;s die werden gebruikt om een ​​bepaald eiwit verhouding berekenen </td></tr><tr><td> Ratio variabiliteit (%) </td><td> De variabiliteit van de individuele peptide verhoudingen om een bepaald eiwitverhouding berekenen </td></tr><tr><td> Beschrijving </td><td> De naam van het eiwit </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Standaard kolomkoppen uit een Proteome Discoverer rapport.Terwijl nuttige informatie kan worden opgedaan met al deze kolommen, die van cruciaal belang voor deze analyse zijn vet weergegeven. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057"><tbody><tr><td> Toetreding </td><td> Peptiden </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> Naam </td><td> SILAC analyse </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> &#39;Bait&#39; eiwit </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0.01 </td><td> 90,855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47,575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> Interacterende eiwitten </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11,778 </td><td> 10,619 </td><td> eIF4GII60; </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7.22 </td><td> 7.57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0.685 </td><td> 0.646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> Niet-specifieke binding contaminanten </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0.531 </td><td> 0.498 </td><td> Histon H4 </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> Keratine-1 </td><td rowspan="2"> Milieuverontreinigende stoffen </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0.01 </td><td> 0.01 </td><td> Keratine-1 cytoskelet 9 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Typische Gegevens uit een SILAC immunoprecipitatie experiment. Geven bijvoorbeeld gegevens voor een eiwit van interesse / aas (hoog peptiden, hoge verhouding), eiwitten die interageren met een eiwit van interesse (hoog / laag peptiden, hoge verhouding), niet-specifiek binden eiwitten (hoog / laag Peptides, ratio lager wordt dan cutoff - in dit experiment 0,96), en milieuverontreinigende stoffen (vaak hoog peptiden, negatieve verhouding / onder de drempel). <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> Figuur 1. Proefopzet. Eerste cellen worden gekweekt in medium zonder arginine en lysine en gesubstitueerd met stabiele isotoop gemerkte arginine en lysine 2 weken (1). (2) Cellen worden gezaaid in 10 cm2 schalen en transiënt getransfecteerd met plasmiden die GFP (Mock) of GFP-fusie-eiwitten (monsters). (3) De cellen worden gelyseerd en GFP of GFP-fusie-eiwitten worden immunogeprecipiteerd uit cellysaten. (4) De monsters worden gecombineerd in een 1:1 verhouding en LC-MS/MS analyse worden aangeboden. De gegevens worden vervolgens geanalyseerd om lage vertrouwen eiwit ident verwijderencaties en een eiwitgehalte verrijking overeenkomend normaal interagerende eiwitten te selecteren. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> Figuur 2. Geschikt immunoprecipitation omstandigheden bevestigen. A) Western blot analyse van cellysaten, evenals ongebonden en gebonden fracties van de immunoprecipitatie bevestigt expressie en immunoprecipitatie van het eiwit van belang. Een western blot tegen GAPDH bevestigt uitputting van niet-interagerende eiwitten en verdere western blot een bekende interactie partner van eIF4A bevestigt de succesvolle immunoprecipitatie van eiwitten binden aan het eiwit van belang. B) Wanneer interactie partners van een eiwit van belang niet bekend, een zilver gekleurde gel kan immunoprecipitatie van interagerende eiwitten bevestigen. Op deze zilver-vlek<html> ed gelbanden voor GFP en GFP-eIF4AI/II zijn duidelijk, en een band migreren in de juiste grootte voor eIF4G is alleen aanwezig in de GFP-4AI/II-bound rijstroken en niet in de GFP controle rijstrook. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve resultaten. Histogram toont de verdeling van eiwit verhoudingen ve herhaling van (A) GFP-eIF4AI of (B) GFP-eIF4AII pulldown. De 1,96 standaarddeviatie cutoff is gemarkeerd met een stippellijn. Interagerende eiwitten die buiten de normaal verdeelde verontreinigingen blijken uit ~ 0.25 1 in (A) en ~ 0,3-1,5 cm (B). les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Identificatie van eIF complex leden van een replica van een SILAC IP experiment. Eiwitten groen waren het eiwit van belang voor de pulldown interactie eiwitten schaduw van rood naar wit volgens 2 SILAC verhouding in het SILAC IP met rode log het meest voorkomende eiwit in de analyse, en wit zijn de 1,96 SD cutoff. Eiwitten grijs gearceerd werden niet geïdentificeerd in deze analyse.

SILAC immunoprecipitatie experimenten vormen een krachtig middel voor het ontdekken van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, waar interacties gemakkelijk kan worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen en lage affiniteit interacties bewaard door het gebruik van minder stringente buffer omstandigheden.

Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Het algemene doel van deze procedure is om interactiepartners voor een specifiek eiwit van belang te identificeren. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te kweken in celkweekmedia die arginine en lysine bevatten, gelabeld met verschillende stabiele isotopen van koolstof en stikstof. De tweede stap is het transfecteren van plasmiden die een eiwit van belang of een controleplasmide coderen in de gelabelde cellen.Vervolgens worden de cellen gelyseerd en worden monsters immunoprecipiteerd uit de lysaten. Daarna worden gelijke volumes van de controle- en monster-immunoprecipitaten gecombineerd en ingezet voor lc-MS/MS-analyse. De laatste stap is het analyseren van de massaspectrometriegegevens om eiwitten te identificeren die interageren met het eiwit van belang.Uiteindelijk zijn stabiele isotopenmarkering van aminozuren in celkweek of SILAC-amino-precipitaties in staat om grote aantallen zowel directe als indirecte interacties met een eiwit van belang uit weefselkweekcellen te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals TAP-tagging, is dat de onderzoeker niet langer individuele banden hoeft op te sturen voor massaspectrometrie. Dit elimineert een belangrijke bron van bias en verhoogt tegelijkertijd de sensitiviteit.Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in cellulaire eiwitten, kunnen eiwitinteracties ook worden toegepast op andere systemen, zoals het bestuderen van interacties tussen pathogenen en de gastheer. Begin met het schrapen van SLAC-gelabelde HEK 293 T-cellen, die het GFP-getagde eiwit van belang of een GFP-controle tot expressie brengen, vanuit de celcultuurschaal in ijskoud PBS; centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 220 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Was de cellen nog drie keer in 10 mL ijskoud PBS en resuspendeer het celpellet in 200 µL cellysisbuffer die vers toegevoegde protease-inhibitorcocktail 3 in 1X concentratie bevat, en voeg 5 µL RNase-cocktail per milliliter lysisbuffer toe; incubeer vijf minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens het cellysaat bij 13.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C en behoud het supernatant als het oplosbare cellysaat.Meet de proteïneconcentratie van het cellysaat met behulp van een BCA-assay. Normaliseer vervolgens de proteïneconcentratie in elk monsterlysaat tot een eindvolume van 500 µL met behulp van de lysisbuffer die proteaseremmers bevat. Voeg 500 µL verdunningsbuffer, own met één x protease-inhibitorcocktail drie, toe aan de genormaliseerde cellysaten om het totale volume aan te passen naar 1 mL.Houd de lysaten op ijs terwijl de anti-GFP-beads worden voorbereid en bewaar een aliquot van 50 microliter van elk monster om als sample input te gebruiken. Vortex de bead-suspensie om de beads opnieuw te resuspenderen. Gebruik vervolgens een 200 microliter pipetteertip waarvan het uiteinde is afgesneden om 25 microliters beads per monster over te brengen naar een nieuwe buis.Voeg voor elke 25 µL kraalensuspensie 20 volumes verdunningsbuffer toe om te wassen en centrifugeer de kralen bij 2.700 ×g gedurende vijf minuten. Was de kralen nogmaals met 20 volumes verdunningsbuffer. Voeg vervolgens 100 µL verdunningsbuffer toe per 25 µL kraalensuspensie.Gebruik vervolgens een 200 µL pipetpunt waarvan het uiteinde is afgeknipt om 85 µL van de resuspendeerde kraal-slurry over te brengen naar elk van de met SLAC gelabelde monsterlysaten. Incubeer de monsters met de kralen op een rotator bij 4 °C gedurende twee uur. Nadat de monsters met de kralen zijn geïncubeerd, worden de monsters gecentrifugeerd bij 2.700 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Bewaar 50 µL van het supernatant als het ongebonden monster en verwijder de rest van het supernatant.Resuspendeer de beads in elke buis in één milliliter verdunningsbuffer en centrifugeer vervolgens bij 2.700 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Herhaal deze wasstap twee keer om het eiwit van de beads te elueren. Voeg 50 µL 2X SDS-laadbuffer toe aan elk monster en verhit dit gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius.Zodra het verwarmen is voltooid, centregeert u elk monster gedurende vijf minuten bij 2.700 ×g bij vier graden Celsius. Draag het supernatant over naar vooraf gesmeerde buisjes en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot ze klaar zijn voor MS-analyse. Meng vervolgens gelijke volumes van de controle- en monsteramino-precipitaten en dien het gecombineerde monster in bij een massaspectrometrie-faciliteit voor lc-ms/ms-analyse.Kopieer de ruwe gegevens naar een nieuw spreadsheet voordat u de massaspectrometriegegevens analyseert. Verwijder vervolgens in dit spreadsheet alle kolommen, behalve de kolommen met het accessienummer, het aantal unieke peptide-ratio's, de vergeleken monsters, de ratio-variabiliteit en de eiwitbeschrijving. Gebruik de sorteerfunctie van Excel om de gegevens te ordenen op basis van het aantal peptiden en verwijder de vermeldingen van eiwitten die niet meer dan één peptide bevatten.Sorteer vervolgens op ratio en verwijder eiwitten die geen SLAC-ratio's hebben. Zet daarna de SLAC-ratio's om in log2-waarden. Gebruik hiervoor de formule =LOG2(SLAC ratio [celidentificatie]), waarbij SLAC ratio wordt vervangen door de specifieke celidentificatie.Maak vervolgens een nieuwe kolom in het Excel-bestand en bereken de Log twee SLAC-ratio's voor alle sample mock-kolommen voor de conversie van een mock sample-ratio naar een sample mock-ratio. Gebruik de formule =1/ratio. Open GraphPad Prism.Selecteer een nieuwe datatabel en grafiek. Selecteer een kolom uit de lijst aan de linkerkant van het venster en selecteer 'import data'. Voer de waarden voor replica's in die in kolommen zijn gestapeld. Klik op create.Selecteer vervolgens een gegeven kolom met mock SLAC-ratio's op een log2-schaal uit het Excel-spreadsheet en kopieer deze naar het nieuwe Prism-bestand. Klik daarna op het vervolgkeuzemenu 'Insert' en selecteer 'New Analysis'. Selecteer onder 'Column Analysis' de optie 'Frequency Distribution'.Behoud de standaardopties en klik op ok. In de resultatenmap is een nieuwe sectie met histogrammen gegenereerd. Selecteer de sectie voor de frequentieverdeling, klik vervolgens op het uitklapmenu 'insert' en selecteer 'new analysis XY non-linear regression curve fit'.Klik op Gaussian distribution en klik op oké. In het resultatenvenster dat verschijnt, worden het gemiddelde en de standaarddeviatie weergegeven. Bepaal een drempelwaarde door 1,96 standaarddeviaties bij het gemiddelde op te tellen en keer terug naar het Excel-bestand.Maak een nieuw tabblad genaamd combined label column A accession aan en kopieer alle accessionnummers van elk van de individuele experimenten naar deze enkele kolom. Selecteer vervolgens het tabblad data en daarna de optie remove duplicates. Maak vervolgens kolommen aan voor de SLAC-ratio's en de ratio-variabiliteit van elk experiment, evenals voor de kolom met de protein name description.Gebruik in het beschrijvingstabblad de VLOOKUP-formule om de beschrijving van elk accessienummer op te halen. Sleep de formule naar beneden door de kolom om de proteïnbeschrijving in te vullen, en gebruik deze formule vervolgens om de ratio- en variabiliteitsgegevens van de individuele experimenten te verkrijgen. Noteer de drempelwaarde voor een specifiek experiment om interagerende proteïnen in de gecombineerde dataset te markeren.Selecteer de kolom met de ratio en klik op het tabblad start. Ga vervolgens naar voorwaardelijke opmaak, cellen markeren, meer regels en selecteer bij stijl 'klassieke opmaak' alleen cellen die bevatten, celwaarde groter dan of gelijk aan. Typ in het vak de waarde voor de 1,96 standaarddeviatie in en klik op ok.Beoordeel de variabiliteit van de ratio voor elke positieve interactie. Indien het aftrekken van het percentage variabiliteit zou ertoe leiden dat een hit onder de drempelwaarde zakt, dient dit met voorzichtigheid te worden behandeld.Herhaal dit voor elke resultatenkolom en vergelijk deze over de experimenten heen; eiwitten die in twee of meer experimenten zijn gehighlight, vertegenwoordigen een interactie met een hoge betrouwbaarheid. Western blot-analyse bevestigde de zuivering van het GFP-getagde eiwit van belang. De afwezigheid van een gap DH-band in de gebonden monsters geeft aan dat niet-interagerende eiwitten uit de monsters zijn verwijderd door de immunoprecipitatiestap, terwijl de aanwezigheid van een EIF 4G-band in deze monsters aangeeft dat bekende interagerende bindingspartners zijn behouden.Verschillende van de geïdentificeerde eIF4A-bindende eiwitten waren geconserveerd tussen de twee isovormen. De eiwitten die interageren met eIF4A worden geïdentificeerd door de hoge LAC-ratio, terwijl aspecifiek gebonden eiwitten in dit experiment ratio's onder de 0,96 hebben. In dit diagram van het initiatiefactorcomplex zijn de eIF4A-bindende eiwitten die in het SLAC-aminoprecipitatie-experiment zijn geïdentificeerd, gearceerd van rood naar wit.Volgens de log two SLAC-ratio illustreert de hoge dekking van zowel directe als indirecte bindingspartners van de EIF vier A one en two complexen de effectiviteit van deze benadering voor het identificeren van eiwitinteracties. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat hoewel sommige variaties in eiwitniveaus in de fase van data-analyse gecompenseerd kunnen worden, het bij voorkeur vermeden moet worden door een nauwkeurige normalisatie van de eiwitinputniveaus te waarborgen en door te voorkomen dat er aros-beads verloren gaan tijdens de wasstappen.

identification-protein-interaction-partners-mammalian-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

We beschrijven een kwantitatieve proteomics met gebruik van technieken van stabiele isotopen van aminozuren in celcultuur (SILAC) het effect van HIV-1 infectie op host exosomaal proteoom analyse. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan cellen onder verschillende stress of infectie omstandigheden.

SILAC Based Proteoom karakterisatie van exosomen van HIV-1 geïnfecteerde cellen

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Intercellulaire kruispunten zijn benodigdheden voor stadiumspecifieke functies en ontwikkeling van de borstklier. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties (PPI's) en co-lokalisatie met behulp van muizenklinieken. Deze technieken maken het mogelijk om de dynamiek van de fysieke associatie tussen intercellulaire kruispunten in verschillende ontwikkelingsstadia te onderzoeken.

Analyse van eiwit-eiwitinteracties en co-lokalisatie tussen componenten van kloof-, strakke- en adherentie-knooppunten in muizenmammarysklieren

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Eiwit-eiwitinteracties zijn belangrijk voor het ophelderen van de functie van doeleiwitten, en co-immunoprecipitatie (co-IP) kan PPI's gemakkelijk bevestigen. We transfecteerden tijdelijk een plasmide dat codeert voor een epitoop-gelabeld eiwit in HEK-293-cellen en ontwikkelden een immunoprecipitatiemethode om de binding van twee doeleiwitten gemakkelijk te bevestigen.

Immunoprecipitatie met een Anti-Epitope Tag Affinity Gel om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen

Leer SILAC-immunoprecipitatie voor kwantitatieve proteomics in zoogdiercellen. Deze methode identificeert eiwitinteractiepartners met hoge gevoeligheid en minimaliseert bias bij massaspectrometrie-analyse.

Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Meer video's verkennen