Name: Glutamine Flux Imaging Met behulp van genetisch gecodeerde Sensoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Leer glutamineflux-imaging met FRET-sensoren in levende cellen. Deze methode maakt real-time monitoring van transporteractiviteit en metabolische dynamica op subcellulair niveau mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​1R21NS064412, NSF subsidie ​​1.052.048 en Jeffress Memorial Trust subsidie ​​J-908.

1. Monstervoorbereiding Opmerking: In veel gevallen was perfusie experimenten weg een aanzienlijk deel van de cellen, die een frustrerend probleem kan worden. Hoewel niet noodzakelijk voor alle cellijnen, coaten dekglas oppervlakken met poly-L-lysine (voeg 1,0 ml/25 cm2 van 0,01% oplossing van de oppervlakte, incubeer&gt; 5 min, tweemaal spoelen met celkweek kwaliteit water en droog de bioveiligheid kast) verbetert cel adhesie. Ook de hoogte van de bioveiligheid niveau (BSL) van de gebruikte cellijn, en volg de standaard werkwijze van de lokale milieu-gezondheid en veiligheid kantoor goedgekeurd. In dit experiment werden COS7 cellen gebruikt vanwege lage endogene glutamine transportactiviteit (zie figuur 4). <ol><li> Zaad COS7 cellen bij ~ 70-80% confluentie in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% kosmische kalfsserum en 100 U / ml penicilline / streptomycine, hetzij op steriele 25 mm dekglaasjes geplaatst in 6-putjesgerecht of 8-well glazen bodem dia&#39;s. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid gedurende 24 uur. </li><li> Vervang het groeimedium DMEM +10% kosmische kalfsserum (geen antibiotica), volgens het protocol van de fabrikant. Grow O / N bij 37 ° C, 5% CO 2 bij 100% vochtigheid. </li><li> Voeg 0,4 mg elk plasmide DNA dat codeert voor glutamine sensor (pcDNA3.1, dragen FLIPQTV3.0 sensor in CMV-promoter 10) en mCherry-gelabelde ASCT2 10 tot 50 ml serumvrij medium (OPTI-MEM) en meng voorzichtig. </li><li> Voeg 1 ml transfectie reagens 50 ml serumvrij medium. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Meng de twee oplossingen die DNA (stap 1.3) en transfectie reagens (stap 1.4) en incubeer gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg voorzichtig de transfectie reagens bovenop de cellen en meng voorzichtig door het schommelen van de kamer. Incubeer 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid. </li><li> Na 24 uur wisselen de middellange tot DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 eenheden van penicilline / streptomycine. </li><li> Cellen worden afgebeeld 48-72 uur na transfectie. </li></ol> 2. Perfusie Experiment Opmerking: COS7 cellen die in dit experiment werden perfusie media kamer bij kamertemperatuur bewaard en omgeving CO2 concentratie. Indien de cellen die worden gebruikt vereisen hogere temperatuur en CO2-concentratie controle te overleven, verwarmde microscoop podium en / of een klimaatkamer worden gebruikt. <ol><li> Bereid perfusiebuffer AF (Zie lijst van materialen). Hechten kranen tot 50 ml spuiten, sluit de kranen dan vul ze met de bloedtransfusie-oplossingen. Open de kraan voor een korte periode om de kopruimte in de kraan met de buffer te vullen. </li><li> Schakel de 8-kanaals, bovenbeker perfusie-systeem met een perfusie potlood, en selecteer vervolgens &quot;Manual Mode&quot; onder Selecteer Functie optie. Plaats een afvalcontainer onder de perfusie potlood. </li><li> Handmatigactiveer de poorten door op de bijbehorende nummers en vullen de leidingen met behulp van 10 ml spuit met water en sluit de poort. Nadat de poorten zijn gevuld met water, zet de spuiten met buffers AF op de haven 1-6 van perfusie-systeem, en open de kranen. Open opnieuw de poorten om het water te vervangen in de buis met de buffers. De stroomsnelheid moet ongeveer 0,8 ml / min zijn. </li><li> Druk eenmaal op Annuleren op het perfusie controller om terug naar het menu &quot;Select Function&quot; gaan. Schakelen naar &quot;Edit Program&quot;-optie, typ dan de perfusie protocol aangegeven in tabel 1. Sla het perfusie programma. </li><li> Neem de cellen uit de incubator. Twee keer wassen met de perfusie buffer, en vervolgens de cellen op het podium. Sluit de perfusie-systeem naar de kamer. Als een open kamer wordt gebruikt, het opzetten van een andere pomp die de perfusie-oplossing uit de kamer verwijderd. </li><li> Open Slidebook software. Start een nieuwe dia. Opmerking: Devolgende procedure is specifiek voor Slidebook software, maar ook andere software zoals Metafluor en Nis-element kan ook worden gebruikt voor het type beeldvorming beschreven. Theoretisch experimenten kunnen uitgevoerd worden met elke software die tijdsverloop imaging maakt het mogelijk, en het beeld sequenties kunnen post-experimenteel worden geanalyseerd met behulp van software zoals ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) of Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Echter, software die real-time monitoring van acceptor / donor verhouding maakt is zeer nuttig. </li><li> Monteer de glijbaan op de fluorescentie microscoop podium. Vind de cellen co-uiting van de sensor en ASCT-mCherry behulp van geschikte filter sets (zie lijst van materialen) onder de functie &quot;FOCUS&quot;. Stel de versterking door te klikken op het tabblad &quot;Camera&quot; en schuiven de schuifbalk onder &quot;winst&quot;. Stel ook de filter met neutrale dichtheid instelling van grijsfilter drop-down menu. Opmerking: Als de filter kubus een oog-filter bevat, geen gebruik maken van de oculairen sinds short-golflengte excitatie licht is schadelijk voor de ogen. Gebruik het scherm om de cellen in plaats daarvan vinden. </li><li> Acquire beelden van cellen with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filters worden gespecificeerd in de lijst van materialen). Klik op &quot;Beeld vastleggen&quot;, en vervolgens in de overname-venster geeft u de filters die gebruikt gaan worden. Klik op &quot;TEST&quot; knop om de belichtingstijd aanpassen door het intypen van de gewenste belichtingstijd in het vak naast de filter instellingen. Opmerking: Alle drie kanalen moeten worden blootgesteld aan dezelfde lengte. Bij het afstellen van de beeldvormende parameters, neemt de verwachte efficiëntie FRET veranderingen en voudige toename in aanmerking: bijvoorbeeld als de FRET-efficiëntie zal naar verwachting 2-voudig tijdens het experiment gaan, beeldparameters moeten worden aangepastzodat de intensiteit van de donor af acceptor ze op de rusttoestand moet &lt;50% van de maximale waarde die kan worden opgenomen door het instrument, zodat kanaal niet verzadigd tijdens het experiment. Signaal van de gemerkte cellen ten minste drie keer hoger dan de achtergrond regio. </li><li> Teken een regio van belang het gebruik van gebieden gereedschap in de software. Alternatief kan een software functie pixels hierboven bepaalde intensiteit selecteren worden gebruikt en vervolgens omgezet in gebieden. Om dit te doen, klik Mask - Segment, verplaats de schuifbalk naar de gewenste gebieden te markeren. </li><li> Selecteer &quot;time lapse&quot; in het soort capture doos, dan geeft u het interval (10 sec in dit experiment) en tijdstippen voor het experiment. </li><li> Teken een regio in een gebied zonder fluorescerende cellen. Dit gebied wordt gebruikt voor de achtergrond aftrekken. Klik rechts op de regio getrokken, en dan instellen als achtergrond. Opmerking: Idealiter cellen die niet zijnt expressie sensoren worden gebruikt als achtergrondgebied om zowel de autofluorescentie en de achtergrond fluorescentie gedetecteerd door de camera. Indien dergelijke cellen in het gezichtsveld, tenminste een gebied zonder de cellen worden ter verwerking van de achtergrond fluorescentie. </li><li> Selecteer het gewenste programma onder &quot;Select Function - Run programma&quot; optie. Schakelen naar de opgeslagen programma (zie stap 2.3), en dan druk op ENTER op de perfusie controller. Nu het programma is geladen, en op een toets zal de perfusie te starten. </li><li> Zorgen voor perfusie en de beeldvorming experiment te starten op hetzelfde moment door te klikken op &quot;Start&quot; knop in het venster vast te leggen op hetzelfde moment als het indrukken van een toets op de perfusie controller. Opmerking: Het wordt aanbevolen om het meetpunt waar de oplossingen werden uitgewisseld (dit kan worden gedaan met behulp van &quot;OPMERKINGEN&quot; functie, te vinden in het tabblad overname) opnemen. </li><li> Voer dezelfde perfusieprotocol using cellen die een sensor die wordt verwacht verzadigd of ongebonden om onder de experimentele conditie. Opmerking: Hier, FLIPQTV3.0_1.5μ, dat verzadigd onder dezelfde voorwaarde, wordt gebruikt als controle, Figuur 6 Een dergelijke beheersing experimenten zijn nodig om te bevestigen dat de FRET efficiëntie verandering door de feitelijke verandering in het substraat en niet. door de verandering van andere parameters zoals cellulaire pH. </li></ol> 3. Post-experiment Analyse <ol><li> Onderzoeken of sample drift is opgetreden tijdens het experiment. Teken regio&#39;s van belang (ROI) s op het beeld dat bij timepoint 0, verplaats de schuifbalk aan de bovenkant van de beeldvorming venster en controleer of de cellen van de ROI&#39;s vallen in beelden later in het experiment genomen. </li><li> Zo ja, gebruik dan de tracking-functie om te corrigeren voor de drift door het eerste, het creëren van maskers rond de cellen door het selecteren Mask - Segment, schuif vervolgens de lijn die de cutoff aangeeft om highlight de gebieden met cellen. Volg de regio door te klikken Mask - Particle Tracking - Basic particle tracking. </li><li> Hertekenen de ROI en de achtergrond regio indien nodig. </li><li> Exporteren de gemiddelde intensiteit van het ROI in de loop van het experiment. Klik Statistieken - Export - Ratio / timelapse gegevens. </li><li> Bij FRET efficiëntie en kwantificering van substraatconcentratie is niet nodig, plot het tijdsverloop van de intensiteitverhouding (Donor ex Handelaar em / Donor Donor ex em) als maatstaf voor de dynamiek van het substraat. De cytosolische concentratie bepalen berekent de maximale en minimale verhouding verandering (dat wil zeggen in de verzadigende en afwezigheid van het substraat, respectievelijk), Ar max - min Ar, door niet-lineaire regressie van Δratio (Ar) met de volgende vergelijking: Ar = [S] / (K d + [S]) x (Ar <sub&gt; max - min Ar) + Ar min waarbij [S] de substraatconcentratie in het cytosol. De Ar max - min Ar verkregen waarden, verzadiging (S) van de sensor op een gegeven Ar wordt berekend als S = (Ar - Ar min) / (max Ar - Ar min) S kan verder worden omgezet in de substraatconcentratie [S] met de volgende vergelijking: S = [S] / (K d + [S]) Let op: de intensiteit van Acceptant ex Acceptant em kanaal moet ook uitgezet om te onderzoeken of de experimentele conditie beïnvloed de fluorescentie van de acceptor direct. </li><li> Wanneer een basislijn drift vanwege fotoblekingsreactie wordt waargenomen, het uitvoeren van een basislijn correctie. Om dit te doen, plot de intensiteiten van donor en acceptor in de tijd (figuur 5A). Vervolgens identificeer ik de tijdstippen gebruikt voor the basislijn volgens de vertraging bij het ​​perfusie systeem en de transportactiviteit van de bepaalde cel (Figuur 5B). </li><li> Bereken een kromme passend dat het beste beschrijft de basislijn. Dan, normaliseren de rauwe intensiteit van elk meetpunt aan de basislijn (figuur 5C). Bereken de intensiteit ratio (Donor ex Acceptor em, / Donor ex Donor em) van de genormaliseerde donor en acceptor intensiteiten. </li></ol>

<ol><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism%3A+the+intercellular+glutamine+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Enzyme+Regul%22%5BJournal%5D)">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li>
<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glutamine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Beitr+Infusionther+Klin+Ernahr%22%5BJournal%5D)">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li>
<li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glutamine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li>
<li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz-Seq%3A+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method%2C+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31(2013).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+Ca%282%2B%29+ions+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li>
<li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li>
<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li>
<li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591(2012).</li>
<li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li>
<li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+Antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li>
<li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li>
<li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li>
<li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li>
<li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine%2Fthreonine+kinases+SGK1%2C+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li>
<li>Bröer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li>
<li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2%2B+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li>
<li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors%3A+what+are+we+really+measuring%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li>
<li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712(2013).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li>
<li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%3A+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Rep%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li>
<li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity%3A+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114(2011).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
<li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li>
</ol>

Er is niets te onthullen.

Het succes van beeldvormende experimenten hangt af van een aantal kritische factoren. Een van deze factoren is de affiniteit van sensoren, zoals hierboven besproken. Absolute concentratie van het substraat in het subcellulaire compartiment van belang is echter vaak onbekend. Daarom raden we proberen meerdere sensoren met verspringende affiniteiten aan degene die het beste werkt onder de gewenste experimentele conditie te vinden. Bijvoorbeeld, in ons geval hebben we de getransfecteerde COS7 cellen met glutamine sensoren ...

Door opmerkelijke vooruitgang in technologie die onderzoek van de transcriptoom en proteoom op celniveau toelaat, is het nu duidelijk dat de biochemie en de resulterende flux van metabolieten en ionen zijn zeer specifiek celtype. Bijvoorbeeld, in de lever van zoogdieren, sequentiële glutamine afbraak en synthese gelijktijdig uitgevoerd door periportale cellen en periveneuze cellen respectievelijk toevoeren ammonium om het ureum cyclus in het eerste type cel en verbruikt overmaat ammoniak in de laatste 1-3. In sommige gevallen is significant biochemische heterogeniteit waargenomen zelfs in een &quot;celtype&quot; 4, 5. Naast dergelijke ruimtelijke specificiteit, de cellulaire niveaus van metabolieten en ionen die aan snelle veranderingen (bijv. signaalmoleculen zoals Ca2 + en cyclische nucleotiden). De spatiotemporele metabolieten en ionen spelen vaak cruciale rol in signaaltransductie. MMonitoring van cellulaire dynamiek van metabolieten en ionen, echter, vormen unieke uitdaging. In veel gevallen de verandering in concentraties snelle en voorbijgaande, geïllustreerd door het geval van signalerende moleculen zoals Ca2 +, die vervalt binnen ~ 20 msec dendritische 6. Bovendien compartimentering van biochemische pathways in en tussen de cellen maakt het moeilijk om de dynamiek van metabolieten en ionen kwantificeren middels extractie en chromatografie / massaspectrometrie technieken. Genetisch gecodeerde sensoren voor biologische moleculen worden nu op grote schaal gebruikt vanwege de hoge spatiotemporal resolutie waarmee de experimentator om kortstondige en / of gecompartimenteerde moleculaire dynamica te bestuderen (beoordeeld 7, 8). Deze genetisch gecodeerde sensoren kunnen grofweg worden onderverdeeld in twee categorieën; intensiteit gebaseerde sensoren en ratiometic sensoren. Intensiteit gebaseerde sensoren bestaan ​​doorgaans uit een bindend domein en een grieporescent eiwit (FP), en de opgeloste binding aan het bindingsdomein verandert de fluorescentie-intensiteit. Ratiometic sensoren, daarentegen, vaak gebruik maken van Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee KP die functioneren als FRET-paar. Deze sensoren bestaan ​​uit een bindend domein en twee KP&#39;s, en de opgeloste stof binding induceert de verandering in de FRET efficiëntie tussen de twee KP&#39;s. Een groot aantal sensoren voor biologische belangrijke metabolieten en ionen ontwikkeld in het afgelopen decennium 8, 9. Een van de interessante mogelijkheid die zodanig genetisch gecodeerde sensoren is hun gebruik in de hoge-resolutie analyse van membraantransport processen die voorheen moeilijk te detecteren op cellulair niveau. Genetisch gecodeerde sensoren vergemakkelijken de analyse van mechanismen vervoer, zoals substraat specificiteit en pH-afhankelijkheid 10, 11. Bovendien, in combinatie met de genetische resRONNEN zoals de bibliotheek van RNAi constructen voor modelorganismen, is het nu mogelijk om genoom-brede bevragen voor nieuwe transportprocessen met genetisch gecodeerde sensoren. Inderdaad, het gebruik van genetisch gecodeerde sensor aan de ontdekking van eerder gekenmerkte transporters in meerdere gevallen 12, 13. Onlangs heeft ons laboratorium een ​​reeks van FRET-gebaseerde sensor voor glutamine ontwikkeld. We hebben aangetoond dat cellulaire glutamine niveaus kunnen worden gevisualiseerd met behulp van dergelijke FRET glutamine sensoren 10. Deze sensoren omvatten een FRET-donor (mTFP1) ingebracht in een bacterieel glutamine bindingseiwit glnH en een FRET acceptor (venus) en de C-termini van glnH (figuur 1). FRET efficiëntie van deze sensoren verminderen na binding van glutamine, waardoor de afname van acceptor / donor intensiteitverhouding. Fijnregeling glutamine transportprocessen belangrijk in biologische processen zoals neurotransmissie 14, 15 en het behoud van ureum cyclus in de lever 1, 16, 17. Hier laten we de methodologie voor het analyseren van transportactiviteiten met FRET sensoren voor glutamine, met behulp van een wide-field fluorescentie microscoop set-up. Het doel van de experimenten hier moeten transporter activiteiten op te sporen in een vak en substraatspecificiteit van een tijdelijk tot expressie transporter onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>Een equivalent omgekeerd fluorescerend microscoop van andere leveranciers zou ook geschikt zijn.</td></tr><tr><td>Excitation filter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Bandbreedte 450-460 nm</td></tr><tr><td>Excitation filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Bandbreedte 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Bandbreedte 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Bandbreedte 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (FRET channels)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Long pass, 470 nm cut off</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (YFP channel)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry filter set</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Excitation 540-580 nm, long pass dichroic met 585 nm cut off, emissiefilter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- of halogeenlichtbron die een stabiele lichtintensiteit produceert, kwiklampen worden niet aanbevolen</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Andere perfusiesystemen die snelle oplossingsuitwisseling mogelijk maken, zouden ook werken</td></tr><tr><td>Laminar-flow chambers</td><td>C&amp;L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Ook andere laminar-flow kamers zouden werken.</td></tr><tr><td>Chambered slide</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>Voor open-kamer experimenten</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>Voor open-kamer experimenten</td></tr><tr><td>Software supporting ratiometric measurements</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Gebreikt met Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm circular glass cover slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>In het geval VC-MPC-TW wordt gebruikt</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Ook andere transfectiereagentia kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Solution A (Hank's buffer)</td><td></td><td></td><td>9,7 g HANK-zout (Sigma H1387), 0,35 g NaHCO3, 5,96 g HEPES tot 1 L, pH aangepast tot 7,35 met NaOH</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0,04 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution C</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0,2 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution D</td><td></td><td></td><td>Solution A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution E</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution F</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamine flux imaging met behulp van genetisch gecodeerde sensoren

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetisch gecodeerde sensoren mogelijk real-time monitoring van biologische moleculen op een subcellulaire resolutie. Een enorme verscheidenheid van dergelijke sensoren voor biologische moleculen werd in de afgelopen 15 jaar, waarvan werd onmisbare gereedschappen die routinematig worden gebruikt in veel laboratoria. Een van de interessante toepassingen van genetisch gecodeerde sensoren is het gebruik van deze sensoren bij het onderzoek cellulaire transportprocessen. Eigenschappen van vervoerders zoals kinetiek en substraatspecificiteiten kan worden onderzocht op een cellulair niveau, mogelijkheden te bieden voor celtype specifieke analyses van transportactiviteiten. In dit artikel zullen we zien hoe transporter dynamiek kan worden waargenomen met behulp van genetisch gecodeerd glutamine sensor als voorbeeld. Experimenteel ontwerp, technische specificaties van de experimentele instellingen, en overwegingen voor post-experimentele analyses zullen worden besproken.

Typische tijdsverloop experimenten zijn weergegeven in figuur 2. Bij deze experimenten FRET glutamine sensoren met affiniteiten van 8 mM (FLIPQTV3.0_8m figuur 2A en 2B) en 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C en D) werden co-expressie gebracht met een verplichte aminozuur wisselaar ASCT2 18 in COS7 cellen 10. Influx van glutamine wordt gedetecteerd als de verandering in fluorescentie-intensiteit verhouding tussen de donor (mTFP1) en acceptor (venus) ...

Dit artikel laat zien hoe u glutamine dynamiek in levende cellen met behulp van FRET. Genetisch gecodeerde sensoren mogelijk real-time monitoring van biologische moleculen op een subcellulaire resolutie. Experimenteel ontwerp, technische specificaties van de experimentele instellingen, en overwegingen voor post-experimentele analyses voor genetisch gecodeerd glutamine sensoren worden besproken.

Glutamine Flux Imaging Met behulp van genetisch gecodeerde Sensoren

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

Het algemene doel van deze procedure is het in beeld brengen van glutaminetransport via een heteroloog tot expressie gebrachte transporter in levende cellen met behulp van Förster-resonantie-energietransfer of FRET-sensoren. Dit wordt bereikt door eerst COS-7-cellen te transfecteren met een glutaminesensor en een transporter. De sensor bestaat uit een FRET-donor die is ingevoegd in een bacterieel glutaminebindend eiwit en een FRET-acceptor aan de C-terminus van het glutaminebindende eiwit.De tweede stap is het opzetten van een perfusiesysteem en het in real-time beelden van de cellen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De laatste stap is het analyseren van de beelden en het visualiseren van de glutaminedynamiek. Uiteindelijk kunnen transporteractiviteiten in een enkele cel worden gedetecteerd met behulp van deze FRET-sensoren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals metingsmethoden op basis van chromatografie, is dat u een veel hogere spatio-temporele resolutie verkrijgt. Deze techniek bestaat uit drie delen: transfectie van cellen met sensorproteïnen, real-time imaging en post-experimentele analyse. In dit experimen

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking...

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

This video demonstrates evaluating glutamate release and clearance at single corticostriatal synapses in a mouse brain slice. Electrical stimulation facilitates glutamate release at the synapse. The released glutamate alters sensor protein's fluorescence, which decays over time, indicating release and clearance efficiency.

Analyzing the Glutamate Release and Clearance at a Single Neuron Synapse in a Mouse Brain Slice

Een beschrijving van hoe je Förster Resonance Energy Transfer geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) kalibreren voor in situ metabool profiel wordt gepresenteerd. De FIBS kan worden gebruikt om de intracellulaire niveaus van metabolieten invasief leveren aan de ontwikkeling van metabole modellen en hoge doorvoer screening van bioproces omstandigheden te meten.

FIBS-enabled Noninvasive metabole

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

Het doel van dit protocol is te vergemakkelijken van de studie van NMDA-receptoren (NMDAR) op een grotere schaal en het onderzoek van f effecten van kleine moleculen en hun therapeutische toepassingen.

Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat

Gibberelline perceptie Sensor 1 (GPS1) is de eerste Förster resonance energie overdracht gebaseerde biosensor voor het meten van de cellulaire niveaus van Gibberelline fytohormonen met een hoge Spatio resolutie. Dit protocol rapporteert over de methode om te visualiseren en te kwantificeren van cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de genetisch gecodeerde nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls en wortel tips.

Visualiseren cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Glucoseopname is verhoogd in Drosophila motorneuronen die worden beïnvloed door TAR DNA-bindend eiwit (TDP-43) proteïnopathie, zoals aangegeven door een FRET-gebaseerde, genetisch gecodeerde glucosesensor.

Glucoseopname meten in Drosophila-modellen van TDP-43-proteïnopathie

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer glutamineflux-imaging met FRET-sensoren in levende cellen. Deze methode maakt real-time monitoring van transporteractiviteit en metabolische dynamica op subcellulair niveau mogelijk.

Glutamine Flux Imaging Met behulp van genetisch gecodeerde Sensoren

Meer video's verkennen