Glutamine Flux Imaging Met behulp van genetisch gecodeerde Sensoren

Het algemene doel van deze procedure is het in beeld brengen van glutaminetransport via een heteroloog tot expressie gebrachte transporter in levende cellen met behulp van Förster-resonantie-energietransfer of FRET-sensoren. Dit wordt bereikt door eerst COS-7-cellen te transfecteren met een glutaminesensor en een transporter. De sensor bestaat uit een FRET-donor die is ingevoegd in een bacterieel glutaminebindend eiwit en een FRET-acceptor aan de C-terminus van het glutaminebindende eiwit.

De tweede stap is het opzetten van een perfusiesysteem en het in real-time beelden van de cellen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De laatste stap is het analyseren van de beelden en het visualiseren van de glutaminedynamiek. Uiteindelijk kunnen transporteractiviteiten in een enkele cel worden gedetecteerd met behulp van deze FRET-sensoren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals metingsmethoden op basis van chromatografie, is dat u een veel hogere spatio-temporele resolutie verkrijgt. Deze techniek bestaat uit drie delen: transfectie van cellen met sensorproteïnen, real-time imaging en post-experimentele analyse. In dit experiment worden zeven cellen gebruikt vanwege hun lage endogene glutaminetransportactiviteit.

Zaai de cellen uit bij een confluentie van ongeveer 70 tot 80% in DMEM aangevuld met 10% cosmic calf serum (CCS) en 100 units per milliliter penicilline-streptomycine in een glazen bodemschaal met acht putjes. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2 en 100% luchtvochtigheid.

Vervang na 24 uur het groeimedium door DMEM plus 10% CCS zonder antibiotica en laat dit gedurende de nacht groeien bij 37 °C, 5% CO2 en 100% luchtvochtigheid. Voeg op de dag van transfectie telkens 0,4 µg van het plasma-DNA dat de glutaminesensor codeert en de getagde obligate aminozuurwisselaar m cherry A SCT toe aan 50 µL serumvrij medium.

Voeg één µL transfectiereagens toe aan 50 µL serumvrij medium, meng voorzichtig en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Meng vervolgens de oplossing met het DNA met het verdunde transfectiereagens en laat dit 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg na 20 minuten het transfectiereagensmengsel voorzichtig toe aan de cost seven-cellen en meng voorzichtig door de kamer te schudden.

Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid; vervang na 24 uur het medium door DMEM plus 10% CCS plus 100 units penicilline streptomycin. Plaats de cellen terug in de incubator voordat de perfusie wordt gestart.

Bereid perfusiebuffers A tot en met F volgens de recepten in het bijbehorende manuscript. Bevestig stopkranen aan spuiten van 50 milliliter. Sluit de stopkranen en vul de spuiten met de perfusie-oplossingen.

Open de stopkraan kortstondig om de dode ruimte in de stopkraan met de buffer te vullen. Zet vervolgens het achtkanalige zwaartekracht-perfusiesysteem aan met een perfusiependel en selecteer de handmatige modus.

Kies de selectiefunctie. Plaats een afvalbak onder het perfusiepotlood. Voor het slagen van dit experiment is het belangrijk om de perfusie zo in te stellen dat drift en overdracht van de oplossing tot een minimum worden beperkt.

Activeer de poorten handmatig door op de overeenkomstige nummers te drukken en vul de slangetjes met water. Sluit de poorten met behulp van een spuit van 10 milliliter, plaats de spuiten met buffers A tot en met F op poort één tot en met zes van het perfusiesysteem en open de stopkranen. Doe daarna het volgende.

Open de poorten opnieuw om het water in de slang te vervangen door de buffers. De stroomsnelheid moet ongeveer 0,8 milliliters per minuut zijn. Druk één keer op annuleren op de perfusiecontroller om terug te keren naar het menu voor functieselectie.

Schakel over naar de optie voor het bewerken van het programma en voer vervolgens het perfusieprotocol in dat in deze tabel wordt aangegeven. Sla het perfusieprogramma op. Cellen worden 48 tot 72 uur na transfectie gefotografeerd.

Was de wells van de glazen bodemschaal twee keer met perfusiebuffer A, waarbij u er zorg voor draagt dat de cellen niet worden weggespoeld. Plaats de glazen bodemschaal op de tafel van de fluorescentiemicroscoop. Sluit het perfusiesysteem aan op de kamer.

Indien een open kamer wordt gebruikt, stel dan een tweede pomp in die de perfusie-oplossing uit de kamer verwijdert. Open de imaging-software voor de slide book. Start een nieuwe slide met behulp van de focusfunctie en zoek cellen die de sensor en A SCT two M cherry co-expresseren met behulp van geschikte filtersets.

Pas de gain aan door op het cameratabblad te klikken en de schuifregelaar onder gain te verschuiven. Pas daarnaast de instelling van het neutraaldichtheidsfilter aan via het vervolgkeuzemenu voor het neutraaldichtheidsfilter. Klik op image capture en specificeer vervolgens in het acquisitievenster de te gebruiken filters.

Beelden worden in drie kanalen vastgelegd. Donor-excitatie, donor-emissie, acceptor-excitatie en acceptor-emissie. Klik op de testknop om de belichtingstijd aan te passen door de gewenste belichtingstijd in het vak naast de filterinstellingen te typen; alle drie de kanalen moeten gedurende dezelfde tijd worden belicht.

Teken een region of interest met behulp van de regions-tool. Selecteer time-lapse in het vak voor capture type. Specificeer vervolgens het interval en de tijdspunten voor het experiment.

Teken vervolgens een gebied in een zone zonder fluorescerende cellen om te gebruiken voor achtergrondsubtractie. Klik met de rechtermuisknop op het getekende gebied en stel dit in als achtergrond. Idealiter moeten cellen die de sensoren niet tot expressie brengen worden gebruikt als achtergrondgebied om zowel de autofluorescentie als de door de camera gedetecteerde achtergrondfluorescentie te compenseren.

Selecteer het gewenste programma onder de optie select function run programs, schakel over naar het opgeslagen programma en druk vervolgens op enter op de perfusiecontroller. Het programma is nu geladen en door op een willekeurige toets te drukken wordt de perfusie gestart, zodat zowel de perfusie als het beeldvormingsexperiment gelijktijdig starten. Klik op de startknop in het capture-venster op hetzelfde moment dat u op een toets van de perfusiecontroller drukt.

Hier worden typische tijdreeks-experimenten getoond met cellen die de asCT2-transporter en fret-glutaminesensoren met affiniteiten van 8 mM en 100 µM co-expresseren. De instroom van glutamine wordt gedetecteerd als de verandering in fluorescentie-intensiteitsverhoudingen tussen de donor mtfp1 en de acceptor Venus. De instroom van glutamine in de aanwezigheid van alanine wordt eveneens gedemonstreerd als substraat.

De specificiteit van transporteurs kan ook worden onderzocht met behulp van de sensoren. Hier werden cellen vooraf geladen met glutamine, waarna verschillende aminozuren werden toegevoegd aan het extracellulaire perfusaat. Zoals verwacht induceerden acht substraten van A ct twee de glutaminestroom, terwijl aminozuren die geen substraat waren dit niet deden.

Het uitblijven van veranderingen in de FRET-efficiëntie na toevoeging van een substraat kan verschillende oorzaken hebben, zoals de lage opnamecapaciteit voor het geteste substraat, zoals aangetoond in cellen die de acht millimolaire sensor of de 100 micromolaire sensor tot expressie brengen. Om te bevestigen dat de verandering in FRET-efficiëntie daadwerkelijk wordt veroorzaakt door de verandering in het substraat en niet door veranderingen in andere parameters, kunnen cellen worden gebruikt die de sCT2-transporter niet tot expressie brengen. Hetzelfde perfusieprotocol wordt uitgevoerd met cellen die een sensor tot expressie brengen die naar verwachting verzadigd is onder de experimentele condities.

In dit voorbeeld is de affiniteit van de sensor 1,5 micromolar. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de dynamiek van metabolieten kan worden afgebeeld met behulp van FRET-sensoren. Vergeet niet dat celkweken op de juiste wijze moeten worden behandeld volgens de standaardprocedures, zodat het risico op blootstelling wordt geminimaliseerd.