Het bestuderen van DNA Looping door Single-Molecule FRET
28 juni 2014
Deze studie geeft een gedetailleerde experimentele procedure om looping dynamiek van dubbelstrengs DNA meten met behulp van single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Het protocol beschrijft ook hoe de looping kansdichtheid genaamd de J-factor halen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om te onderzoeken hoe de loopdynamiek van dubbelstrengs DNA wordt beïnvloed door de intrinsieke vorm van DNA zonder het gebruik van DNA-bindende eiwitten. Dit wordt bereikt door kleurstofmoleculen in dubbelstrengs DNA-fragmenten met verschillende krommingen op te nemen, zodat DNA-looping kan worden gemonitord door middel van fluorescentie resonantie, energieoverdracht of fret. De omkeerbare looping- en ontloopingsgebeurtenissen van de enkele DNA-moleculen kunnen vervolgens worden waargenomen door middel van totale interne reflectiemicroscopie.
De loopingsnelheid van het DNA kan vervolgens worden extrapoleerd uit de tijdstrajecten van elke enkele molecuulfluorescensie. Uiteindelijk kan de loopingswaarschijnlijkheid van het DNA in relatie tot de intrinsieke vorm van het fragment worden gemeten. Het grote voordeel van deze DNA-looping-assay is dat het niet afhankelijk is van een A DNA-bindend eiwit, dat de loopingkinetiek van A DNA zou kunnen beïnvloeden.
Het eenvoudige protocol gaat over het gebruik van een techniek genaamd fluorescentie resonantie energieoverdracht en PCR-gebaseerde DNA-synthese. Om de looking-waarschijnlijkheid van DNA te meten, begint u met het ontwerpen van globaal gebogen DNA's door een 10 MER-sequentie te herhalen. Bijvoorbeeld, deze representatieve sequentie is een 186 basenpaar gebogen DNA, waarbij X een willekeurige extra base is en de sequenties die de herhalende 10 mers sequentie flankeren, zijn adaptersequenties.
Voer vervolgens PCR uit met primers een en twee met fret donor SI drie-labeling van primer twee aan het vijf prime-uiteinde. Voer vervolgens PCR uit met primers drie en vier met fret acceptor SCI vijf-labeling door de ruggengraat en de biotinlinker aan het vijf prime-uiteinde van primer drie. Na zuivering van de PCR-producten met behulp van een PCR-opruimingskit, meng de SCI drie-gelabelde en de SCI vijf-gelabelde producten in een buffer voor strengenuitwisseling bij een eindconcentratie van respectievelijk 0,4 micromolair en 0,1 micromolair.
Vervolgens incubeer de strengen gedurende twee minuten bij 98,5 graden Celsius, geleidelijk afkoelend tot vijf graden Celsius met een hellingssnelheid van 0,1 graden Celsius per seconde, en vervolgens incuberen bij vijf graden Celsius gedurende twee uur. Om de strengen uit te wisselen om de flow cell voor te bereiden, gebruik een boorpers en diamantboorbits om zes tot zeven paar gaten langs de twee tegenoverliggende randen van een glazen dia van drie inch bij een inch te maken. Wanneer de gaten allemaal zijn geboord, wrijf de dia onder stromend water om eventueel zichtbaar glaspoeder te verwijderen.
Plaats de dia's rechtop in een glazen pot en vul deze met gedistilleerd water. Soniceer de pot gedurende 15 minuten en breng de dia's vervolgens over in een glazen pot gewijd aan acetonreiniging. Vul de pot met aceton en soniceer de dia's in aceton gedurende nog eens 15 minuten.
Spuit vervolgens de dia's in met ethanol en vervolgens met water om ze te spoelen en breng de dia's over in een polypropyleen pot. Vul de polypropyleen pot met vijf molare kaliumhydroxide en soniceer de dia's gedurende nog eens 15 minuten na de laatste wasbeurt, spoel de dia's in gedistilleerd water, gevolgd door nog eens 15 minuten. Sonicatie, vervolgens na het reinigen de dekvlakken.
Op dezelfde manier, verdeel 80 microliter vers bereide PEG-oplossing op elke dia en leg vervolgens voorzichtig een dekglas over de peg. Gebruik na 45 minuten pincetten om de dekglazen van de dia's te verwijderen, spoel de dia's en de dekglazen af met een grote hoeveelheid gedistilleerd water. Droog ze vervolgens in een droogkast wanneer de dekglazen en dia's droog zijn, plaats dunne stroken dubbelzijdig plakband over de dia om kanalen te vormen, leg een dekglas over de stroken en druk stevig op het dekglas om vloeistofdichte kanalen te vormen.
Gebruik vervolgens vijf minuten epoxy om de randen van de kanalen te verzegelen om de moleculen te immobiliseren voor microscopie. Injecteer eerst 15 microliter neu tradin-oplossing in één kanaal. Spoel het kanaal na twee minuten met 100 microliter T 50-buffer en injecteer vervolgens 50 microliter DNA-monster in het kanaal.
Spoel na vijf minuten het ongebonden DNA weg met 100 microliter T 50-buffer en vul vervolgens het kanaal met een beeldvormingsbuffer die het zuurstofopvangsysteem bevat. Plaats nu immersieolie op het microscoopobjectief en gebruik monsterspelden om de flow cell aan de microscoopstandaard te bevestigen. Zet de 532 nanometer laser aan.
Gebruik de liveweergave van de fluorescerende beelden op de monitor om de focus fijn af te stellen. Begin de gegevensverzameling met de 532 nanometer laser aan. Stop de gegevensverzameling wanneer de meeste moleculen fotobleken om de beelden te verwerken en te analyseren, gebruik een MATLAB-script om door alle enkelmolecuultijdsporen te kijken die meerdere overgangen tussen de hoge en lage fret-signalen laten zien. Identificeer de geloopte en ontloopte toestanden en zoek vervolgens de drempel die de twee verdelingen scheidt door de kruising tussen de twee aangepaste Gaussiaanse krommen te bepalen. Bereken vervolgens de F front-efficiëntie door de sci-fi-intensiteit te delen door de som van de SCI drie- en sci-fi-intensiteiten.
Ken de looptoestanden toe met hoge fret-waarden en de ontlooptoestanden met lage fret-waarden. Gebruik vervolgens een MATLAB-script om het cumulatieve aantal moleculen of NFT te analyseren dat geloopt is, dat is dat de hoge fret-toestand heeft bereikt bij verschillende tijdsverlopen. Sinds het begin van de gegevensverzameling, kan de loopingsnelheid K sub loop vervolgens worden verkregen door de NFT te passen met een exponentiële functie.
Als NFT toeneemt bi, kan het in principe worden aangepast aan een dubbele exponentiële functie zoals geïllustreerd in de vergelijking. In dit geval wordt K sub loop verkregen uit deze vergelijking om de J-factorflow te bepalen. 20 microliters van 30 tot 50 picaMolar biotin SCI vijf oligo of primer drie in een van de met nut travain gecoate kanalen zoals zojuist is aangetoond.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de looping-dynamiek van dubbelstrengs DNA door gebruik te maken van single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Het protocol maakt het mogelijk om de waarschijnlijkheidsdichtheid van de looping te meten, aangeduid als de J-factor, zonder de invloed van DNA-bindende eiwitten.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biofysica
- Moleculaire biologie
- DNA-dynamica
Achtergrond
- DNA-looping is een cruciaal proces bij genregulatie.
- Inzicht in de intrinsieke vorm van DNA kan leiden tot nieuwe inzichten in de functionele dynamiek ervan.
- Traditionele methoden zijn vaak afhankelijk van DNA-bindende eiwitten, die de kinetiek van het looping-proces kunnen beïnvloeden.
- Deze studie heeft tot doel de looping-dynamiek te meten zonder dergelijke eiwitten.
Doel van de studie
- Om te onderzoeken hoe de intrinsieke vorm van dubbelstrengs DNA de looping-dynamiek beïnvloedt.
- Om een methode te ontwikkelen voor het monitoren van DNA-looping met behulp van FRET.
- Om de looping-waarschijnlijkheid van DNA-fragmenten met verschillende krommingen te kwantificeren.
Gebruikte methoden
- Inbouw van kleurstofmoleculen in dubbelstrengs DNA-fragmenten.
- Monitoring van DNA-looping via fluorescentie-resonantie-energietransfer (FRET).
- Observatie van reversibele looping-gebeurtenissen met behulp van totale interne reflectiemicroscopie.
- Extrapolatie van looping-snelheden uit fluorescentietijdstrajecten van enkelvoudige moleculen.
Belangrijkste resultaten
- De studie heeft met succes de looping-dynamiek van DNA zonder bindende eiwitten gemeten.
- Looping-snelheden waren gecorreleerd met de intrinsieke vorm van de DNA-fragmenten.
- De methode biedt een betrouwbare manier om de waarschijnlijkheid van DNA-looping te beoordelen.
- Resultaten wijzen erop dat intrinsieke DNA-kromming de looping-gecertifieerd significant beïnvloedt.
Conclusies
- Deze assay biedt een nieuwe benadering voor het bestuderen van DNA-dynamiek.
- De resultaten verbeteren het begrip van DNA-loopmechanismen.
- De methode kan worden toegepast om DNA-eiwitinteracties verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Inzicht in de intrinsieke DNA-kromming biedt voorspellende waarde voor doelwitvalidatie bij therapeutica op basis van nucleïnezuren en studies naar genregulatie. Deze single-molecule FRET-benadering maakt mechanische risicoanalyse mogelijk door de kinetiek van DNA-loopvorming te isoleren van eiwitgemedieerde artefacten. De methode ondersteunt vroege ontdekking door te kwantificeren hoe sequentieafhankelijke vorm biomoleculaire interacties beïnvloedt die relevant zijn voor het ontwerp van oligonucleotiden.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt hoe de intrinsieke DNA-vorm de toegankelijkheid van het doelwit beïnvloedt voor therapeutische oligonucleotiden.
- Operationele waarde: Maakt hypothesetesten van DNA-structurele varianten mogelijk zonder storende effecten van eiwitbinding.
- Voorspellende waarde: Kwantificeert de looping-waarschijnlijkheid (J-factor) om doelwitten met gunstige biofysische profielen te prioriteren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve read-outs op enkelvoudige-molecuulniveau van de conformationele dynamiek van DNA.
- Operationele waarde: Genereert reproduceerbare FRET-trajecten die geschikt zijn voor de standaardisatie van assays tussen laboratoria.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt parallelle testen van DNA-varianten ter ondersteuning van lead-identificatie bij nucleic acid screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Koppelt de intrinsieke DNA-structuur aan functionele resultaten in genreguleringsroutes.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen verschillen in looping voortvloeien uit de sequentie in plaats van epigenetische of eiwitfactoren.
- Relevantie voor preklinische modellen: Biedt een biofysische benchmark voor het evalueren van DNA-doelgerichte verbindingen in ziekterelevante systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de vroege ontdekkingsfase om lead-optimalisatie te ondersteunen door biofysische gegevens te verschaffen over de conformatie van het DNA-doelwit.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over hoe DNA-kromming de blootstelling van de doelsite beïnvloedt.
- Screening: Levert kwantitatieve looping-snelheden om DNA-varianten onder identieke buffercondities te vergelijken.
- Analytics: Extraheert de J-factor uit looping- en annealing-snelheden, wat vergelijking tussen verschillende DNA-constructen mogelijk maakt.
- Translational Research: Verbindt DNA-structuur met functioneel looping-gedrag dat relevant is voor nucleaire processen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van DNA-targetingmodaliteiten over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in DNA-proteïne- of DNA-ligandstudies door intrinsieke vormeffecten te isoleren.
- Operationele waarde: Levert ligand-onafhankelijke kinetiek op enkelvoudige molecuulniveau met een hoge temporele resolutie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege biofysische validatie van nucleïnezuurdoelwitten te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van oligonucleotiden mogelijk op basis van DNA-structurele compatibiliteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie op enkelmolecuulniveau en berekeningen van de FRET-efficiëntie.
- Vereist TIRF-compatibele instrumentatie, laserexcitatie (532 nm) en zuurstofvrijmaaksystemen voor langdurige beeldvorming.
- Vereist gestandaardiseerde DNA-zuiverings- en strengenuitwisselingsprotocollen om consistente annealingsnelheden te waarborgen.
- Omvat optimalisatie van biotin-streptavidine oppervlaktepassivering om aspecifieke binding te minimaliseren.
- Beperkt tot DNA-constructen die geschikt zijn voor PCR-gebaseerde synthese met compatibele flankerende sequenties voor strengenuitwisseling.
