Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door

Het algemene doel van deze procedure is om vroege interacties tussen gastheer en pathogeen en het invasiepotentieel van TBA.Histolytica te beoordelen. Maak eerst preparaten van intacte trofozoïten, de trofozoïten, totale lysaten of de uitgescheiden trofozoïten. Incubeer vervolgens gastheer-epitheelcellen met passende concentraties van de verschillende trofozoïten.

Analyseer nu met behulp van AM-immunofluorescentie de behandelde epitheelculturen op geselecteerde Entamoeba histolytica-eiwitten die interageren met de tight junctions van de epitheelcellen; meet daarnaast veranderingen in de paracellulaire barrière door middel van transepitheliale elektrische weerstand. Samen kunnen de resultaten de afbraak van tight junctions door E. histolytica aantonen en tevens de betrokkenheid van de geselecteerde complexen bij dit proces pinpointen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het gebruik van verschillende producten van de parasiet om de translocatie van E. histo-factoren naar het epitheel van de gastheer te evalueren, alsofom de participatie van deze factoren aan te tonen.

Zijn factoren bij de opening van verbindingen van hele cellen op zeer vroege tijdstippen van infectie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de amebiasis, zoals het begrijpen van de moleculaire interacties tussen het epitheel en de diva isli parasiet. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat ze de juiste incubatietijden, de verhouding van de twee celtypen voor co-incubatie, en ook hoe men de verschillende ELI-producten verkrijgt en hoe TER gemeten moet worden, niet kennen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze therapie voor amis, aangezien deze virale factoren, zoals het E-H-C-P-A-D-H 112-complex, kunnen worden benut als doelwitten in nieuwe behandelstrategieën. Vier. Deze in vitro methode kan inzicht bieden in de participatie van de Anica-virale factor bij de initiële interactie met de gastheerplaats. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals in vivo infectiemodellen in hamsters, muizen, cavia's en ook in menselijke darmbiopten. Cultuur.

De MDCK-cellen in 10 milliliters gesuppleerd DMEM-medium bij 5% carbon dioxide en 37 degrees Celsius. Kweek authentiek 1 times 10 to the fifth trofozoïten van Entamoeba histolytica in 15 milliliters TYIS 33-medium bij 37 degrees Celsius. Om de trofozoïten los te maken, koel de buis gedurende vijf tot 10 minuten af in een ijswaterbad.

Breng de cultuur vervolgens aseptisch over naar een conische buis en centrifugeer 10 minuten bij 360 ×g bij vier °C. Decanteer nu voorzichtig het supernatant. Voeg ijskoud PBS toe aan het pellet en keer de buis meerdere keren om om de cellen na centrifugatie te dispergeren.

Bepaal het aantal trofozoïeten met een hemocytometer. Lyseer de trofozoïeten door ze één minuut lang snel te bevriezen in vloeibare stikstof, ontdooi bij 4 °C en vortex krachtig. Activeer vervolgens de proteasen in de lysaten met 0,02% beta-mercaptoethanol. Verdun 9 × 10⁶ trofozoïeten in 3 mL ijskoud PBS en breng de cellen over naar een conische buis van 50 mL.

Plaats de tropho-suspensie nu onder een horizontale hoek van vijf graden in een incubator van 37 °C gedurende twee uur om de uitgescheiden producten op te vangen, en centrifugeer de buis vervolgens bij 360 ×g gedurende 10 minuten. Gebruik een wegwerpspuit die steriel is om voorzichtig het supernatant op te vangen, waarbij contaminatie van de monsters met trofozoïeten uit het pellet moet worden vermeden. Om eventueel overgedragen cellen te elimineren, wordt het supernatant vervolgens door een celluloseacetaatmembraan van 0,22 micron geleid.

Activeer nu de proteasen met 0,02% beta-mercaptoethanol voor de immunofluorescentiecultuur. De MDCK-cellen bevinden zich op steriele glazen dekglasjes in een 24-well cellenkweekplaat. Inspecteer de cellen met de omgekeerde microscoop totdat ze 100% confluentie bereiken.

Voeg de verschillende condities van trofozoïeten toe, verdund in één milliliter warme PBS. Neem de controlecondities op van MDCK-cellen met PBS zonder E. histolytica, evenals MDCK-cellen met de verschillende condities van trofozoïten, maar zonder incubatie met primaire antilichamen. Plaats de kweekplaat gedurende twee of 30 minuten in de incubator.

Was daarna de epitheelcellen vijf keer met koud PBS om ongebonden moleculen of trofozoïeten te verwijderen. Fixeer en permeabiliseer de cellen met één milliliter 96% ethanol gedurende enkele minuten bij -20 °C in een vochtige kamer. Neem de dekglasjes voorzichtig uit de wells.

Verwijder overtollige vloeistof van de rand met filterpapier en dompel het dekglas met de cellen naar beneden in een 0,5% BSA-blokkeringsoplossing. Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen een mengsel van primaire antilichamen in PBS.

Til de dekglasjes op uit de blokkeringsoplossing. Droog eventueel overtollige vloeistof af op filterpapier. Breng de cellen over naar de antilichaamoplossing en incubeer de monsters een nacht bij 4 °C.

Was de cellen vijf keer met één milliliter PBS om ongebonden moleculen te verwijderen. Bereid nu een mengsel van de twee fluorescente secundaire antilichamen in PBS. Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker met de secundaire antilichamen voor kernkleuring.

Incubeer de cellen gedurende drie minuten met 200 µL van een 0,05 mM dappy-oplossing bij kamertemperatuur in het donker. Analyseer vervolgens de preparaten met confocale microscopie via Zack-secties en XZ-vlakken in co-incubatie-experimenten. Incubeer elke experimentele conditie gedurende 20 minuten bij 4 °C met protease-remmers of een monoklonale antilichaamcultuur, gebruikmakend van protease-remmers of een specifiek antilichaam.

Plaats 100 µL van de cellsuspensie op steriele permeabele transwell-ondersteuningen in het bovenste compartiment en plaats 600 µL aangevuld DMEM-medium in het onderste compartiment. Plaats de voorbereide transwell-filters in de incubator op een omgekeerde microscoop. Verifieer dat de cellen 100% confluent zijn.

Verzamel het medium uit het bovenste compartiment van elke transwell en voeg dit samen tot 50 µL van dit mediummengsel. Voeg 50 µL trofozoïetensuspensie of PBS-controle toe. Breng de mengsels vervolgens over naar het bovenste compartiment van elke transwell met de MDCK-cellen.

Dompel de twee STX-elektroden onmiddellijk in elke transwell om de transepitheliale elektrische weerstand te meten. Zorg ervoor dat de langere elektrode de bodem van de onderste kamer raakt en dat de kortere elektrode bedekt is door medium in het bovenste compartiment. De E histolytica werden gekweekt onder accent-condities en geoogst tijdens de late logaritmische tot vroege stationaire groeifase.

Hier werd de tight junction-marker ZO-1 gebruikt om de celcontacten van epitheelcellen te visualiseren die worden gestabiliseerd door tight junctions en adherens junctions. Immunofluorescentie met het monoklonale antilichaam werd gebruikt om de interactie van het uit amoebe afgeleide complex met het epitheeloppervlak te bestuderen; de applicatie van trofozoïeten, totale lysaten of gesecreteerde producten op de epitheelmonolaag resulteerde in colocalisatie van het complex met de tight junctions. Na 30 minuten ontwikkelde zich een discontinue ZO-1-kleuring bij de celgrenzen en vond internalisatie in blaasjes plaats.

Deze verstoring was het meest prominent in de contacten tussen MDCK-cellen en trofozoïten. Confocale laser-microscopie van totale lysaten wees uit dat het virulentiecomplex doordrong naar de intercellulaire ruimte. Co-lokalisatie met de verstoorde ZO-1-kleuring bij contact met de parasiet verstoorde de barrièrefunctie van het epitheel en resulteerde in een daling van 90% van de transepitheliale elektrische weerstand.

Pre-incubatie van de trofozoïten met een antilichaam tegen het complex of met protease-remmers resulteerde in bescherming tegen de waargenomen daling van de TER. Samen suggereren deze gegevens dat zowel de proteolytische activiteit als de adhesieve eigenschappen belangrijke virulentiefactoren van dit complex zijn tijdens de invasie door E. histolytica. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de mechanismen kunt analyseren waarmee virulentiefactoren van E. histolytica tight junctions openen tijdens vroege infectietijden. Wanneer u deze methode beheerst, kan de analyse van epitheliale schade in drie uur worden voltooid, zodra de lysisproducten en celculturen gereed zijn.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om strikt vast te houden aan de exacte interactietijden voor ionen volgens dit protocol. Andere methoden, zoals immunoprecipitatie-assays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals mogelijke associaties tussen virulentiefactoren van E. histolytica en epitheliale eiwitten na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van adhesie-interacties om de pathogenese van AMS te onderzoeken in hamsters, cavia's en in menselijk weefsel.