Multi-step Voorbereiding Techniek om meerdere Metabolite Compound Klassen voor In-diepte en Informatieve Metabolomic Analyse Recover
11 juli 2014
De betrouwbaarheid van de resultaten in metabolomics experimenten afhankelijk van de effectiviteit en de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding. Beschreven is een strenge en diepgaande methode die extractie van metabolieten van biologische vloeistoffen maakt met de mogelijkheid om later te analyseren tot duizenden verbindingen, of gewoon de verbinding klassen van belang.
Het algemene doel van deze procedure is om een effectieve methode te demonstreren voor het fractoneren van metabolieten in complexe biologische vloeistoffen om vereenvoudigde monsters te verkrijgen voor een betere dekking van het metaboloom. Dit wordt bereikt door eerst elk monster te spiken met interne standaarden om de reproduceerbaarheid van monstervoorbereiding en instrumentcondities te controleren. De tweede stap is om ijskoud methanol toe te voegen aan elk monster om de eiwitten te bezinken die anders zouden kunnen interfereren met de daaropvolgende chromatografie en analyse door middel van massaspectrometrie.
Vervolgens scheidt de vloeistof-vloeistof extractiestap de hydrofiele van de hydrofobe metabolieten. De laatste stap is vastefase extractie om de lipide metabolieten verder te fractoneren in fosfolipiden, vetzuren en neutrale lipiden. Uiteindelijk wordt deze gecombineerde meertrapsmethode gebruikt om effectieve scheiding, uitstekende reproduceerbaarheid en verbeterde dekking van het plasmametaboloom te laten zien.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals een eenvoudige methanolextractie, is dat we een verbeterde metabolietendekking verkrijgen, vooral van lipiden, wat belangrijk is bij het uitvoeren van metabolomics-profileringsstudies of wanneer lipiden van bijzonder belang zijn. Voorafgaand aan eiwitbezinking, bereidt u de monsters eerst voor door de monsters te ontdooien tot kamertemperatuur. Vervolgens spike je de monsters met interne standaarden ISTD die eerder zijn bereid.
Alle standaardconcentraties zijn aangepast zoals nodig op basis van de gevoeligheid van de gebruikte MS en HPLC instrumentatie. Voor analyse, spike elk monster met 10 microliters. Elke hydrofiele en hydrofobe standaardoplossing spike elk monster met 10 microliters van een x twee x of vier x positieve controleoplossing.
Nadat alle monsters zijn gespikt met interne standaarden en positieve controleoplossingen, worden elk monster gedurende 10 seconden gevormd. Om eiwitbezinking te starten, voegt u 400 microliters ijskoud methanol toe aan elk monster. Vorm gedurende 10 seconden per buis en centrifugeer bij nul graden Celsius gedurende 15 minuten bij 18.000 keer.
G. Er zou een eiwitpelletje op de bodem van de buis moeten vormen. Na centrifugeren wordt het supernatans overgebracht naar een nieuw glazen kweekbuisje en vervolgens gedroogd onder stikstof. Dit gedroogd residu zal later ondergaan vloeistof-vloeistof extractie.
Voor analyse van de eiwitpelletjefractie, voegt u één milliliter methyl turt kever ether of MTBE toe aan het witte of gebroken witte eiwitpelletje, vorm gedurende 30 seconden per buis en centrifugeer bij nul graden Celsius gedurende 15 minuten bij 18.000 keer.
G. Decanteer de MTBE-laag naar een nieuw glazen kweekbuisje. Aangezien de grootte van het pellet tussen monsters zal variëren, is het belangrijk om consistent dezelfde hoeveelheid MTBE voor alle monsters aan te zuigen.
Bijvoorbeeld, als er slechts 900 microliters kan worden gedecanteerd voor het monster met de minste hoeveelheid supernatant, dan decanteer 900 microliters. Voor alle monsters, voeg nog een milliliter MTBE toe aan het eiwitpelletje, vorm gedurende 30 seconden en centrifugeer bij nul graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg 18.000 keer G toe zoals eerder, zuig de MTBE-laag aan en voeg toe aan de glazen kweekbuisjes die eerder zijn voorbereid.
Droog de monsters met stikstofstroom en resuspendeer in 200 microliters van een-op-een chloroform-methanol. Breng elk monster over in een centrifugeerbuisje en centrifugeer bij nul graden Celsius gedurende 15 minuten bij 18.000 keer G. Gebruik vervolgens glazen pipetten om het supernatans over te brengen naar autosampler schroefdopbuisjes. Gebruik voor het starten van deze procedure een glazen pipet om drie milliliters MTBE toe te voegen aan het eerder bereide droge methanolresidu en vorm gedurende 30 seconden.
Voeg vervolgens 750 microliters water toe aan elke buis en vorm gedurende 10 seconden. Centrifugeer bij ongeveer 200 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, twee verschillende lagen zijn zichtbaar. Na centrifugatie, zuig voorzichtig 2,5 milliliter van de bovenste MTBE-laag zonder de onderliggende waterige laag te pipetten en breng over naar een schone glazen kweekbuis.Twee. Voeg drie milliliters MTBE toe aan het resterende watergedeelte van elk monster.
En vorm gedurende 10 seconden per buis, centrifugeer bij ongeveer 200 keer G gedurende 10 minuten. Bij kamertemperatuur, zuig drie milliliters MTBE zonder water op en combineer met de vorige MTBE-buis. Deze MTBE-fractie zal ondergaan vastefase extractie later.
Concentreer de resterende waterige laag door te drogen onder stikstof. Resuspendeer het residu in 100 microliters van één, en voeg 400 microliters ijskoud methanol toe aan elke buis, vorm en breng vervolgens over naar een microcentrifugebuisje. Laat staan bij negentig graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om eventueel overgebleven eiwit in de methanol te laten bezinken.
Centrifugeer vervolgens bij nul graden Celsius gedurende 15 minuten bij 18.000 keer G, er zou een bezinksel langs de zijkant van de buis moeten zijn na centrifugatie, zuig 450 microliters supernatans af zonder het bezinksel te zuigen en breng over naar een schone microcentrifugebuis. Droog volledig in een vacuümcentrifuge concentrator bij niet meer dan 45 graden Celsius gedurende ongeveer een tot twee uur. Resuspendeer het gedroogde supernatans in 200 microliters 5% acetyl nitril water en vorm.
Breng monsters kort over in autos, sampler, vials, en vries in bij negentig graden Celsius. Om het proces voor vastefase extractie te starten, droogt u de eerder verkregen MTBE-fractie onder een goede stikstofstroom bij 35 tot graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Wanneer de MTBE-fracties volledig droog zijn, stopt u de stikstofstroom en suspendeert u snel elk monster in één milliliter chloroform met behulp van een glazen pipet en vorm.
Was en conditioneer de vastefase extractie of SPE cartridge twee keer kort met 400
Overzicht
Dit artikel presenteert een uitgebreide methode voor het extraheren van metabolieten uit biologische vloeistoffen, waardoor de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van metabolomics-studies worden verbeterd. De techniek maakt de analyse van een breed scala aan verbindingen mogelijk, met een bijzondere focus op lipidemetabolieten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Metabolomics
- Voorbereiding van biologische monsters
- Massaspectrometrie
Achtergrond
- Metabolomics is afhankelijk van een effectieve monstervoorbereiding voor betrouwbare resultaten.
- Complexe biologische vloeistoffen vereisen zorgvuldige fractionering om de analyse te vereenvoudigen.
- Bestaande methoden missen vaak een uitgebreide dekking van metabolieten.
- Verbeterde technieken zijn essentieel voor profileringsstudies, met name met betrekking tot lipiden.
Doel van de studie
- Om een meerstapsmethode voor metabolietextractie te demonstreren.
- Om de dekking van het plasmametaboloom te verbeteren.
- Om de reproduceerbaarheid in metabolomics-experimenten te vergroten.
Gebruikte methoden
- Toevoegen van interne standaarden aan monsters voor het monitoren van de reproduceerbaarheid.
- Proteïneprecipitatie met gebruik van ijskoude methanol.
- Vloeistof-vloeistofextractie om hydrofiele en hydrofobe metabolieten te scheiden.
- Vaste-fase-extractie voor verdere fractionering van lipide metabolieten.
Belangrijkste resultaten
- Effectieve scheiding van metabolieten behaald via de beschreven methode.
- Uitstekende reproduceerbaarheid aangetoond over verschillende monsters.
- Verbeterde dekking van lipide metabolieten in vergelijking met traditionele methoden.
- De effectiviteit van de methode voor metabolomics-profielstudies is gevalideerd.
Conclusies
- De extractiemethode in meerdere stappen verbetert de metabolietenanalyse aanzienlijk.
- Een verbeterde lipidendekking is cruciaal voor uitgebreide metabolomics-studies.
- Deze techniek biedt een betrouwbare aanpak voor onderzoekers in dit vakgebied.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze meerstaps fractioneringstechniek voor metabolieten pakt een kritiek knelpunt in de metabolomica aan: inconsistente monstervoorbereiding die leidt tot onbetrouwbare gegevens. Door een verbeterde dekking van lipidemetabolieten en een reproduceerbare scheiding van verbindingenklassen mogelijk te maken, vergroot het de voorspellende betrouwbaarheid in workflows voor targetvalidatie en de ontdekking van biomarkers. De methode ondersteunt het verminderen van risico's bij vroege ontdekkingshypothesen door middel van chemisch onderbouwde fractionering, wat een direct effect heeft op de prioritering van portfolio's binnen lipid-centrische ziektebeelden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om lipide-gemedieerde therapeutische hypothesen te onderzoeken door vetzuren, neutrale lipiden en fosfolipiden te scheiden voor gerichte analyse.
- Operationele waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door verrijking van chemische klassen, wat leidt tot een betrouwbaardere identificatie van metabolieten bij de elucidatie van signaalpaden.
- Voorspellende waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via het herstel van interne standaarden over verschillende fracties, wat de betrouwbaarheid van gegevens versterkt voor go/no-go-beslissingen bij de prioritering van targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gefractioneerde monsters met een verminderde chemische complexiteit, waardoor een nauwkeurigere en gevoeligere detectie van metabolieten met een lage abundantie in screeningscampagnes mogelijk is.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding voor zowel hydrofiele als hydrofobe fracties, wat de reproduceerbaarheid van assays en de doorvoersnelheid in metabolomics-platforms verbetert.
- Strategische waarde: Faciliteert het hergebruik van platforms door bewaardbare fracties (bijv. protein pellet) te genereren voor retrospectieve analyse, waardoor de efficiëntie van de verbindingsevaluatie toeneemt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelevante systemen door fractionering mogelijk te maken van plasma, BALF en CSF — cruciale vloeistoffen in modellen voor inflammatoire, neurodegeneratieve en metabole ziekten.
- Operationele waarde: Garandeert translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door middel van consistente metabolietdekking en fractiespecifieke analyse.
- Risicobeperking: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in biomarkerpanels door het aantal fout-negatieven bij de detectie van lipidemetabolieten te verminderen dankzij een verbeterde klasse-specifieke recovery.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, met name daar waar lipidenmetabolisme mechanistisch relevant is voor een ziekte of de respons op een geneesmiddel.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van pathways en biologische risicoreductie door het isoleren van lipideklassen die betrokken zijn bij signalering, ontsteking en membraandynamiek.
- Screening: Levert assay-klare fracties met kwantitatieve output die geschikt zijn voor het vergelijken van de effecten van verbindingen op het lipidenmetabolisme.
- Analytics: Maakt vergelijking tussen fracties mogelijk via normalisatie met een interne standaard, wat statistisch robuuste resultaten oplevert voor de vergelijking van condities.
- Translationeel Onderzoek: Zorgt voor preklinische continuïteit via fractiespecifieke analyse van biomarkers in ziekte-relevante vloeistoffen zoals CSF en plasma.
- Enterprise Reuse: Positioneert de workflow als een herbruikbare capaciteit, waarbij opgeslagen pellets en fracties iteratieve analyse mogelijk maken zonder herhaalde extractie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij de identificatie van metabolieten door scheiding van chemische klassen en verminderde spectrale overlap.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via monitoring met een interne standaard en consistente fractionering over verschillende monstertypes.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verminderen van fout-negatieven in de analyse van lipidepaden, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verlaagd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van uitgebreide dekking van lipide-metabolieten in ziektemodellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in lipidebiochemie en fractioneringstechnieken om klasse-specifieke resultaten te interpreteren.
- Is afhankelijk van toegang tot centrifugatie, vacuümconcentratoren en glaswerk dat compatibel is met chloroform, MTBE en ethylether.
- Vereist standaardisatie van solventvolumes en aspiratieprotocollen tussen teams om reproduceerbaarheid tussen locaties te waarborgen.
- Omvat aanpassingen voor variërende monstervolumes (tot wel 50 µL) en vloeibare matrices zoals plasma, BALF of CSF.
- Omvat praktische beperkingen zoals het hanteren van gevaarlijke solventen (chloroform, MTBE, ethylether), waarvoor gebruik van een zuurkast en PBM is vereist.
