In Situ Detectie van autoreactieve CD4 T-cellen in de hersenen en het hart met behulp van Hoofdhistocompatibiliteitscomplex Klasse II Dextramers

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van zelfreactieve T-cellen met een hoge mate van specificiteit met behulp van MHC-klasse II-dextrimers. In deze video wordt cerebrum geoogst uit de hersenen van een muis met experimentele auto-immuun encefalomyelitis, geïnduceerd door myelin proteolipid proteïne. Dit wordt bereikt door eerst zorgvuldig de weefsels te oogsten en de paraffinblokken voor te bereiden.

De tweede stap is het snijden van het in wax ingebedde weefsel in secties van 200 micrometer dik met een microtoom. De secties worden vervolgens overgebracht naar weefselkamers in een 24-wells plaat, waar ze worden gekleurd en gefixeerd. De laatste stap is het monteren van de weefselsecties op microscopische objectglazen.

Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om de cellen aan te tonen die gebonden zijn aan dex-trimers en CD4-antilichamen. We bedachten dit idee toen we voor het eerst aantoonden dat MHC-klasse II dextro-ER's gevoeliger waren dan de conventionele MHC-klasse II tetrameren voor het detecteren van antigeenspecifieke zelfreactieve CD4 T-cellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het snijden van verse weefsels en de handling daarvan vrij uitdagend is.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het snijden, monteren en analyseren lastig aan te leren zijn omdat ze technisch uitdagend zijn. Naast Ting zullen Chandy en Aaron, twee postdoctorale onderzoekers uit mijn groep, en Christian uit het laboratorium van Dr. Zoe deze procedure demonstreren. Graaf na de euthanasie van muizen met experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) de schedel uit door het cranium in een cirkelvormige beweging door te knippen met een gebogen schaar en klap de schedelbeenderen voorzichtig om met een pincet. Neem het brein uit via botte dissectie met een schoon scalpel.

Scheid de rerum van het cerebellum. Plaats de rerum in een buis met koude one x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS en laat de buis op ijs staan tot de verwerking. Plaats de rerum in een wegwerpbodemschal cassette voor histologie die op ijs wordt bewaard.

Giet vervolgens gesmolten 4% PBS-gebufferde laagsmeltende agarose in de cassette. Druk het cerebrum onmiddellijk voorzichtig met een pincet aan om het weefsel onder te dompelen en laat de cassette op ijs staan tot de stolling voltooid is. Trim na stolling de overtollige agarose aan alle zijden van het ingebedde weefsel en leg het ventrale oppervlak van het cerebrum licht bloot.

Smeer vervolgens het Vibram-weefselblok in met secondelijm en breng het in ROS ingebed weefsel over op het gelijmde oppervlak door het blootgestelde ventrale oppervlak van het cerebro op de lijm te plaatsen voor transversale sectieering. Verplaats het weefsel niet zodra het op het blok is vastgezet. Plaats het vibrate tone-blok met het in ROS ingebed weefsel op ijs en laat de lijm 15 minuten drogen.

Plaats in de tussentijd de voorbereide weefselkamers in een plaat met 24 putjes, met één kamer per putje. Vul de putjes met de weefselkamers met één milliliter koud 1X PBS en laat de plaat op ijs staan. Zodra de lijm droog is, brengt u het vibram-mes naar het niveau van het bovenste oppervlak van het weefsel.

Stel de snelheid van de Vibram in op 0,22 millimeter per seconde en begin met het snijden met een voorwaartse beweging om coupes van 200 micrometer dik te maken. Gebruik een zachte aquarelpenseel om één cerebrale coupe in elke weefselkamer over te brengen. Houd de 24-wells plaat op ijs totdat het snijden voltooid is om degradatie van het weefsel te voorkomen.

Bereid vervolgens een tweede 24-wellplaat voor door 300 µL van een cocktail bestaande uit IA van S myelin protio lipid protein 1 39 tot 1 51 dextro en CD4-antilichaam aan drie van de wells toe te voegen. Voeg daarna 300 µL van de controle-cocktail van IA van S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 tot 86 dextro en CD4-antilichaam toe aan een andere set van drie wells. Ga over tot het labelen van de wells.

Overbreng vervolgens drie weefselkamers met de coupes die bestemd zijn voor kleuring met specifieke dex-trimmers naar de drie aangewezen wells van de 24-wells plaat, met één kamer per well. Overbreng op dezelfde wijze de drie weefselkamers met de coupes die bestemd zijn voor kleuring met gecontroleerde dex-streamers naar de betreffende wells. Dek de wells, met één kamer per well, af met een deksel.

Wikkel de plaat in aluminiumfolie en plaats de plaat gedurende 1,5 uur in het donker bij kamertemperatuur op een schudplatform dat is ingesteld op een zachte rotatie. Was na de incubatieperiode de weefselsneden door deze over te brengen naar een nieuw putje met één milliliter koude one XPBS wash gedurende ten minste 10 minuten op het schudplatform. Herhaal deze wasstap drie keer.

Zorg ervoor dat de weefselcoupes niet uitdrogen, omdat ze anders aan de wanden van de kamer kunnen plakken. Fixeer de coupes door de weefselkamers over te brengen naar een nieuw putje van de 24-wells plaat die één milliliter gefilterde 4% PBS-gebufferde paraformaldehyde bevat, en incubeer twee uur op een schudplatform met rustige rotaties.

Nadat de coupes nog drie keer extra zijn gewassen, worden de gekleurde en gefixeerde coupes op een schone microscopische objectglas geplaatst. Gebruik een zachte aquarelpenseel om overtollig water weg te vegen zonder de coupe aan te raken en monteer de coupe met een monteermiddel. Dek af met een microscopisch dekglas en laat de preparaten een nacht drogen bij kamertemperatuur.

Gebruik in de donkere kamer een Nikon A one Eclipse 90 I confocale microscopiesysteem voor routinematige scanning en acquisitie van beelden. Open ter start de NIS elements AR software en kies uit het paneel de kanalen voor tetraethylrhumine-isothiocyanaat (TRITC) en cyanine 5 (Cy5). De excitatie- en emissiegolflengten voor de TRITC- en Cy5-kanalen verschijnen standaard.

Wijs de pseudokleur groen toe aan het Trit Sea-kanaal en rood aan het SCI five-kanaal. Plaats de te onderzoeken slide op de microscooptafel en focus handmatig bij een vergroting van 100 keer. Stel de HV in op 10 en de offset op nul, klik op focus en pas de spanning aan.

Om de lasers te optimaliseren, klikt u op focus scan om de sectie van boven naar beneden te scannen en stelt u het Z-niveau in voor beeldacquisitie. Klik vervolgens op CH series om de beelden sequentieel vast te leggen. Identificeer dextro of positieve CD4+ T-cellen, die verschijnen als gele punctate cellen op basis van colocalisatie van signalen gegenereerd door zowel het rode als het groene kanaal.

Gebruik een Olympus FV 500 BX 60 confocale microscoop voor een eenvoudige kwantitatieve telling van dextro- of positieve CD4-positieve T-cellen. Open eerst de flu ovu-software. Selecteer de kleurstoffen S SI three en SCI five uit het vervolgkeuzemenu en klik op apply om de betreffende lasers te laden.

Plaats de te onderzoeken preparaatglas op de microscooptafel en stel dit handmatig scherp onder lage vergroting; klik op focus terwijl de SI3-laser aan is en stel de inflammatoire focus scherp. Wijzig het objectief naar een vergroting van 100 keer. Stel de bestandsgrootte in op 512 x 512 via het vervolgkeuzemenu, klik op focus en pas de waarden voor de PMT-gain en offset aan om de lasers afzonderlijk te optimaliseren voor SI3 en SI5, klik op Z-stage en klik vervolgens op focus terwijl beide lasers aan zijn.

Stel de dikte van de Z-stap in door op de pijl omhoog en omlaag te klikken. Stel het Z-interval in op twee micrometers. Klik op stop en maak een keuze.

Zoek 1, 2, 3. Klik vervolgens op X, y, Z en start met het acquisitieren van Z-serie beelden voor het geselecteerde gebied binnen de ontstekingshaard; sla de Z-serie beelden op als VI-bestanden. Om de beeldbestanden op te slaan, selecteert u het beeld uit de Z-serie en slaat u dit op in TIFF-formaat.

Sla multi-TIFF-afbeeldingen altijd op. In eerste instantie om de gegevens te beschermen, is de volgende stap het onderzoeken van drie gepaarde coupes die met beide sets dex-trimmers zijn gekleurd. Maak vervolgens de Z-seriebeelden door de slides te scannen in een horizontale-verticale-omhoog-horizontale-verticale-omlaag beweging, zodat herhaling van Z-series binnen hetzelfde brandpunt wordt voorkomen.

Zodra de Z-seriebeelden zijn vastgelegd, benoemt u de bestanden door de glijnummers, de naam van de coupes en het aantal gemaakte Z-seriebeelden te vermelden. Gebruik ImageJ-software om de dextro-positieve CD4-positieve T-cellen te tellen in relatie tot het totale aantal CD4-positieve T-cellen. Selecteer het type teller in ImageJ, vink 'show all' aan en begin met tellen door op het centrum van elke cel te klikken; ga verder met tellen in verschillende Z-seriebeelden met behulp van de zijpijlen.

Nadat alle CD4 T-cellen zijn geteld, kiest u een ander type teller en telt u de dextro-positieve CD4-positieve T-cellen. Klik op het tabblad resultaten om het totaal aantal getelde cellen met de twee verschillende tellers te verkrijgen. De detectie van myeline proteïdelipide-proteïne of PLP-specifieke CD4 T-cellen werd uitgevoerd met behulp van vers gesneden cerebrale secties afkomstig van EAE-muizen, gekleurd met cocktails bestaande uit anti-CD4 en PLP 1 39 tot 1 51 dexters of controle TMEV 70 tot 86 dexters LSCM.

Analyse van co-gekleurde cerebrale coupes laat cellen zien die positief zijn voor PLP 1 39 tot 1 51 dex-trimeren in het rood en cellen die positief zijn voor het CD4-antilichaam in het groen, terwijl de dubbel-positieve cellen in geel verschenen. De co-gekleurde cellen vertoonden punctate stippen rond de periferie. Een dergelijk kenmerk ontbrak in de coupe die gekleurd was met de controle TMEV 70 tot 86.

Detectie van cardiale myosine-specifieke CD4 T-cellen met Dex-trimmers door in situ kleuring met cardiale myosine zware keten alpha 3 34 tot 3 52 Dexters werd eveneens uitgevoerd. Analyse van deze beelden via LSCM toonde de aanwezigheid van cellen die positief waren voor MYHC 3 34 tot 3 52 dexters in rood, cellen die positief waren voor CD4 in groen en cellen gebonden aan zowel Dexter als CD4 als gele punctaatcellen. De achtergrondkleuring voor controle-RNA's 43 tot 56 Dexters was verwaarloosbaar. Eenmaal beheerst kan deze techniek in ongeveer 8 tot 10 uur worden uitgevoerd, in tegenstelling tot drie dagen bij andere gepubliceerde protocollen, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de reagentia vooraf voor te bereiden en de stappen systematisch te volgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de weefsels gesneden en gekleurd moeten worden voor de enumeratie van C-reactieve CD4 T-cellen in de doelorganen.