Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Het algemene doel van deze procedure is om snel zuivere en respiratoir competente mitochondria uit rattenweefsel te isoleren. Dit wordt bereikt door eerst weefselmonsters te combineren en te homogeniseren. De volgende stappen zijn het mengen van subin A in het homogenaat en het incuberen hiervan op ijs.

Vervolgens wordt het homogenaat gemengd met BSA en gefilterd, waarna het opnieuw wordt gefilterd. De laatste stappen bestaan uit het centrifugeren van het filtraat en het resuspenderen van de mitochondriële pellets in respiratiebuffer. Uiteindelijk kan via respiratieanalyse en een ATP-luminescentie-assay worden aangetoond dat de geïsoleerde mitochondriën levensvatbaar en respiratoir competent zijn.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, waarbij de isolatietijden voor mitochondriën variëren van 60 tot honderd minuten, is dat levensvatbare en respiratoir competente mitochondriën in minder dan 30 minuten geïsoleerd kunnen worden. Allison mackay, een technicus van een samenwerkend laboratorium, zal voorafgaand aan de start de ATP-luminescentie-assay demonstreren. Los de subin A op in één milliliter homogenisatiebuffer en los de BSA eveneens op in één milliliter homogenisatiebuffer.

Begin nu met het verzamelen van twee verse weefselmonsters met behulp van een biopsietpons van zes millimeter en bewaar deze in één XPBS op ijs in een centrifugebuis van 50 liter. Verplaats het weefsel vervolgens naar een dissociatie-C-buis met vijf milliliter ijskoud homogenisatiebuffer. Homogeniseer daarna het weefsel door de buis in de weefseldissociator te plaatsen en de vooraf ingestelde cyclus voor mitochondriële isolatie te selecteren.

Zodra dit voltooid is, plaatst u de buis terug op ijs en voegt u 250 microliters van een sub to lyin-voorraadoplossing toe. Meng dit door te keren. Wanneer het mengsel er uniform verdeeld uitziet, laat u het homogenizaat 10 minuten op ijs incuberen.

Plaats vervolgens een filter met een maaswijdte van 40 micron in een conische centrifugebuis van 50 milliliter en zet deze in het ijs. Bevochtig het filter met homogenisatiebuffer en gooi de buffer in een afvalcontainer. Giet vervolgens, zodra alles gereed is, het homogenisaat door het filter in het filtraat.

Voeg 250 µL BSA-stamsoplossing toe en meng dit door te keren. Deze stap moet echter worden overgeslagen voor mitochondriële eiwitanalyse. Bereid nu nog twee exemplaren.

Plaats twee conische centrifugebuizen van 50 milliliter op ijs, waarbij één buis is voorzien van een filter van 40 micron en de andere van een filter van 10 micron. Bevochtig beide filters met een kleine hoeveelheid homogenisatiebuffer en gooi deze buffer weg. Giet vervolgens het homogenaat eerst door het filter van 40 micron en daarna door het filter van 10 micron.

Deze filtratiestappen verbeteren de zuiverheid van de mitochondriën aanzienlijk. Verdeel het filtraat nu over twee vooraf gekoelde microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter en centrifugeer deze 10 minuten lang bij 9.000 Gs bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer en combineer de twee gezuiverde mitochondriële pellets.

In één milliliter ijskoud respiratiebuffer; het is essentieel dat de gehele procedure bij vier graden Celsius wordt uitgevoerd. De gezuiverde mitochondriën kunnen nu worden getest om de metabole activiteit van de geïsoleerde mitochondriën te bepalen. Een ATP-luminescentie-assay kan worden uitgevoerd met behulp van een ATP-assaykit.

Breng eerst de reagentia uit de kit naar kamertemperatuur. Bereid vervolgens de HT P-stamsoplossing en plaats deze op ijs. De volgende stap is het toevoegen van vijf milliliter substraatbuffer aan de gelyofiliseerde substraatoplossing.

Meng dit voorzichtig en plaats het in het donker. Voeg vervolgens 100 µL respiratiebuffer toe aan elke put van een opake zwarte 96-wells plaat. Voeg 10 µL van de bereide mitochondriën toe aan de putten onder de ATP-standaarden.

Elk uniek mitochondriaal monster moet in triplikaat worden geplaatst; vul drie putjes met enkel respiratiebuffer als negatieve controle. Voeg vervolgens 50 µL zoogdiercel-lyseoplossing toe aan elk geladen putje. Incubeer de plaat vijf minuten bij 37 °C op een orbitale schudmachine bij 120 RPM.

Bereid tijdens de incubatie verdunningen van de A TP-standaard voor, variërend van één tiende millimolair tot één tiende micromolair. Voeg na de incubatie 10 µL van elke A TP-standaard toe aan de overeenkomstige putjes zoals aangegeven op de plaatkaart. Voeg vervolgens 50 µL van de gereconstitueerde substraatoplossing aan elk putje toe.

Incubeer de plaat vervolgens opnieuw, zoals voorheen, gedurende vijf minuten. Ga verder door de platen te analyseren met de platenlezer. Open de software onder.

Maak een nieuw item aan. Klik op experiment. Klik vervolgens op standaardprotocol en klik op oké.

Selecteer in de linkerkolom protocol. Kies vervolgens procedure. Selecteer daarna vertraging en stel deze in op 10 minuten. Bevestig vervolgens de invoer met ok.

Selecteer nu 'luminescence' uit het vervolgkeuzemenu, lees dit uit en kies dit. Pas de overige instellingen als volgt aan. Leestype: endpoint integratietijd.

Eén seconde. Filtersets stellen één emissiegate-optica positie in, maximale gevoeligheid 100, maximale probe verticale offset één millimeter. Klik na het doorvoeren van deze instellingen op ok.

Klik op plaatlay-out en stel deze dienovereenkomend in. Klik op OK. Nu alles is ingesteld, klikt u op het icoon voor het lezen van de plaat in de bovenste rij en klikt u op lezen.

Wanneer de spectrofotometer opent, plaatst u de plaat in de houder met put A1 in de linkerbovenhoek. Er verschijnt nu een venster met de temperatuur; klik op oké en ga vervolgens over tot de analyse van de gegevens. Skeletspierbiopten met een nat gewicht van ongeveer 0,18 gram leverden ongeveer 24 miljard mitochondriën op, gebaseerd op tellingen van de partikelgrootte.

Levermonsters van dezelfde grootte leverden enkele miljarden meer op. De aflezingen van de mitochondria met de hemocytometer waren onderschat in vergelijking met de partikelteller. Er werd een representatief trace verkregen, waaruit blijkt dat geïsoleerde mitochondria gelokaliseerd zijn onder één piek met een gemiddelde diameter van ongeveer vier tiende van een micron.

Dit is in overeenstemming met eerdere rapporten waarin de bi-zuurassay is gebruikt. Mitochondriaal eiwit werd gemeten op enkele milligram per gram weefsel uit skeletspier en lever. Het product was levensvatbaar en respiratoir competent.

Mitochondriën geïsoleerd binnen een tijdsbestek dat compatibel is met klinische en chirurgische therapeutische interventie. Transmissie-elektronenmicrografieën gaven aan dat de geïsoleerde mitochondriën allemaal elektronendicht waren, met schade bij minder dan één op de 10.000, en een contaminatie van minder dan één op de honderdduizend. Een ATP-assay toonde aan dat de mitochondriën levensvatbaar waren en dat het ATP-gehalte ongeveer 11 of 15 nanomoles per milligram mitochondriaal eiwit bedroeg.

Mitochondriële respiratieanalyse werd uitgevoerd met een Clark-elektrode en toonde aan dat het zuurstofverbruik ongeveer 180 nmol O₂ per minuut per milligram mitochondriaal eiwit bedroeg, terwijl de RCI-waarden elk rond de 2,5 lagen, met een iets hogere score voor de lever. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in minder dan 30 minuten worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.