In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow
4 september 2014
De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.
Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige 3D-stacks te verkrijgen die hematopoietische stamcellen en precursorcellen bevatten, en deze gedurende de tijd te volgen door middel van multi-point time lapse beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst de hematopoietische stam- en precursorcellen of HSC's te labelen met een lipofiele kleurstof. De HSC's worden vervolgens in een ontvangende muis geïnjecteerd.
De muis wordt voorbereid voor microscopie met behulp van een aangepaste kop en monsterhouder voor stabiele positionering van het dier. Vervolgens worden de hoogwaardige stacks van nichen van hematopoietische stam- en precursorcellen verkregen en wordt time-lapse beeldvorming van meerdere beenmerglocatie uitgevoerd die HS PC's bevatten. Uiteindelijk wordt intra vitaal confocale en twee-foton microscopie gebruikt om de lokalisatie en beweging van HSC's in de beenmergholte te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals immunofluorescentie op beenmergsecties is dat we in staat zijn om informatie vast te leggen op een vierdimensionale schaal, drie dimensies plus tijd.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van hematologische ziekten omdat het helpt bij het begrijpen waar we hematopoietische stamcellen in het beenmerg moeten richten om hun correct functioneren te garanderen. We hadden dit idee voor deze methode voor het eerst toen we ons realiseerden hoe cruciaal het was om eerst HS PC's gedurende de tijd te kunnen volgen. Deze methode helpt ons om alle vragen te beantwoorden die we hebben over het stamcelnich-veld waar we willen weten waar de stamcellen zich bevinden en hoe ze zich gedurende de tijd gedragen.
Om te beginnen, oogst de hematopoietische stam- en precursorcellen zoals gedemonstreerd door dit laboratorium in een eerder geo-video en verwezen in het tekstprotocol. Voeg vervolgens de lipofiele kleurstof DID toe aan de celsuspensie bij een eindconcentratie van vijf micromolair. Vortex de suspensie onmiddellijk om ervoor te zorgen dat de kleurstof niet uit de oplossing precipiteert en de cellen niet labelt.
Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te wassen. Draai eerst gedurende vijf minuten bij 500 keer G en decanteer het vocht. Resuspendeer vervolgens de cellen in 200 microliter PBS en verzamel in een insulinesyringe.
Een insulinesyringe wordt aanbevolen boven een conventionele spuit omdat deze geen dode ruimte heeft. Hierdoor kan de hele celsuspensie aan de muis worden toegediend om cellen in een levensgevaarlijk bestraalde muis via injectie in de staarvene te injecteren. Plaats de muis eerst in een warme kamer.
Zodra de staarvene verwijd is, verplaats de muis naar de begrenzer. Schuif voorzichtig de naald in de staarvene. Injecteer de cellen in de ader.
Er mag geen weerstand bij injectie worden ondervonden. Laat de muis een nacht staan. Om de cellen toe te laten trekken naar de beenmergholte, verdoof de muis en controleer het begin van diepe anesthesie via de petalreflex.
Dop de bovenkant van de hoofdhuid af met 70% ethanol op een doekje. Wees voorzichtig om geen ethanol in de ogen van de muis te krijgen. Om het calvariumgebied dat moet worden afgebeeld bloot te leggen, maak een kleine incisie aan de achterkant van het hoofd tussen de oren door de huid omhoog te tillen met de pincet terwijl de huid omhoog wordt gehouden.
Schuif de schaar onder de huid en snijd voorzichtig langs de buitenkant van het gewenste beeldvormingsgebied. Veeg het blootgestelde bot af met een steriele wattenstaafje dat is bevochtigd met steriele PBS om het bot vochtig te houden. Dit voorkomt overmatig uitdrogen en littekenvorming, wat de beeldkwaliteit kan beïnvloeden.
Vervolgens meng een voldoende hoeveelheid tandcement in een weiblik tot het een pasta wordt. Breng het snel aan op het onderste oppervlak van de autoclaafkop die aan de schedel zal worden bevestigd. Plaats de kop voordat het cement hard wordt op de schedel van de muis, zorg ervoor dat er geen tandcement op het beeldvormingsgebied komt en wacht tot het hard wordt.
Breng een kleine hoeveelheid intra-hydrogel aan, die de schedel vochtig houdt, en wees voorzichtig om het cement niet te verstoren terwijl het droogt. Bevestig vervolgens de kop aan de houder en zet deze vast. Gebruik de schroef en zorg ervoor dat de groeven in de houder passen.
Verwijder het hydrogel met steriele wattenstaafjes voordat u overbrengt naar de microscoop. Plaats vervolgens de houder in de microscoopstandaard en plaats de verwarmingsmat onder de muis. Plaats de rectale thermometersonde en bevestig alles op de standaard met plakband.
Plaats een kleine druppel oogzalf op de ogen van de muis om ervoor te zorgen dat ze niet uitdrogen tijdens het anesthesieproces. De muis mag op geen enkel moment onbeheerd worden achtergelaten tijdens het beeldvormingsproces terwijl deze onder anesthesie is. Om via de oogstukken op de schedel te richten.
Vul eerst het calvariumbeeldvormingsvenster met gezuiverd steriel water met behulp van een waterduiklens. Laat het zakken zodat het de waterdruppel raakt. Richt u op de bovenkant van de schedel met behulp van de microscoopoogstukken.
Positioneer het beeldvormingsgebied op de centrale naad en beweeg naar de achterkant van het hoofd om de coronale naad te vinden. Plaats de software als startpositie in een modus voor het vastleggen van XY-beelden evenals een drie DZ-stack. Stel de beeldsnelheid in op 400 hertz en de resolutie op 512 bij 512 pixels.
Stel de software zo in dat meerdere kanalen worden vastgelegd en stel de verzamelmethodev in om de instellingen tussen de stacks of tussen de frames te wijzigen. Stel drie onafhankelijke opname-instellingen in. Schakel de laserverlichting uit aan het einde van de verwerving van elke stack.
Stel vervolgens de eerste sequentiële scan in voor de tweede harmonische generatie bot-signaal. Open de sluiter voor de multifoton
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor beeldvorming met hoge resolutie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) binnen beenmergnisjen met behulp van twee-foton- en confocale microscopie. De techniek maakt het mogelijk om interacties en bewegingen van HSPC's in de loop van de tijd te volgen, wat inzicht biedt in hun gedrag en lokalisatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van HSPC-interacties met beenmergnisjen is cruciaal voor hematologische therapieën.
- Bestaande methoden zoals immunofluorescentie hebben niet de mogelijkheid om dynamische processen vast te leggen.
- Deze studie beoogt de begrip van stamcelgedrag in hun natuurlijke omgeving te verbeteren.
- Beeldvorming met hoge resolutie maakt 4D-analyse mogelijk (3D plus tijd).
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor real-time beeldvorming van HSPC's in beenmerg.
- Om de lokalisatie en beweging van HSPC's in de loop van de tijd te volgen.
- Om het begrip van stamcelnisjen en hun therapeutische implicaties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Labelen van HSPC's met een lipofiele kleurstof voor visualisatie.
- Injecteren van gelabelde cellen in ontvangermuizen voor tracking.
- Gebruik van aangepaste hardware voor stabiele beeldvorming van de muizenschedel.
- Gebruik van twee-foton- en confocale microscopie voor beeldvorming met hoge resolutie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van HSPC's in beenmerg over tijd.
- Aangetoond de mogelijkheid om dynamische interacties in 4D vast te leggen.
- Biedt inzicht in de lokalisatie en het gedrag van HSPC's.
- Benadrukt de voordelen van deze methode ten opzichte van traditionele technieken.
Conclusies
- Deze beeldvormingstechniek is een belangrijke vooruitgang voor het bestuderen van HSPC's.
- Het biedt nieuwe inzichten in de dynamica van stamcelnisjen.
- De methode heeft mogelijke implicaties voor therapieën gericht op hematologische ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution 4D imaging of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in live mouse bone marrow enables direct observation of cell localization, migration, and niche interactions. This capability addresses a critical gap in understanding stem cell dynamics, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for hematological disease research. The method enhances translational continuity by linking in vivo cellular behavior to therapeutic hypothesis testing and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of HSPC-niche interactions to clarify biological mechanisms.
- Supports functional target validation by tracking cell fate and movement in real time.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing spatial and temporal cell behaviors.
- Improves predictive confidence for prioritizing targets in hematopoietic research portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated in vivo imaging systems for downstream compound evaluation.
- Delivers reproducible, quantitative 3D and time-lapse data for assay standardization.
- Enables screening of cell behaviors in response to candidate interventions within native microenvironments.
- Supports platform reuse for tracking various labeled cell populations in bone marrow.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant stem cell dynamics and niche biology.
- Enables longitudinal tracking of therapeutic cell engraftment and migration in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into cell therapy strategies.
- Facilitates biomarker discovery by correlating cell localization with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging hypothesis-driven research and translational studies in hematopoietic biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stem cell localization, migration, and niche engagement in vivo.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs for evaluating intervention effects on HSPC behavior.
- Analytics: Enables multi-channel, time-lapse data acquisition for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vivo cell tracking to preclinical model validation and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible imaging platform adaptable to diverse cell types and experimental questions in bone marrow research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in stem cell research.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapies and discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and animal handling for in vivo imaging.
- Demands specialized instrumentation, including two-photon/confocal microscopes and custom specimen holders.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various labeled cell types but dependent on robust labeling and detection strategies.
- Imaging duration and animal preparation may limit throughput for large-scale studies.
