Name: A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen Mycobacterium tuberculosis Specifieke Afschriften van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde Lung Granulomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Ontdek een nieuwe microdissectiemethode voor RNA-extractie uit formaline-gefixeerde in paraffine ingebedde longgranulomen van Mycobacterium tuberculosis. Deze techniek ondersteunt genexpressieanalyse en tuberculoseonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de volgende NIH awards / subawards voor de ondersteuning van dit onderzoek luidt: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, en P51OD011104.

1. Kalibreren Mesodissection Instrument met 2id Imaging Software De 2id imaging software zal worden aangeduid als de software of het programma voor de rest van dit artikel. Deze stap is nodig te kunnen volgen het beeld en sluiten meerdere diaraampjes. <ol><li> Schakel instrument en de computer. </li><li> Open software en selecteer &quot;kalibreren instrument&quot;. </li><li> Kalibreren reizen stadium met behulp van de joystick. Verplaats etappe naar linksboven positie. Druk op &quot;set&quot; in stap 1 in het programma. </li><li> Verplaats podium om juiste positie te verlagen. Druk op &quot;set&quot; bij stap 2 in het programma. </li><li> Kalibreren aspiratie door &quot;Z-knop&quot; eerst op het hoofd assemblage verhogen. Druk op &quot;aspireren pulse&quot; knop en &quot;dissectie&quot; knop op de joystick totdat plunjer stuurstang toppositie bereikt. Druk op &quot;set&quot; in stap 3 van het programma. </li><li> Druk op &quot;aspireren reset &amp;# 8221; knop. Zodra de zuiger stopt aan de onderzijde de druk op &quot;set&quot; in stap 4. </li><li> Klik op het tabblad &quot;schaal&quot;. </li><li> Plaats kalibratie liniaal op blanco zijde. </li><li> Focus microscoop indien nodig. </li><li> Teken lijn tussen de twee schaalbalken behulp van de muis. </li><li> Voer afstand in vakje met stap 2 Druk op &quot;compute&quot; knop.. </li><li> Klik op het tabblad &quot;crosshair&quot;. Draai motorsnelheid tot 1. </li><li> Steek xScisor in het hoofd assemblage. Lagere hoofd assemblage in z-as gereed positie door te drukken &quot;z-as&quot; knop. OPMERKING: Het hoofd assemblage is de grote structuur aan de top van de dissectie instrument. De xScisor zal worden aangeduid als een verbruiksartikel molen beetje voor de rest van dit artikel. </li><li> Klik op &quot;dissectie gaan&quot; knop op de joystick. OPMERKING: Deze knop bevindt zich aan de bovenzijde van de joystick. </li><li> Definieer draaipunt visueel. Om dit te doen, bewegen centrum van crosshair dan draaipunt gebruik definiërend parameter in stap 1 van het programma. Gebruik de pijlen omhoog en omlaag in de &quot;x&quot; en &quot;y-as&quot; bars om de pixels aan te passen aan crosshair te lijnen. Klik op de &quot;done&quot; tabblad. </li><li> Klik op het pictogram &quot;thuis&quot;. OPMERKING: Dit wordt weergegeven beeld Het huis ligt in de rechterbovenhoek een door. </li></ol> 2. Maak Referentiebeeld <ol><li> Plaats H &amp; E dia op het podium. Plaats ondoorzichtig deksel op de top van dia. Rijd het instrument door de joystick naar het gewenste gebied van de H &amp; E slide. Sla de afbeelding gegenereerd. OPMERKING: Ofwel de tab &quot;capture reference&quot; of tabblad &quot;ontleden&quot; kan worden gebruikt om deze stap te voltooien. </li></ol> 3. Lijn Tissue voor Dissection <ol><li> Klik op de &quot;ontleden weefsel&quot; optie op het beginscherm. </li><li> Vul de &quot;exploitant&quot;, &quot;dissectie toetreding nummer,&quot; &quot;referentie toetreding nummer,&quot; &quot;xScisor barcodenummer,&quot; &amp; #8220; dissectie vloeistof lotnummer, &quot;&quot; xScisor size &quot;en&quot; description &quot;in het tabblad&quot; setup &quot;. </li><li> Klik op de &quot;vind weefsel&quot; tabblad. </li><li> Import referentiebeeld eerder opgeslagen. </li><li> Plaats een ongekleurde FFPE dia van 5 micron dikte op het podium. Verplaats etappe naar hetzelfde gebied als waar afgeschilderd in het referentiebeeld. Klik op het tabblad &quot;Afbeelding invoegen&quot;. </li><li> Klik op het tabblad &quot;align&quot;. Gebruik de muis en de bijbehorende pijlen op de foto om de verwijzing aan te passen aan de ongekleurde afbeelding. </li></ol> 4. Commenteren Slide <ol><li> Klik op het tabblad &quot;annoteren&quot;. </li><li> Gebruik de muis om een ​​cirkel rond het gewenste gebied van de dia die wordt gemicrodissecteerde trekken. </li></ol> 5. Laad verbruiksartikelen Mill Bit <ol><li> Vul verbruiksartikelen molen beetje met de gewenste buffer, hier PKD buffer, door op en neer trekken van de zuiger in een vloeiende beweging meerdere malen. Zorg ervoor dat de lucht uit te sluitenbubbels. </li><li> Raise Z-as door te drukken &quot;Z-as button&quot;. </li><li> Laad verbruiksartikelen molen beetje in de machine. Doe dit door in de bovenkant van de machine schuiven van de verbruiksgoederen molen beetje zodat de witte lijn op het instrument lijn staat met de zwarte lijn op de verbruiksartikelen molen bit. Druk op &quot;aspiratie reset&quot; knop om de plunjer te worden neergelaten in de juiste positie. OPMERKING: Het moet gemakkelijk zijn om de verbruiksartikelen molen beetje schuiven. Als het niet, zorg ervoor dat de inkepingen correct zijn uitgelijnd. </li><li> Lagere Z-as door opnieuw op &quot;Z-as&quot; knop. </li></ol> 6. Ontleden weefsel (figuur 4) <ol><li> Open het tabblad &quot;ontleden&quot;. </li><li> Draai de motor en aspiratie snelheden tot 1. </li><li> Selectievakje &quot;toon volgen&quot;. Opmerking: Hierdoor kan de gebruiker de ontleed gebied visualiseren tijdens de dissectie proces. </li><li> Eenmaal klaar om te ontleden, blijven vasthouden &quot;nemen&quot; knop evenals &quot;aspireren &amp; #8221; ingedrukt terwijl u de joystick tegen de klok in om weefsel te ontleden. </li><li> Blijven ontleden tegen de klok in totdat de verzamelbak is &quot;vol&quot; tab rood. </li></ol> 7. Leeg en verwijder verbruiksartikelen Mill Bit <ol><li> Plaats een 0,5 pi microfugebuis onder de punt van de verbruiksgoederen molen bit. </li><li> Druk op &quot;aspiratie&quot; stuurstang snel monster uit te werpen in microfugebuis. </li><li> Druk met een verhoogde kracht te werpen gebruikte verbruiksgoederen molen bit. </li><li> Spoel weefsel fragment door te trekken zuiger terug. Druk de zuiger uit naar resterende monster uiten in consumeerbare molen bit. Het weefsel fragment wordt nu opgenomen in de microcentrifugebuis. </li></ol> 8. Lyse Sample met Proteinase K Digestion gevolgd door een warmtebehandeling <ol><li> Voeg 70 ul TE pH 8,5 met 5 ug proteinase K te weefselmonster hersteld. </li><li> Plaats monster in programmeerbare verwarming-shaker. </li><li> Volledige ontsluiting met behulp van programmeerbare verwarming-schudder bij de volgende instelling: 60 ˚ C gedurende 30 minuten bij 1500 rpm; 82 ˚ C gedurende 15 minuten bij 1500 rpm; en 25 ˚ C gedurende 1 min bij 450 rpm. Het monster is nu klaar voor verdere toepassingen. </li></ol>

<ol><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li>
<li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques%3A+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li>
<li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li>
<li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li>
<li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%3A+what+we+don%27t+know+can%2C+and+does%2C+hurt+us%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+fibrous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22AvanSciBio%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li>
<li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penitentiary+or+penthouse+condo%3A+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li>
<li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li>
<li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor%2C+SigH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li>
<li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li>
<li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li>
<li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro%2C+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li>
<li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li>
</ol>

De auteurs beschrijven dat er geen concurrerende financiële belangen.

Mesodissection is een techniek die kan worden toegepast op RNA-extractie uit pathologische laesie dia veroorzaakt door een breed scala van pathogenen. Het is een noodzaak dat de gebruiker het beeld volgt en lijnt de afbeelding correct. Om dit te bereiken, moet het instrument worden gekalibreerd volgens de aanwijzingen op de imaging software. Bij het ontleden, als de glijbaan en interessegebied wordt ontleed niet op een lijn, de gebruiker moet het kalibreren. Een andere belangrijke stap in de dissectie proces is het verb...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Monsters zijn traditioneel handmatig gemicrodissecteerde van zowel hele weefsel of dia&#39;s met behulp van een naald en scalpel. Daartoe is een duidelijke scheiding tussen het gedeelte weefsel van belang en de omliggende weefsels in paragraaf 2. Met de huidige vooruitgang in de moleculaire profilering technologie, is er een toenemende behoefte om weefsel te beoordelen op cellulair niveau. Door de beperkingen van de handleiding microdissectie werden technieken, waaronder LCM vastgesteld grotere isolatie precisie mogelijk. Deze techniek kan de onderzoeker bepaalde celpopulaties uit verschillende cellen en schuif soorten, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse testen zoals genexpressie profilering isoleren. Hoewel zeer effectief voor stroomafwaartse testen, LCM is niet zonder beperkingen. Eerst LCM is een duur en tijdrovend proces. Bovendien, vanwege de instabiele aard van RNA, is het vaak uitdagend om hoge kwaliteit te verkrijgen van RNA LCM monsters 2. Door het disadvantages van LCM, zijn nieuwe ontwikkelingen in microdissection technologie nog steeds nodig om het meer toegankelijk voor een groter aantal onderzoekers in een betaalbare en tijd gevoelige manier te maken. Een van deze vooruitgang in microdissection technologie nu beschikbaar is een techniek die bekend staat als mesodissection. Bij deze techniek wordt een machine wordt gebruikt om de molen van de geannoteerde weefsel sectie van belang en zuigt het in een voor consumptie molen bit 3. Vervolgens kan dit monster worden opgezogen in een verzameling buis en gebruikt voor verdere toepassingen. De voordelen van dit systeem is dat het aanzienlijk goedkoper en tijdgevoelig. In onze ervaring, het systeem maakt het mogelijk de dissectie van een long granuloom weefsel sectie in tien minuten. Aan de andere kant, zou de traditionele LCM waarschijnlijk uren nodig om het proces te voltooien. Het systeem kan de bestuurder een verwijzing dia laden om te gebruiken als een vergelijking als hulpmiddel voor annotatie. Bovendien is een rapport gegenereerd waarin the gebied van de dia die werd ontleed. Er zijn twee belangrijke nadelen aan mesodissection. Hoewel effectief bij het extraheren meerdere cellen, is het moeilijk om een ​​cel te isoleren. Bovendien is de nauwkeurigheid van het beeld dat is gegenereerd is minder duidelijk bij gebruik van andere imaging microscopen. Tuberculose (TB) is een belangrijke besmettelijke ziekte moordenaar van de mensheid over de hele wereld en de resultaten van infectie met Mtb. In een meerderheid van de mensen blootgesteld aan aërosolen van Mtb, wordt de infectie latent beperkt. In ten minste 10 miljoen mensen per jaar, het resulteert in actieve tuberculose ziekte 4. Tijdens de latente infectie, wordt Mtb vervat in pathologische longlaesies bekend als granulomen. Daarom is betoogd dat de uitkomst van Mtb infectie wordt besloten op het niveau van het granuloom 5. Hier laten we zien hoe mesodissection kan worden om granulomen veroorzaakt door Mtb microdissect. De slides gebruiktzijn van FFPE longweefsel van geïnfecteerde rhesus makaken. Ten behoeve van deze demonstratie, zullen we granulomen ontleden in hun geheel. We tonen ook dat RNA van het teruggewonnen weefsel kan worden geëxtraheerd. Deze techniek kan worden toegepast op weefselmonsters van diverse andere monsters en vervolgens gebruikt voor verschillende stroomafwaartse testen.

<table><tbody><tr><td>MeSectr</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Mesodissector</td></tr><tr><td>400 nm xScisors</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Andere maten beschikbaar</td></tr><tr><td>THOR</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Programmeerbare Heater-Shaker</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE extractiekit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq FFPE System&nbsp;</td><td>Nugen</td><td>7150</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zuiveringskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel microdissection aanpak voor het herstellen<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; specifieke afschriften van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde lung granulomen

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissectie is gebruikt voor de behandeling van weefsels aan DNA, RNA en eiwit meer dan tien jaar. Laser capture microscopie (LCM) is de meest voorkomende microdissection techniek die tegenwoordig worden gebruikt. In deze techniek wordt een laser gebruikt om een thermoplastisch membraan dat een gedehydrateerde weefselsectie 1 ligt over focaal smelten. De weefselsectie composiet wordt vervolgens opgetild en gescheiden van het membraan. Hoewel deze techniek met succes kan worden gebruikt voor weefselonderzoek, is tijdrovend en duur. Bovendien is de succesvolle voltooiing van de procedures die deze techniek vereist het gebruik van een laser, waardoor het gebruik ervan beperkt. Een nieuwe, meer betaalbare en praktische microdissection aanpak genoemd mesodissection is een mogelijke oplossing voor de valkuilen van LCM. Deze techniek maakt gebruik van de MESO-1/MeSectr systeem om de molen van de gewenste weefsel van een dia gemonteerd weefselmonster terwijl tegelijkertijd de verstrekking en het opzuigen van vloeistof naar de gewenste weefsel monster in herstelleneen verbruiksartikel molen beetje. Voordat de dissectie proces begint, de gebruiker lijnt de formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) schuiven met een hematoxyline en eosine gekleurde (H &amp; E) verwijzing glijbaan. Daarna, de exploitant annoteert de gewenste dissectie gebied en overgaat tot het passende segment ontleden. Het programma genereert een gearchiveerd beeld van de dissectie. Het belangrijkste voordeel van mesodissection is de korte duur die nodig is om een ​​dia te ontleden, met een gemiddelde van tien minuten van het opzetten op generatie proeven in dit experiment. Bovendien is het systeem significant meer kosteneffectief en gebruiksvriendelijk. Een klein nadeel is dat het niet zo precies laser capture microscopie. In dit artikel laten we zien hoe mesodissection kunnen worden gebruikt om RNA te extraheren uit dia uit FFPE granulomen veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

De hiervoor genoemde protocol laat zien hoe een nieuwe mesodissection techniek gebruiken om RNA te extraheren uit FFPE weefsel dia&#39;s. Doeltreffendheid Dit protocol is opgenomen door FFPE dia long granulomen van NHP geïnfecteerd met MTB in verschillende infectieuze stadia. Figuren 1-3 zijn beelden van het instrument. 4 toont hoe de dissectie proces plaatsvindt en het resulterende beeld dat is gegenereerd door de software. Tabel 1 toont de resultaten van RNA-...

Microdissectie is uitgebreid toegepast voor de behandeling van DNA, RNA en eiwitten in weefsel. Laser capture microscopie (LCM) is de meest gebruikte methode, maar een nieuwe frees-techniek, mesodissection, is sinds kort beschikbaar. We tonen RNA extractie uit mesodissected formaline gefixeerd paraffine-ingebed weefsel slides van Mycobacterium tuberculosis granulomen.

A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Specifieke Afschriften van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde Lung Granulomen

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Het algemene doel van deze procedure is het microdissecteren van weefsel van formaldehyde-gefixeerde en in paraffine ingebedde coupes. Dit wordt bereikt door eerst een referentiebeeld te maken van een representatieve coupe met een hematoxine- en eosinekleuring. De tweede stap is om een overeenkomstige, ongekleurde formaldehyde-gefixeerde en in paraffine ingebedde coupe op de objecttafel van het instrument te plaatsen en het gewenste dissectiegebied uit te lijnen met het referentiebeeld.Vervolgens wordt het dissectiegebied geannoteerd en wordt een verbruiksartikel voor de mannelijke bit gevuld met buffer en in het instrument geplaatst. De laatste stap is het dissecteren van het geannoteerde weefsel. Uiteindelijk wordt een combinatie van RNA-extractie, amplificatie en R-T-P-C-R gebruikt om aan te tonen hoe het gedissecteerde weefsel kan worden gebruikt voor globale genexpressieanalyse van mycobacterium tuberculosis binnen longgranulomen van geïnfecteerde Reeses Maca.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar tuberculose, zoals de identiteit van genen die mycobacterium tuberculosis tot expressie brengt binnen mensachtige in vivo niches tijdens verschillende geïnfecteerde stadia van tuberculose. Bovendien zullen deze gegevens helpen bij het verklaren van de regulatie van de pathogenen, alsook de metabole en fysiologische verschillen binnen deze verschillende ziektestadia. Hierdoor kunnen specifieke drug targets worden gegenereerd.Het meso-dissectie-instrument is uitgerust met een digitale microscoop die is geïntegreerd met de twee ID imaging software en een joystick voor het besturen van de XY-plaatposities. Kalibreer het instrument vóór het starten van deze procedure met de imaging software zoals beschreven in het bijbehorende manuscript om een referentiebeeld te maken. Plaats eerst een met hematoxine en eosine gekleurde of H&E-preparaat op de plaat en plaats een ondoorzichtige afdekking bovenop het preparaat.Stuur vervolgens het instrument door de joystick naar het gewenste gebied van de h- en d-dia slide te bewegen. Sla het gegenereerde beeld op via het tabblad 'capture reference' om het te dissecteren weefsel uit te lijnen. Klik op de optie 'dissect tissue' op het startscherm.Vul in het tabblad 'setup' het dissectie-accessienummer van de operator, het referentie-accessienummer exci of barcode-nummer van de dissectievloeistof, het lotnummer, de exci-maat en de beschrijving in. Klik op het tabblad 'find tissue'. Importeer de eerder opgeslagen referentieafbeelding.Plaats een niet-gekleurd, in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed (FFPE) objectglas met een dikte van 5 micron op de tafel. Verplaats de tafel naar hetzelfde gebied als datgene dat in de referentieafbeelding wordt weergegeven.Klik op het tabblad align. Gebruik de muis en de bijbehorende pijlen om het referentiebeeld uit te lijnen met het ongekleurde beeld. Noteer tot slot de slide door op het tabblad annotate te klikken.Gebruik de muis om een cirkel te trekken rond het gewenste gebied van het preparaat dat gemicrodissecteerd zal worden. Begin deze procedure door het verbruiksartikel-pipetteertip te vullen met de gewenste buffer, in dit voorbeeld PKD-buffer, door de zuiger meerdere keren in een vloeiende beweging op en neer te trekken. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Verhoog de Z-as door op de Z-as knop te drukken. Plaats de verbruiksartikel male bit in het instrument. Schuif de verbruiksartikel male bit in de bovenkant van de machine, zodat de witte lijn op het instrument uitlijnt met de zwarte lijn op de verbruiksartikel male bit.Druk op de knop voor het resetten van de aspiratie om de zuiger in de juiste positie te laten zakken. Verlaag de Z-as door opnieuw op de Z-as knop te drukken om eerst te beginnen met de weefseldissectie; open hiervoor het tabblad dissectie. Stel vervolgens de motor- en aspiratiesnelheden in op één.Vink het vakje 'show tracking' aan. Hiermee kan de gebruiker het te dissecteren gebied tijdens het dissectieproces visualiseren. Houd de engage-knop en de aspiratieknop ingedrukt terwijl u de joystick in tegenwijzerzin beweegt.Ga verder met dissekeren in tegenwijzerzin totdat het aspiraat vol is en het tabblad rood wordt. Om het gedisseceerde monster eerst op te vangen, drukt u op de Z-as knop om de as te verhogen, plaatst u vervolgens een 0,5 µL microcentrifugebuisje onder de punt van het verbruiksartikel (male bit) en drukt u snel op de aspiratiesturingsstang om het monster in het microcentrifugebuisje uit te stoten. Het weefselfragment bevindt zich nu in het microcentrifugebuisje.Druk met verhoogde kracht op de aspiratiestuurstang om de gebruikte verbruiksbit uit te werpen. Het in deze video gedemonstreerde protocol werd gebruikt om longgranulomen te microdissecteren uit Resus Maca geïnfecteerd met mycobacterium tuberculosis of MTB in verschillende infectiestadia. De referentieafbeelding toont een H&amp;E-gekleurd granuloom van een actief geïnfecteerde Resus Maca, waarbij het te dissecteren interessegebied in het groen is omlijnd.De middelste afbeelding toont het bijbehorende ongekleurde FFPE-preparaat met een dikte van vijf micron vóór dissectie. De gebieden zijn met behulp van de software uitgelijnd, en het correlerende interessegebied is groen omlijnd. De afbeelding rechts toont hetzelfde ongekleurde FFPE-preparaat na dissectie, waarbij het gedissecteerde gebied in het blauw is weergegeven.Vervolgens werd RNA geëxtraheerd uit de mesodissectie-granulomen bij elke infectiestatus, en deze tabel toont de resultaten. De RNA-concentratie werd bepaald met een NanoDrop. Het RNA werd daarna geamplificeerd, gezuiverd en reverse getranscribeerd naar cDNA; RT-PCR-resultaten met betrekking tot de 16 s ribosomale subunit bevestigen de aanwezigheid van de MTB ribosomale subunit 16 s en daarmee de aanwezigheid van MTB.In de microdissectie-monsters werd genomisch DNA van de CDC 1551-stam van MTB als standaard gebruikt volgens deze procedure. Andere methoden, zoals DNA-, RNA- en eiwitextractie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen over genomica, transcriptomica en proteomics te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u FFPE-monsters van longgranulomen moet microdissecteren.Deze procedure is niet uitsluitend beperkt tot met MTB geïnfecteerde longgranulomen, maar kan ook worden toegepast op laesies van andere pathogenen.

a-novel-microdissection-approach-to-recovering-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol beschrijft qPCR-detectie van cytomegalovirus in formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed biopsieweefsel, wat snel, gevoelig, specifiek is en nuttig voor het interpreteren van twijfelachtige hematoxyline en eosine of immunohistochemische kleuringspatronen.

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

Tuberculose-infectie bij de mens is een complex proces, dat moeilijk te modelleren is in vitro. Hier beschrijven we een nieuw 3D-model van menselijk longweefsel dat de dynamische processen nabootst die tijdens infectie optreden, inclusief de migratie van immuuncellen en vroege granuloomvorming in een fysiologische omgeving.

Een 3D Human longweefsel Model voor functionele studies op<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infectie

Deze gewijzigde extractie protocol verbetert RNA en DNA opbrengst van meer doelgerichte regio's van belang in histopathologische weefsel blokken.

Bereiding van formaline gefixeerde paraffine-ingebed weefsel Cores voor zowel RNA en DNA-extractie

Hier beschrijven we een protocol met behulp van laser vangt microdissection LC/MS-analyse wordt gekoppeld aan het ruimtelijk-kwantificeren drug distributies binnen longtuberculose granulomas. De aanpak heeft brede toepasbaarheid te kwantificeren van de drug concentraties in weefsels bij hoge ruimtelijke detail.

Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS)

We beschrijven een tuberculose moleculaire bacteriële load test uitgevoerd na warmte-inactivatie van sputum. Warmteinactivatie maakt sputummonsters niet-besmettelijk en voorkomt de noodzaak van containmentniveau 3-laboratoria voor moleculaire tests op tuberculose.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

We hebben een weefselverwerkingstechniek ontwikkeld die gebruik maakt van een vibratoom en in agarose ingebed longweefsel om longsecties te genereren, waardoor het mogelijk wordt om beelden met een hoge resolutie van de longarchitectuur te verkrijgen. We gebruikten immunofluorescentiekleuring om ruimtelijke eiwitexpressie te observeren met behulp van specifieke structurele markers in de longen.

Geautomatiseerde vibratoomdoorsnede van in agarose ingebed longweefsel voor multiplex fluorescentiebeeldvorming

We presenteren een methode voor een schimmelpathogenesemodel dat de natuurlijke positionering van schimmelsporen in de longluchtwegen behoudt voor analyse via fluorescentiemicroscopie.

Efficiënte methode voor het in beeld brengen van muizenlongen die de ruimtelijke dynamiek van schimmelsporen in de luchtwegen behoudt

De implementatie van een goedkope, veelzijdige fotobestralingstechniek met de handmatige IBEX-methode zorgt voor een optimale beeldvorming van menselijk weefsel met aanzienlijke natuurlijke autofluorescentie. Dit protocol beschrijft hoe gemultiplexte beelden van hele dia's kunnen worden verkregen uit gearchiveerde klinische monsters met behulp van een omgekeerde microscoop, algemeen verkrijgbare reagentia en open-source software voor beelduitlijning en -verwerking.

Geoptimaliseerde workflow voor iteratief bleken breidt multiplexiteitsbeeldvorming van sterk autofluorescerende klinische monsters uit

Dit protocol schetst methoden voor het kweken, manipuleren en analyseren van muizen CAF's, inclusief in vitro/in vivo functionele assays, transcriptomics en computationele analyse. Bovendien beschrijft het een webgebaseerd platform dat is ontwikkeld om de openbaar beschikbare transcriptomen van laseropname van micro-ontlede stromale en epitheliale componenten uit een verzameling menselijke borstkankertumoren te analyseren.

Kanker-geassocieerde fibroblasten van borsttumoren bij muizen als hulpmiddelen voor moleculaire en computationele studies

Dit protocol beschrijft een methode om RNA te isoleren uit gedefinieerde histologische gebieden van paraformaldehydegebonden, Optimal Cutting Temperature-verbinding-ingebedde muizenleverweefsel met behulp van lasercapture-microdissectie, waardoor gerichte downstream genexpressie-analyse mogelijk is.

Laservangstmicrodissectie van paraformaldehyde-gefixeerd muizenleverweefsel voor RNA-analyse

Hier presenteren we een protocol voor intravitale beeldvorming van een verzwakte, door BSL-2 goedgekeurde Mycobacterium tuberculosis. Spanning in de muislong met behulp van een permanent longvenster. Deze benadering maakt longitudinale, enkelcelresolutie-analyse mogelijk van vroege interacties tussen gastheer en pathogeen, waaronder bacillaire lokalisatie, vasculaire dynamiek en opname van macrofagen binnen dezelfde longmicroomgeving.

Intravitale beeldvorming van verzwakte auxotrofe mycobacterium tuberculosis in muislong tijdens vroege intravasculaire infectie

Ontdek een nieuwe microdissectiemethode voor RNA-extractie uit formaline-gefixeerde in paraffine ingebedde longgranulomen van Mycobacterium tuberculosis. Deze techniek ondersteunt genexpressieanalyse en tuberculoseonderzoek.

A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen Mycobacterium tuberculosis Specifieke Afschriften van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde Lung Granulomen (Video) | JoVE Journal

A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen

Meer video's verkennen