Name: Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Leer freeze-fracture en freeze-etch technieken voor biologische elektronenmicroscopie. Deze methode onthult ultrastructuren van membranen door snelvriezen en replica-vorming met koolstof en platina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze presentatie werd ondersteund door een Clinical Innovator Award aan JLC van het Flight Attendant Medical Research Institute en door de United States Environmental Protection Agency. Hoewel het onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven geheel of gedeeltelijk is gefinancierd door de United States Environmental Protection Agency via een samenwerkingsovereenkomst CR83346301 met het Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill, is het niet onderworpen aan de vereiste collegiale en beleidsbeoordeling van de Agency en weerspiegelt daarom niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de Agency en er mag geen officieel goedkeuringsverklaring worden afgeleid. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik.

1 Voorbereiding van biologische monsters voor Freeze-fractuur / Freeze-etch <ol><li> Gebruik een conventionele EM fixeermiddel formulering zoals 2% glutaaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer gedurende 1 uur. primaire fixatie van biologisch weefsel uitvoeren. OPMERKING: Hoewel het wenselijk om een ​​aantal soorten van specimens bevriezen zonder voorafgaande fixatie kunnen zijn, universele bloed overgebrachte ziekteverwekkers voorzorgsmaatregelen mandateren geschikte fixatie waar het specimen bestaat uit menselijk weefsel. </li><li> Volgende primaire fixatie, spoel het model in dezelfde buffer aangevuld met 0,2 M sucrose voor niet meer dan 1 uur. </li><li> Het analysemonster in een cryobeschermingsoplossing bestaande uit 25% glycerol in 0,1 M fosfaatbuffer voor niet meer dan 1 uur. </li></ol> 2 Invriezen en opslag van monsters in Advance van Freeze-fractuur <ol><li> Kies goud of koper specimen stompjes van de juiste grootte en vorm van het monster wordt verwerkt (Figuur 4 </strong&gt;). </li><li> Met een fijn pincet en / of kleine gauge naalden positie kleine fragmenten van het monster op de top van een metalen monster stub. <ol><li> Verminder de vloeistofinhoud van het monster tot een kleverige, licht lijm consistentie door afzuigen vloeistof van de rand van de stomp met filtreerpapier. </li><li> Voor enkele replica&#39;s, gebruik maken van kleine gauge injectienaalden tot een heuvel van het weefsel te maken op de stomp. Voor dubbele replica, omkeren ander stomp en plaats het precies over de stomp en plaats licht op het monster oppervlak creëren van een broodje (figuur 5A). Druk niet op het model uit van tussen de twee stompen. </li></ol></li><li> Vul twee geïsoleerde Dewar vaten met vloeibare stikstof. OPMERKING: De eerste vat bevindt zich een metalen post met een kleine bron die wordt gebruikt om een klein volume vloeibaar propaangas uit de handel verkrijgbare cilinder (figuur 5B). Het tweede schip is een gepartitioneerde opslag / die het vaartuig voor het kortly handhaven bevroren monsters onder vloeibare stikstof. <ol><li> De cilinder mondstuk gelegen in het propaan goed openen van de cilinder en om gas te laten stromen in de put van het vaartuig waar het vloeibaar. LET OP: LET !! PROPANE explosief is, KAN FREEZING LETSEL BIJ CONTACT EN IS verstikkend. Gebruik propaan alleen in een chemische kap gecertificeerd voor een dergelijk gebruik de zorg ook om vreemde ontstekingsbronnen te voorkomen, gebruik beschermende kleding tegen lage temperaturen, en het behoud van voldoende ventilatie. </li><li> Zo snel mogelijk af te halen van het model te monteren met fijne kwaliteit pincet en duik het in het vloeibaar gemaakte gas in het eerste vat gedurende enkele seconden daarna snel over te dragen aan de tweede opslagvat van vloeibare stikstof (figuur 5B). </li><li> Zodra de monsters worden bevroren, op te slaan onder vloeibare stikstof totdat klaar om over te dragen aan de freeze-fractuur plant. Breng de stompjes aan een grotere opslag van vloeibare stikstof Dewar container voor uitgebreidopslag desgewenst echter zorg worden afgezien om de stubs ontdooien. </li></ol></li></ol> 3 Werking van de Freeze-fractuur Instrument en Specimen Processing <ol><li> Laden exemplaren op de koperen houder en in de kamer <ol><li> Laad het goud specimen stompjes in een boekje-type double replica exemplaar houder of klem apparaat onder vloeibare stikstof en daar houden totdat klaar om te positioneren in het monster kamer (Figuur 6). </li><li> Wanneer de kamer hoog vacuüm (ongeveer 2 x 10 -6 mbar) heeft bereikt en het podium is afgekoeld tot temperatuur van vloeibare stikstof, schakelt u de pomp, ventilatie van de kamer, en de positie van de gemonteerde exemplaar stompjes op het monster tafel zo snel mogelijk . </li><li> Zet de pomp, herstellen hoog vacuüm, en het gebruik van elektronische podium en arm temperatuurregeling met het model tafel temperatuur tot -100 ° C en directe vloeibare stikstof om de microtoom arm en bri passenng aan vloeibare stikstof geroerd. </li></ol></li><li> Het breukproces <ol><li> Bij het bereiken van een hoog vacuüm, een podium temperatuur van -100 ° C en microtoom arm temperatuur van vloeibare stikstof, op afstand te openen dubbele replica monsterhouder daarmee het doorbreken van de exemplaren van het specimen mounts (freeze-fracture_movie1.mov). </li><li> In het geval van specimens die voor etsen na breuk, gebruikt een scheermesje gehouden in een klem op de microtoom arm scheren (dwz breuk) het oppervlak van de monsters in plaats van stap 3.2.1 (vries-etch_movie2.mov). </li><li> Als de toegevoegde bevriezing etsstap wordt uitgevoerd, plaatst de gekoelde microtoom arm via breukvlakken een tot enkele minuten. LET OP: Deze manoeuvre zal sublimeren (dwz, ets) water van het gebroken oppervlak. Het effect van deze manoeuvre ware celoppervlakken, extracellulaire matrix en / of moleculaire samenstellingen tonen door sublimatie van water, naast fracture gezichten die door de lipide dubbellaag membranen. </li></ol></li><li> Metal shadowing en replica ondersteuning verdamping met behulp van elektronenkanonnen <ol><li> Activeer de platina / koolstof elektron of weerstand pistool en laat een dunne laag (circa 2 nm) platina / koolstof verdampen via breukvlak van een hoek van 30 ° - 45 °. Dit vereist gewoonlijk ongeveer 15 - 20 sec. </li><li> Activeer de koolstof elektron of resistentie gun als in stap 3.3.1 en damp een dunne laag van koolstof het gebroken preparaatoppervlak rechtstreeks overhead (90 °) steun aan de replica geven. Dit vereist gewoonlijk ongeveer 15 - 20 sec. </li></ol></li><li> Ophalen van replica&#39;s <ol><li> Na voltooiing van de replicatie shadowing en carbon stabilisatie, schakelt u de vacuümpomp, ventilatie van de kamer, en verwijder het monster de bevestiging uit het instrument. </li><li> Met behulp van een paar fijne kwaliteit tang te verwijderen elke gouden exemplaar stomp van de dubbelereplica booklet / klem en laat ontdooien enkele seconden voordat langzaam verlagen van de stub op een wateroppervlak in een spot plaat (figuur 7). OPMERKING: De carbon / platina replica met aanhangend specimen materiaal blijft drijven op het wateroppervlak. </li><li> Manoeuvreer de replica&#39;s met behulp van een fijne draad lus of een conventionele elektronenmicroscoop koperen rooster waarover fijne rang pincet en overdracht naar een andere spot plaat die 5% natriumdichromaat in 50% zwavelzuur gedurende een tot verscheidene uren. OPMERKING: Dit bad verteert de werkelijke biologische specimen materiaal van de replica. Volle sterkte bleekmiddel kan worden vervangen door het dichromaat / zwavelzuur oplossing. </li><li> Wanneer de spijsvertering is voltooid, de overdracht van de replica terug naar een schoon wateroppervlak en op te halen op een standaard koperen elektronenmicroscopie raster. (NB: Replica&#39;s kunnen uiteenvallen in kleinere stukken tijdens de spijsvertering, maar zelfs zeer kleine replica&#39;s kan een aanzienlijke hoeveelheid informatie bevatten en moet r zijnieved en onderzocht.) winkel replica ondersteunen van roosters in de handel verkrijgbare rooster dozen, waar ze al jaren met voorzichtige behandeling stabiel zal blijven. </li></ol></li></ol> 4 Ultrastructurele Onderzoek van Freeze-fractuur / etch Replica <ol><li> Bekijk replica&#39;s in een transmissie-elektronenmicroscoop in versneld spanning meestal 50-80 kV. </li><li> Noteer relevante beelden op standaard TEM film of met een hoge resolutie digitale camera. </li></ol>

<ol><li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophysic+and+BiochemCytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li>
<li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li>
<li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li>
<li>Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBranton%2C+D+%22ProcNatlAcadSci+USA%22">ProcNatlAcadSci USA</a>. 55, 1048-1056 (1966).</li>
<li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li>
<li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+inner+dynein+arms%2C+radial+spokes%2C+and+the+central+pair%2Fprojection+complex+of+cilia+and+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li>
<li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+the+outer+dynein+arm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li>
<li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick-freeze%2C+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+freeze%2C+deep+etch+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li>
<li>Chandler, D. E., Sharp, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy%3A+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li>
<li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li>
<li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22CurrOpin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li>
<li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium%3A+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastr+Res%22%5BJournal%5D)">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+organization%2C+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li>
<li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastr+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium%3A+A+freeze-fracture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li>
<li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li>
<li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2%2B+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li>
<li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+teratogen+on+%5B3H%5Duridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li>
<li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+%26+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+%26+Immun%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li>
<li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute%2C+low+level+sulfur+dioxide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li>
<li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22InhalToxicol%22%5BJournal%5D)">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li>
<li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy%2C+surface+replication%2C+freeze-etching+and+label+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li>
<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li>
<li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

In de jaren na de invoering ervan en de commerciële beschikbaarheid, freeze-fractuur / etch procedures werden op grote schaal gebruikt voor het onderzoeken van de biologische membraan structuur. Inderdaad, de beste perspectieven van een aantal van de structurele specialisaties van membranen is verkregen in freeze-fractuur / etch voorbereidingen. Deze studies niet alleen bijdragen tot begrip van de structurele organisatie van de membranen maar ook ontvangen inzichten in structuur en functie zijn verbonden. <p class="...

Het concept en de praktische toepassing van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters werd een eeuw geleden geïntroduceerd door Steere 1 meer dan de helft. De vroege apparaat toegeëigend ongelijksoortige onderdelen in een werkende zelfstandige unit 1. De oorspronkelijke inrichting werd aangepast en verfijnd tot commercieel beschikbare instrumenten om de kritische behoefte aan externe manipulatie, het onderhoud van hoog vacuüm tegemoet te komen, en de verdamping van koolstof en metalen om een replica geschikt is voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie (Figuur 1 en Figuur produceren 2). De typische instrument bestaat uit een hoog vacuümkamer specimens tafel en microtoom arm met regelbare vloeibare stikstof omzet (figuur 1). De kamer beschikt ook over twee elektron geweren, een voor het stabiliseren van koolstof verdamping gepositioneerd op een hoek van 90 graden met het model podium en de andere voor Platinum / carbon schaduw onder een instelbare hoek, meestal 15 ° - 45 ° (figuur 2). Stroom naar het apparaat wordt toegepast op de vacuümpomp werken en elektronische panelen reguleren temperatuurregeling en electron gun control. Oorspronkelijk opgevat als middel om verbeterde beeldvorming van virussen bereiken, vries-breuk kreeg nog meer populariteit als een techniek voor het onderzoek en analyse van celmembranen en hun specialisaties 2, 3. Inderdaad, deze procedure integraal ophelderen structuur / functie relaties in cellen en weefsels en veel van deze studies passief klassieke bijdragen aan cellulaire en moleculaire biologie 4-9 geweest. Het hoofddoel en redenen voor de ontwikkeling van de freeze-fractuur technisch artefacten waarneembaar elektronenmicroscopische resolutie voortvloeien uit chemische fixatie en verwerking in gebruikelijke biologische elektronenmicroscopie beperken. Hier is het doel om chemische beperkenfixatie en het monster voldoende snel en vaak in de aanwezigheid van een koude beschermend om ijskristalvorming en andere artefacten invriezen beperken bevriezen. Meer recent heeft deze techniek een heropleving van interesse van moleculair biologen en materiaalkunde onderzoekers voor onderzoek van nanodeeltjes en nanomaterialen gevonden. Freeze-breuk en vries-etch beelden vertonen een driedimensionaal karakter en soms verward scanning electronenmicroscoop. Echter, freeze-fractuur voorbereidingen onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie en hun belangrijke bijdrage aan de hoge resolutie morfologische studies is hun unieke voorstelling van structuur / functie-elementen van de celmembranen. Freeze-breuk verwerking geïnitieerd bevroren cellen en weefsels met voldoende snelheid ijskristallisatie beperken en / of bij gebruik van cryoprotectant middelen zoals glycerol. De monsters worden vervolgens gebroken onder vacuüm en een repLica wordt gegenereerd door verdamping van koolstof en platina via breukvlak. Het originele exemplaar wordt verteerd van de replica die wordt opgehaald op een standaard EM specimen net. Een andere veel voorkomende verkeerde interpretatie van freeze-fractuur beelden is dat ze uitbeelden celoppervlak. Maar het uitgangspunt van freeze-fractuur is dat biologische membranen worden gesplitst door de lipide dubbellaag van de fractuur-proces (figuur 3). Dit proces in biologische membranen levert twee breuk vlakken, een die de organisatie van de helft van het membraan grenzend aan het cytoplasma, de PF-face openbaart, en een die helft van de bimoleculaire bijsluiter van het membraan dat grenst aan het extracellulaire openbaart milieu, de EF-face. True cel oppervlakken zijn niet vertegenwoordigd in freeze-fractuur beelden, maar alleen wanneer de volgende toegevoegde stap van freeze-etsen na de breuk procedure wordt gebruikt. Om effectief te etsen eerder gebroken exemplaren aan de oppervlakte detai onthullenl, moeten de monsters bij een snel tempo en zonder unetchablecryoprotectant worden bevroren. Ets water van het oppervlak van het proefstuk gebroken openbaren onderliggende factoren wordt bewerkstelligd door het zo koelen microtoom arm via specimen stadium creëren van een temperatuurverschil tussen de fase die het specimen en het koelen microtoom arm die water veroorzaakt sublimeren van het oppervlak. Wanneer water wordt gesublimeerd van het oppervlak van het proefstuk gebroken tijdens het bevriezen etsen manoeuvre, dan aspecten daadwerkelijk celoppervlakken, extracellulaire matrix, cytoskeletstructuren en moleculaire assemblages kunnen worden onthuld met hoge resolutie. Aldus bevriezen-breuk en vries-etch zijn niet uitwisselbaar termen maar tijdens een stapsgewijze werkwijze waarbij de laatste niet nodig of wenselijk zijn afhankelijk van de behoeften van de specifieke studie. Naar aanleiding van de vries-fractuur / vries-ets procedures, het gebroken oppervlakken zijn onderworpen aan gerichte verdampertief lagen van koolstof en platina met het oog op ondersteuning en beeldvorming contrast met de replica te bieden. De platina / koolstof imaging verdamping kan unidirectioneel of roterende en wordt bewerkstelligd door een weerstand of elektronenkanonnen. Unidirectionele shadowing uit een bekende hoek, meestal 30 ° - 45 °, is handig in het uitvoeren van bepaalde morfometrische berekeningen. Monsters die zijn onderworpen aan diepe etsen typisch roterende schaduw en de resulterende afbeeldingen van deze monsters zijn fotografisch teruggedraaid evalueren. De historische en een doelstelling van de onderhavige freeze-fractuur / vries-etch techniek chemische fixatie en verwerking beperken specimen artefacten die worden geassocieerd met conventionele transmissie elektronenmicroscopie procedures. Deze techniek levert een wezenlijke voordeel in zijn vermogen om driedimensionale detail kennen en dus de verkrijging van morfometrische data in biologisch, materiaalkunde vergemakkelijken en nanotechnology specimens. Freeze-fractuur en vries-ets procedures zijn complex en veelzijdig en sommige aspecten van de toepassing worden aangepast. Deze presentatie biedt een overzicht aanzicht van de belangrijkste kenmerken van de werkwijze en de lezer om de gegevens adres en pas de werkwijze specifieke onderzoekbehoeften uitgebreide gepubliceerde protocollen 10, 11 bedoeld.

<table><tbody><tr><td>Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td><td>Balzers</td><td>BAF400T</td><td></td></tr><tr><td>Standaard buffers</td><td>diverse leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standaard aldehyde fixatiemiddelen</td><td>diverse leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdichromaat</td><td>diverse leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>diverse leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weggebruiksartikelen voor Platinum/Carbon verdamping</td><td>Technotrade International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>diverse leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propaan</td><td>diverse leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weggebruiksartikelen voor elektronenmicroscopie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscoop</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fundamentele technische elementen van freeze-fractuur / freeze-ets in biological electron microscopy

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fractuur / vries-ets beschrijft een proces waarbij exemplaren, meestal biologisch of nanomateriaal in de natuur, zijn bevroren, gebroken, en gerepliceerd naar een carbon / platinum &quot;cast&quot; bestemd voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie genereren. Specimens worden onderworpen aan ultrasnelle vriessnelheden, vaak in aanwezigheid van cryoprotectieve middelen voor ijskristalvorming beperken latere breken van het model in vloeibare stikstof gekoelde temperaturen onder hoog vacuüm. De resulterende gebroken oppervlak wordt gerepliceerd en gestabiliseerd door verdamping van koolstof en platina vanuit een hoek die oppervlak verleent driedimensionale detail aan de cast. Deze techniek is bijzonder verhelderend voor het onderzoek van de celmembranen en hun specialisaties bewezen en heeft aanzienlijk bijgedragen aan het begrip van cellulaire vorm aan verwante celfunctie. In dit rapport geven we een overzicht van de eisen instrument en technisch protocol voor het uitvoeren vanbevriezen-breuk, de bijbehorende nomenclatuur en de kenmerken van breukvlakken, variaties op de klassieke procedure en criteria voor de interpretatie van de freeze-fractuur beelden. Deze techniek is op grote schaal gebruikt voor ultrastructurele onderzoek in veel gebieden van de celbiologie en houdt belofte als een opkomende beeldvormende techniek voor moleculaire, nanotechnologie en materiaalkunde studies.

Het belangrijkste uitgangspunt van freeze-fractuur afbeelding interpretatie is dat breukvlakken passeren de lipide dubbellaag membranen verlenen twee fractuur gezichten, riep volgens afspraak de PF-face (plasma fractuur-face) en EF-face (extracellulaire fractuur-face) (Figuur 3). De PF-face is helft van de membraan lipide dubbellaag grenzend aan het cytoplasma van de cel en de EF-gezicht helft van de membraan lipide dubbellaag naast het extracellulaire milieu. De vries-breuk techniek is bijzonder bruikb...

Basistechnieken en verfijningen van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters en nanomaterialen voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie worden beschreven. Deze techniek is een aangewezen methode voor het onthullen ultrastructureel functies en specialisaties van biologische membranen en voor het verkrijgen van Ultrastructureel dimensionale en ruimtelijke gegevens in materials sciences en nanotechnologie producten.

Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Het doel van het volgende experiment is om een koolstof-platina replica te maken van biologische of andere materialen voor onderzoek met transmissie-elektronenmicroscopie. Om dit te bereiken worden monsters die zijn geprepareerd als dubbele en enkele replica's onderworpen aan ultrasnelle vriestemperaturen om de vorming van ijskristallen te beperken. Vervolgens wordt het bevroren monster via remote manipulatie gefractureerd bij temperaturen van vloeibare stikstof onder hoog vacuüm, waardoor het membraan door de lipide dubbellaag wordt gespleten en er een extracellulaire zijde en een zijde ontstaat die proximaal is aan het cytoplasmatische aspect.Als optionele aanvullende stap kunnen onderliggende kenmerken worden onthuld wanneer water van het oppervlak van het gebroken monster wordt geëtst door de arm van de koelmicrotoom boven de monsterhouder te plaatsen om een temperatuurverschil te creëren, waardoor water van het oppervlak sublimeert. Vervolgens wordt een replica gegenereerd door verdamping van koolstof en platina over het gebroken oppervlak.Het oorspronkelijke specimen wordt uit de replica gedigesteerd, die wordt overgebracht op een specimenrooster voor transmissie-elektronenmi

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

Cryo elektronenmicroscopen, ofwel Scanning (SEM) of Transmission (TEM), worden op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van biologische monsters of andere materialen met een hoog watergehalte 1. Een SEM / focused ion beam (FIB) wordt gebruikt om kenmerken van belang in monsters identificeren en extract een dun, elektron-transparante lamellen overbrenging op een cryo-TEM.

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Hier laten we zien hoe het sandwich-vriesapparaat kan worden gebruikt voor het snel invriezen van biologische monsters, waaronder bacteriën, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde cellen, dierlijke en menselijke weefsels en virussen. We laten ook zien hoe u monsters kunt voorbereiden op ultradunne secties na snelvriezen.

Snelvriezen met behulp van sandwichbevriezingsapparaat voor goed ultrastructureel behoud van biologische monsters in elektronenmicroscopie

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

We presenteren een protocol voor de isolatie en bevriezing van extracellulaire blaasjes (EV's) afkomstig van kankerachtige urotheelcellen. De freeze-fracture-techniek onthulde de diameter en vorm van de EV's en - als een uniek kenmerk - de interne organisatie van de EV-membranen. Deze zijn van immens belang om te begrijpen hoe EV's interageren met de membranen van de ontvanger.

Freeze-Fracture Elektronenmicroscopie voor extracellulaire vesikelanalyse

Leer freeze-fracture en freeze-etch technieken voor biologische elektronenmicroscopie. Deze methode onthult ultrastructuren van membranen door snelvriezen en replica-vorming met koolstof en platina.

Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy

Meer video's verkennen