Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy

Het doel van het volgende experiment is om een koolstof-platina replica te maken van biologische of andere materialen voor onderzoek met transmissie-elektronenmicroscopie. Om dit te bereiken worden monsters die zijn geprepareerd als dubbele en enkele replica's onderworpen aan ultrasnelle vriestemperaturen om de vorming van ijskristallen te beperken. Vervolgens wordt het bevroren monster via remote manipulatie gefractureerd bij temperaturen van vloeibare stikstof onder hoog vacuüm, waardoor het membraan door de lipide dubbellaag wordt gespleten en er een extracellulaire zijde en een zijde ontstaat die proximaal is aan het cytoplasmatische aspect.

Als optionele aanvullende stap kunnen onderliggende kenmerken worden onthuld wanneer water van het oppervlak van het gebroken monster wordt geëtst door de arm van de koelmicrotoom boven de monsterhouder te plaatsen om een temperatuurverschil te creëren, waardoor water van het oppervlak sublimeert. Vervolgens wordt een replica gegenereerd door verdamping van koolstof en platina over het gebroken oppervlak.

Het oorspronkelijke specimen wordt uit de replica gedigesteerd, die wordt overgebracht op een specimenrooster voor transmissie-elektronenmicroscopie. Uiteindelijk wordt freeze fracture freeze etch gebruikt om driedimensionale structurele details van celmembranen, moleculaire arrays en nanomaterialen zichtbaar te maken bij onderzoek met transmissie-elektronenmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het onderzoek van ultradunne coupes, is dat de objecten van belang in drie dimensies kunnen worden bekeken met elektronenmicroscopische resolutie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de cel- en moleculaire biologie en nanotechnologie, zoals de dimensionale en structurele kenmerken van celmembranen en de organisatie van moleculaire arrays en nanomateriaal-arrays. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik merkte dat soortgelijke studies met belangrijke ontdekkingen waren uitgevoerd op eukaryote protisten, maar dat er beperkte aandacht was besteed aan relevante thema's binnen de menselijke gezondheidszorg. Begin deze procedure met de preparatie van biologische monsters voor freeze fracture freeze edge, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Selecteer met een pincet van fijne kwaliteit en/of injectienaalden met een klein kaliber goud- of koperen monstersteuntjes van de juiste grootte en vorm voor het te verwerken monster. Plaats kleine fragmenten van het monster op de bovenkant van een metalen monstersteuntje. Reduceer bij enkele replica's de vloeistofinhoud van het monster tot een kleverige, lichtlijmachtige consistentie door vloeistof met filterpapier van de rand van het steuntje af te trekken.

Gebruik injectienaalden met een klein kaliber om voor dubbele replica's een hoopje weefsel op de stub te creëren. Keer een andere stub om, positioneer deze precies boven de eerste stub en plaats deze voorzichtig op het oppervlak van het monster. Zo wordt er een sandwich gevormd.

Druk het preparaat niet uit tussen de twee stubs. Vul vervolgens twee geïsoleerde duo-vaten met vloeibare stikstof. In het eerste vat bevindt zich een metalen paal met een kleine put, die wordt gebruikt om een klein volume propaangas uit een commercieel verkrijgbare cilinder te liquefieren.

Het tweede vat is een compartimenteel opslagvat voor het kortstondig bewaren van bevroren monsters onder vloeibare stikstof. Gebruik propaan uitsluitend in een chemische zuurkast die gecertificeerd is voor dit gebruik. Zorg ervoor dat externe ontstekingsbronnen worden vermeden, gebruik kleding die beschermt tegen lage temperaturen en handhaaf voldoende ventilatie, aangezien propaan explosief is.

Kan bij contact vrieswonden veroorzaken en werkt verstikkend. Gebruik de cilinderuitlaat die in het propaan is geplaatst, open de cilinderventiel volledig en laat het gas in het reservoir van het eerste vat stromen, waar het zo snel mogelijk zal vloeibaar worden. Pak de specimenhouder met een fijne pincet en dompel deze enkele seconden onder in het vloeibare gas in het eerste vat.

Breng ze vervolgens snel over naar het tweede opvangvat met vloeibare stikstof. Zodra de specimens bevroren zijn, worden ze bewaard in vloeibare stikstof totdat ze klaar zijn voor overdracht naar de vriesbreukinstallatie. Plaats de gouden specimenstompjes in een booklet-type, dubbele replica specimenhouder of klemapparaat onder vloeibare stikstof en houd ze daar tot ze in de specimenkamer worden geplaatst.

Wanneer de kamer een hoog vacuüm heeft bereikt en de tafel is afgekoeld tot de temperatuur van vloeibare stikstof, schakelt u de pomp uit, ventileert u de kamer en plaatst u de gemonteerde monsterstubs zo snel mogelijk op de monstertafel. Zet vervolgens de pomp weer aan om het hoog vacuüm te herstellen en gebruik de elektronische bediening van de tafel- en armtemperatuur om de temperatuur van de monstertafel in te stellen op -100 °C. Leid daarnaast vloeibare stikstof naar de arm van de microtoom om deze op de temperatuur van vloeibare stikstof te brengen.

Zodra een hoog vacuüm is bereikt, een platvormtemperatuur van -100 °C is behaald en de arm van de microtoom op de temperatuur van vloeibare stikstof is, wordt de dubbele replica-monsterrhouder op afstand geopend, waardoor de monsters op de monsterhouders fractureren. Als optionele aanvullende stap kunnen de monsters na de fractuur worden geëtst om onderliggende kenmerken bloot te leggen. Om etching te bewerkstelligen, wordt een scheermesje dat in een klem op de arm van de microtoom is bevestigd gebruikt om het oppervlak van de monsters af te schaven. Positioneer de gekoelde arm van de microtoom gedurende één tot enkele minuten boven de gefractureerde oppervlakken om het water te sublimeren, teneinde de werkelijke celoppervlakken, extracellulaire matrix en/of moleculaire assemblages bloot te leggen.

Activeer vervolgens het platina-koolstof-elektronenkanon of het weerstandskanon en laat een dunne laag platina-koolstof over het gebroken oppervlak verdampen onder een hoek van 30 graden tot 45 graden. Dit duurt gewoonlijk ongeveer 15 tot 20 seconden. Activeer het koolstof-elektronenkanon of het weerstandskanon op dezelfde wijze en verdamp een dunne laag koolstof op het oppervlak van het gebroken monster vanaf direct bovenlangs onder een hoek van 90 graden om ondersteuning te bieden aan de replica. Na voltooiing van de replicatie, het shadowen en de koolstofstabilisatie duurt dit doorgaans ook ongeveer 15 tot 20 seconden.

Schakel de vacuümpomp en de kamer uit en verwijder de monsterhouder uit het instrument. Verwijder met een fijne pincet elke gouden monsterstub uit de klem van het dubbele replica-boekje en laat deze enkele seconden ontdooien voordat u de stub voorzichtig op een wateroppervlak in een spotplaat plaatst. Manipuleer de replica's met behulp van een fijne draadlus of een conventioneel koperen elektronenmicroscooprooster vastgehouden door een fijne pincet en breng deze over naar een andere spotplaat met 5% natriumdichromaat in 50% zwavelzuur voor één tot enkele uren. Dit bad verteert het eigenlijke biologische monstermateriaal van de replica.

Wanneer de digestie voltooid is, wordt de replica teruggebracht naar een schoon wateroppervlak en op een standaard koperen elektronenmicroscopie-grid overgebracht. Bewaar de ondersteunende replica-grids in commercieel verkrijgbare griddoosjes, waar ze jarenlang stabiel blijven. Bij voorzichtig hanteeren of ultrastructureel onderzoek van vriesbreuk- en etsreplica's worden de replica's bekeken in een transmissie-elektronenmicroscoop bij een versnellingsspanning, doorgaans tussen 50 en 80 kilovolt.

Leg de relevante beelden vast op standaard TEM-film of met een digitale camera met hoge resolutie die zich in het celmembraan aan de basis van elke eukaryoot bevindt. Het cilium en flagellum vormen een reeks membraangeassocieerde deeltjes die zijn georganiseerd in strengen ENC die rond de schacht van het cilium cirkelen en bekendstaan als de ciliaire ketting. Gespecialiseerde arrays van membraandeeltjes verschijnen op de luminale rand van epitheelcellen die cliogenese ondergaan.

Deze partikelarrays vertegenwoordigen beginnende ciliaire halskettingen, die zich bevinden aan de basis van opkomende en volwassen cilia. In diverse epitheliale freeze-fracturestudies wordt een geavanceerde organisatie onthuld van anastomoserende streng- en groefstructuren die rond het apicale aspect van de basolaterale begrenzingen lopen. Fractuur door epitheliale celmembranen onthult plasmafractuurvlakken van tight junctions die verschijnen als strengen, terwijl de extracellulaire fractuurvlakken complementaire groeven vertonen.

Gap junctions komen voor in vriesbreukpreparaten van diverse weefsels en worden weergegeven door dichte arrays van partikels op plasma-breukvlakken en complementaire putjes op het extracellulaire breukvlak. De vlakken die hier worden getoond, dienen als voorbeeld van snel bevriezen met deep etching en rotary shadowing. De epitheelcel is door het cytoplasma gebroken en een plasma-breukvlak is zichtbaar achter de pijlpunten.

Een echt celoppervlak onthuld door opeenvolgende etsing. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden uitgevoerd in een cyclus van ongeveer drie uur, wat bij een correcte uitvoering één tot drie preparaten oplevert. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de afzonderlijke stappen sterk van elkaar afhankelijk zijn en dat een fout in één stap het resultaat na de ontwikkeling ongeschikt kan maken voor onderzoek en evaluatie.

Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in het veld van de cel- en moleculaire biologie om te onderzoeken hoe genetische mutaties leiden tot structurele afwijkingen in cellen, op een wijze die pathologische condities en ziekten veroorzaakt.