Ontwikkeling van een 3D Grafeen elektrode dielectrophoretic Device

Dit protocol demonstreert procedures voor het vervaardigen van een 3D gelamineerd grafeenpapier, een elektrodenmicro-apparaat en experimentele methoden om polystyreenkraaltjes of biologische cellen te manipuleren via DI-elektroforese of DEP binnen het apparaat. Voortaan zullen we dielektroforese aanduiden als DEP. De vervaardiging van de apparaten wordt gerealiseerd door eerst afwisselend 50 micron grafeenpapier en N min één lagen van 100 micron drukgevoelige polymeertape te stapelen, wat resulteert in helft signaal- en helft grondelektroden.

De lagen worden op elkaar geperst en bijgesneden, waarna de microwel door de structuur wordt geboord. Ten slotte worden met behulp van zilver-epoxy twee koperen geleiders aan de twee uiteinden van het apparaat bevestigd. De tweede stap is het bereiden van DEP-medium met de gewenste geleidbaarheid.

Polystyreenkraaltjes worden vervolgens in deze mediumoplossing gesuspendeerd bij een bepaalde volumeverhouding. De derde en laatste stap bestaat uit het laden van het apparaat met de bereide kraalsuspensie, het monteren ervan op de microscooptafel, het aansluiten van het apparaat op een functiegenerator en uiteindelijk het initiëren van de DEP. Gebruik tot slot een microscoop om de DEP-responsen vast te leggen en bestudeer de eigenschappen van de cel of het deeltje door middel van verdere analyse.

Grafeen is een veelzijdig materiaal dat wordt gebruikt vanwege zijn sterkte alsmede zijn thermische en elektrische eigenschappen. Dit protocol maakt gebruik van betaalbaar grafeenpapier als geleidende elektrodelaag in een driedimensionaal dielektroforetisch micro-apparaat dat in staat is om deeltjes en cellen te onderscheiden voor toepassingen zoals bloedtypering of medische diagnostiek van ziektecellen. De voordelen van dit micro-apparaat met grafeenpapieren elektroden omvatten een eenvoudigere fabricage, een hogere monsterdoorvoer en geometrische veelzijdigheid.

Het 3D niet-uniforme elektrische veld kan grote monstervolumes manipuleren met DP-krachten die uniek zijn in hun vermogen om polariseerbare deeltjes en cellen te onderscheiden op basis van hun intrinsieke chemische en morfologische eigenschappen. Assembleer het gelamineerde apparaat met grafeenpapier en tape. Hier gebruiken we 75 micron dik hydrofoob grafeenpapier van een commerciële fabrikant en 100 micron dikte drukgevoelige dubbelzijdige tape.

Snijd eerst grafeenpapier met een chirurgisch scalpel en een rechte liniaal in rechthoeken van 6,7 centimeter bij 1,5 centimeter en gebruik een schaar om dubbelzijdige drukgevoelige tape in vijf stroken van 1,3 centimeter bij ongeveer vijf centimeter te knippen. Plaats de eerste laag grafeenpapier op een schoon objectglas. Bedek langzaam één uiteinde van het grafeenpapier met één strook tape, waarbij ongeveer twee millimeter marge wordt gelaten om isolatie tussen twee aangrenzende lagen grafeenpapier te waarborgen.

Plaats de tweede laag grafeenpapier bovenop de tape. Verschuif deze ten opzichte van de eerste laag grafeenpapier. Oefen matige druk uit op de bovenkant om een goede afsluiting tussen de lagen te waarborgen.

Herhaal de bovenstaande twee stappen voor de resterende lagen, waarbij moet worden gewaarborgd dat zowel de bovenste als de onderste laag uit grafeenpapier bestaan. Gebruik een schaar om het overtollige plakband van de randen van het apparaat te verwijderen, waarbij een kleine marge van ongeveer één millimeter wordt gelaten om een afgesloten isolatie tussen de grafeenpapierlagen te garanderen. Voer een snelle isolatietest uit met een multimeter door de positieve en negatieve probes op de elektrische aansluitingen aan weerszijden van het apparaat te plaatsen.

Een hoge weerstand van ongeveer honderden kilo ohm duidt op een goede isolatie tussen de lagen. De gelamineerde structuur is nu gereed voor het boren van een microwel. We gebruiken een microfreessysteem om een microwel in de gelamineerde structuur te boren.

Hier gebruiken we een micro-frees met een diameter van 700 micron en een snijlengte van circa 2,1 millimeter. De keuze van de micro-frees is gebaseerd op de diameter van de micro-well en de dikte van het device. Immobiliseer de gelamineerde structuur op de microboor-tafel met klemmen, positioneer de frees met computergestuurde bediening vlak boven de structuur en richt perslucht op het device. Start de frees en laat deze vervolgens langzaam in en door het centrum van de gelamineerde structuur zakken.

Stop op een afstand die iets groter is dan de diepte van de gelamineerde structuur om een grondige verwijdering van puin uit het nieuwe gat te garanderen. Beweeg de frees meerdere keren op en neer door de micro-well om de binnenwand glad te maken.

Het binnenoppervlak van de microwel moet zo verticaal en schoon mogelijk zijn. Voor optimale elektrische veldgradiënten en lichtdoorlaatbaarheid door de microwel worden standaard koperdraden van 32 gauge geknipt in twee stukken van drie centimeter lang, waarbij op twee centimeter twee rechte hoeken worden gevouwen. Meng handmatig ongeveer 0,75 mm van deel A en ongeveer 0,75 mm van deel B van zilvergeleidende epoxy.

Bevestig de draden in een kleine container door voorzichtig zilverepoxy aan te brengen op de uiteinden van en tussen alle drie de grafeenpapierlagen om een goed contact tussen de lagen te waarborgen. Plaats vervolgens de draad van één centimeter tussen twee willekeurige lagen en knijp de lagen zachtjes samen om overtollige epoxy te verwijderen en een goed elektrisch contact te garanderen. Herhaal dit voor de andere zijde van de gelamineerde structuur.

Plaats het gehele apparaat op een rek in een oven om dit gedurende de nacht te drogen bij 70 °C en één atmosferische druk. Haal het apparaat uit de oven en controleer de elektrische isolatie tussen de elektrodeluide. Hier maken we oplossingsmedia met een spectrum aan geleidbaarheden door verschillende verhoudingen van een vooraf bereide 290 mOsm/L mannitol-oplossing en PBS te mengen.

Dit zijn eenvoudige oplossingen die zijn gekozen om op grove wijze een celkweekbuffer na te bootsen. Er bestaat een lineaire correlatie tussen de volumeverhouding van deze twee oplossingen en de resulterende geleidbaarheid van de oplossing; meng polystar-beads of biologische cellen met voorbereide geleidbaarheidsmedia in een volumeverhouding van 1:100 (v/v) door 10 µL polystar-beads en 1 mL van een mediumoplossing in een monsterbuis te pipetteren.

Meng het monster grondig door te vortexen. Klem het apparaat met matige druk op een glazen objectglas met behulp van aangepaste papierklemmen of een equivalent daarvan. De voet moet dicht genoeg bij de microwel zitten om de gelamineerde structuur aan het objectglas af te sluiten, zodat lekkage van het monster wordt voorkomen.

De stevigheid van de klem moet worden gecontroleerd om te voorkomen dat het apparaat vervormt, wat de geometrie van de well en het lichtpad negatief zou beïnvloeden. Scoreer een 0,5 millimeter dik gedekt glasplaatje met een diamantglasnijper die breed genoeg is om de microwell net te bedekken. Snijd het dekglas op maat en leg het apart. Injecteer met deze microspuit langzaam ongeveer één microliter van de polystyreenbolletjessuspensie in de microwell. Om het ontstaan van bellen te voorkomen, dient de injectie te worden herhaald als er bellen verschijnen; wees voorzichtig om de wanden van de microwell niet te beschadigen met de scherpe naald. Vul de microwell iets te vol en schuif onmiddellijk het voorbereide dekglas over de microwell om overtollige vloeistof te verwijderen, verdamping te voorkomen en reproduceerbare volumes te waarborgen.

Bevestig voor elk experiment het volledige gelamineerde micro-apparaat aan de microscooptafel en sluit een functiegenerator aan. Gebruik krokodilklemmen om de apparaten met koperen draden te verbinden en stel met de microscoopsoftware de focus in om de microwel duidelijk te kunnen zien. Hier in het midden van het scherm: 100 Hz tot 10 MHz en 15 V.

Piek-top-signalen werden op het apparaat toegepast. Kralen werden waargenomen in de microwell bij een 10x vergroting op een afstand van 1 tot 200 micron boven het oppervlak van het glasplaatje. Klik op de knop om de cameraregistratie en acquisitie te starten.

Start het signaal van de functiegenerator twee seconden nadat de camera-opname is gestart. De beelden worden digitaal opgeslagen met een snelheid van één tot vijf frames per seconde gedurende ongeveer vijf minuten voor latere intensiteitsanalyse. Verwijder na voltooiing van het experiment het apparaat en demonteer de klemmen.

Reinig zowel het glazen objectglas als het apparaat in zeepsop. Spoel ze daarna goed af. In afwezigheid van een elektrisch veld sedimenteren deeltjes uitsluitend naar de bodem van het apparaat door de zwaartekracht. Bij elektrische velden rond one kilohertz duidt positief DEP-gedrag op een beweging omhoog langs de veldgradiënt, dichter naar het grafeenpapier toe.

Elektroden aan de randen van de microwel worden waargenomen bij elektrische velden boven de 100 kilohertz en in het megahertz-bereik. Negatieve DEP, gekenmerkt door de beweging van kraaltjes langs de gradiënt van het elektrische veld naar het centrum van de microwel, wordt waargenomen. Dit 3D-grafeenpapier-elektrode-microapparaat leverde experimentele resultaten op die in nauwe overeenstemming zijn met zowel het theoretisch voorspelde gedrag als de eerder gerapporteerde experimentele resultaten.

De fabricage van apparaten is uiterst veelzijdig. De verstrekte protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast voor apparaten met meer lagen of andere materialen. Deze video beschrijft een batchgewijze 3D DEP-micro-device.

In toekomstige toepassingen kunnen partikel- of celsuspensies echter continu door de microwel van het apparaat worden geleid om een hogere doorvoer te bereiken. Een voorbeeld van de veelzijdigheid van DEP-sortering is dat waterabsorberend grafeenpapier gelijktijdig kan fungeren als elektrode en filter voor partikel- of celconcentratoren, of zelfs als elektrokinetische biochemische sensoren. Na het bekijken van deze video zouden de kijkers een goed begrip moeten hebben van hoe een meerlaags grafeenpapieren elektrode-microapparaat gefabriceerd kan worden, alsmede hoe het apparaat bediend moet worden om experimenten met partikels of cellen uit te voeren.