Name: En extractie van speeksel DNA voor Next Generation Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Leer een kosteneffectieve methode voor DNA-extractie uit speeksel voor genomisch onderzoek. Dit protocol levert hoogwaardig DNA met minimale degradatie, geschikt voor PCR en next-generation sequencing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een National Institutes of Health R01 (DC009453 ondersteuning aan CWB).

NB: Voorafgaand aan het verstrekken van speeksel alle proefpersonen gaven informed consent die voldoen aan de richtlijnen voor de behandeling van menselijke proefpersonen bij Nationwide Children&#39;s Hospital. 1 Speeksel Collection en opslag <ol><li> Voorafgaand aan speeksel verzamelen, zorgen dat de mond van het onderwerp is vrij van voedsel of andere vreemde stoffen door het hebben van het onderwerp van hun mond te spoelen met water en het vermijden van het eten of drinken gedurende 30 minuten voor het verzamelen van het monster. </li><li> Open een 15 ml centrifugebuis met 2,5 ml van het DNA stabilisatie buffer 2 en zorg ervoor om te voorkomen dat het aanraken van de binnenkant van de dop of buis, en hebben het onderwerp spuwen 2,5 ml speeksel in de bufferoplossing. Opmerking: Het verzamelen van meer dan 2,5 ml speeksel kan leiden tot degradatie van een monster onvoldoende verhouding van monster DNA stabilisatie buffer. Het verzamelen van te weinig speeksel zal verwachte opbrengsten van het protocol te verminderen. Om collectie volumes te evalueren, gebruiken de genummerde hellingen aan de kant van thij tube. </li><li> Plaats de dop en meng door omkeren tot het mengsel wordt gehomogeniseerd. Krachtig schudden is niet noodzakelijk. Bewaar de monsters bij kamertemperatuur kortstondige opslag of 4 ° C voor langdurige opslag (&gt; 3 maanden). </li></ol> 2 eerste voorbereidingen en cellysis <ol><li> Voorafgaand aan het starten van de winning, warmte een waterbad tot 37 ° C, en voor te bereiden een ijsemmer. Drie 15 ml conische centrifugebuizen nodig zal zijn voor elke gewonnen monster. De drie buizen worden gebruikt om de cel en eiwit pellet, de laatste geëxtraheerde gDNA, en isopropanol en ethanol supernatanten houden. </li><li> Ophalen monsters uit de opslag, en omkeren monsters meerdere keren vervolgens vortex met gemiddelde snelheid gedurende 15 sec. </li><li> Verdeel 2,5 ml monster in een schone centrifugebuis van 15 ml en voeg 5 ml Cell Lysis Solution. Meng het monster 50 maal door omkeren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li></ol> 3 RNA verwijderen <ol><li> Voeg 40 gl RNase A Solution bij 100 mg / ml en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder het monster uit het 37 ° C waterbad koel op ijs gedurende 3 minuten. <ol><li> Na RNase A incubatie, verhoog de temperatuur van het waterbad tot 65 ° C voor het DNA rehydratatie stap van het protocol. </li></ol></li></ol> 4 Eiwit en Lipid Removal <ol><li> Voeg 50 pl Proteinase K oplossing 20 mg / ml, meng meerdere malen door inversie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten. Opmerking: Dit is een mogelijke pauzeren punt voor het protocol. Na de toevoeging van het proteïnase K-oplossing kan het monster bij 4 ° C opgeslagen tot de extractie kan worden voltooid. Opslag bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur werd niet aangetoond dat het een significant effect op de extractie rendement of de DNA-kwaliteit hebben. Langdurige opslag in dit stadium nog niet is geëvalueerd. </li><li> Voeg 1,7 ml Protein Precipitation Solution, vortex krachtig gedurende 20 seconden bij hoge snelheid en plaats op ijs gedurende 10 minuten. </li&gt; <li> Wanneer de monsters op ijs afgekoeld gedurende 10 min gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 3000 xg en 4 ° C. De geprecipiteerde eiwitten dient een hecht pellet blijven. Als de pellet is niet strak of de oplossing nog troebel is, kunnen de monsters op ijs gekoeld worden gedurende 5 minuten meer en centrifugeren herhaald. De monsters moeten worden bewaard op ijs om een ​​strakke pellet garanderen. </li></ol> 5 Isolatie en zuivering van gDNA <ol><li> In een schone 15 ml centrifugebuis Pipetteer 5 ml isopropanol en 8 pi zuivere Glycogeen oplossing bij 20 mg / ml. </li><li> Giet het supernatant dat het gDNA van stap 4.3 in de buis met de Isopropanol en Glycogen Solution, achterlating het neergeslagen proteïne pellet. Nadat de supernatant toegevoegd, meng het monster 50 maal door omkeren en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 3000 xg en 4 ° C. </li><li> Giet de supernatant langzaam in een schone 15 ml buis. Na verwijdering van het supernatant, voeg 1 ml 70% ethanolWas de pellet door langzaam schommelen en voorzichtig bewegen ethanol via pellet neergeslagen meerdere malen. Bewaar de ethanol in de buis. </li><li> Na de eerste wasbeurt, centrifugeer het monster gedurende 1 min bij 2000 xg en 20 ° C. Deze centrifugatiestap kan bij hetzij 4 ° C of 20 ° C. Geen significant effect van temperatuur is aangetoond voor deze stap. </li><li> Na de eerste wassen en centrifugeren van de pellet, giet langzaam de ethanol te wassen uit de tube en weggooien, vervolgens een tweede wasbeurt door herhalen van de stappen 5.3 en 5.4. </li><li> Na verwijdering van het supernatant van de tweede wasbeurt, de pellet aan de lucht drogen gedurende 15 minuten. <ol><li> Als het monster is niet helemaal droog, de lucht drogen voor nog eens 15 minuten. </li></ol></li></ol> 6 Rehydratatie van gDNA <ol><li> Nadat het monster is gedroogd, voeg 300 ul Tris-EDTA op de gedroogde pellet gDNA hydrateren. </li><li> Vortex het monster gedurende 5 sec met gemiddelde snelheid en plaats in een65 ° C waterbad gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder de monsters uit het waterbad en incubeer O / N bij kamertemperatuur. Opmerking: Alle producten en reagentia gebruikte materialen in de tabel vermelde, en Tabel 4. </li></ol>

<ol><li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li>
<li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Research+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li>
<li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).</li>
<li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li>
<li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+blood%2C+saliva%2C+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort%3A+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li>
<li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc%CE%B3+receptor+iia+%28cd32%29+and+fc%CE%B3+receptor+iiib+%28cd16%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li>
<li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates%2C+from+salivary+analyses%2C+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li>
<li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale%2C+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).</li>
<li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+genotype-phenotype+model+determinism%3A+Application+to+bivariate+reading%2Flanguage+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze procedure is een geoptimaliseerde DNA-extractie protocol aanzienlijk verbeterd rendement van hoog moleculair gewicht DNA vergeleken met standaard werkwijzen, zonder dat DNA kwaliteit. De kritische stap met het grootste effect op de opbrengst van de meest was stap 5.2, die een langere centrifugatiestap tijdens ethanolprecipitatie dan elke gepubliceerde protocol hier beoordeeld, behalve een die niet op grote schaal werd verspreid 11 bevat. Geen veranderingen in DNA kwaliteit waaraan deze langere centrifuga...

Verkrijgen van hoge kwaliteit DNA voor menselijke genetische studies is essentieel in de ziektegen ontdekkingsproces. Blood, maar die een invasieve procedure en ook duurder dan speeksel collectie, de voorkeur voor het maken geïmmortaliseerde cellijnen als een onuitputtelijke bron van DNA of iPSCs voor functionele studies en soms bloed DNA wordt gebruikt wanneer cellijnen beschikbaar. Echter, het verkrijgen van bloed vereist een getrainde phlebotomist en bloed heeft een kortere halfwaardetijd dan speeksel 1. DNA van speeksel is goedkoper en gemakkelijker te verkrijgen, omdat het kan worden opgehaald en verzonden via de mail zonder de noodzaak van een phlebotomist, waardoor de potentiële proefpersoon zwembaden ver buiten het stroomgebied van ziekenhuizen en laboratoria 2. Studie inschrijving kan worden verbeterd wanneer proefpersonen de mogelijkheid van het geven van een speeksel monster in plaats van bloed 3, 4. Zorgen over de kwantiteit en kwaliteit van het DNA uit speeksel kunnen hebben beperkt het wijdverbreide onse ondanks talrijke studies recente studies die de geschiktheid van speeksel, met een gemiddelde van 4,3 x 10 5 cellen per milliliter, voor het testen van DNA via oudere speekselmonsters methoden waarbij geen significante hoeveelheden speeksel 2, 3, 4, 5 hebben verkregen, 6. Terwijl een bescheiden literatuur bestaat die de geschiktheid van de hele speeksel afgeleide DNA voor genotypering toepassingen, waaronder-microarray gebaseerde methoden 8, 9, 10, geen studies hebben onderzocht next generation sequencing (NGS). Het doel voor het optimaliseren van deze hele speeksel DNA-extractie protocol was om kwantiteit en kwaliteit voor de genetica toepassingen te maximaliseren in een kosteneffectieve manier die gemakkelijk wordt uitgevoerd in laboratoria met gemeenschappelijke reagentia en verbruiksgoederen. DNA-extractie van speeksel vereist een aantal procedures: 1) het verzamelen en opslaan, 2) cellysis, 3) RNase behandeling, 4) eiwitprecipitatie, 5) ethanolprecipitatie, 6) DNA rehydratatie. De DNA Stabilization Buffer oplossing, beschrevenvoorheen 2, adequaat functioneert zonder wijziging. Geen poging de RNase behandeling en DNA stappen rehydratatie optimaliseren gemaakt. Voor elke stap die nog overblijft, werden verschillende variabelen die van invloed kunnen de opbrengst geïdentificeerd. Elke variabele werd individueel gemanipuleerd en verbetering van opbrengst en kwaliteit werd statistisch onderzocht. Voor variabelen die werden naar opbrengst en / of DNA te verbeteren, worden de optimale waarden in de definitieve protocol.

<table><tbody><tr><td>15 ml Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lysis Solution</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Protein Precipitation Solution</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M) Solution</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analog Vortex Mixer</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

en extractie van speeksel dna voor next generation sequencing

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

De voorkeursbron van DNA in onderzoek naar menselijke genetica is bloed, of cellijnen afgeleid van bloed, aangezien deze bronnen grote hoeveelheden hoogwaardig DNA opleveren. DNA-extractie uit speeksel kan echter hoogwaardig DNA opleveren met weinig tot geen degradatie/fragmentatie dat geschikt is voor een verscheidenheid aan DNA-tests zonder de kosten van een flebotomist en kan zelfs per post worden verkregen. Op dit moment zijn er echter nog geen protocollen voor het verzamelen/extracteren van speeksel-DNA voor next generation sequencing gepresenteerd in de literatuur. Dit protocol optimaliseert de parameters van speekselverzameling/opslag en DNA-extractie om van voldoende kwaliteit en hoeveelheid te zijn voor DNA-tests volgens de hoogste normen, inclusief microarray-genotypering en next generation sequencing.

Om de optimale parameters te bepalen voor DNA-extractie van een reeks gekoppelde DNA extracties werd uitgevoerd. Een enkele speeksel monster werd gesplitst en elk deel daarop een van twee mogelijke waarden voor een gegeven variabele. Ten minste acht replicaten van elke gepaarde proef uitgevoerd (bijvoorbeeld, werd een speeksel monster porties verdeeld extractie testen met en zonder initiële 50 ° C incubatie). Optimalisatie is gebaseerd op vier standaard metrics: totale DNA opbrengst, de 260/280 waarde, de waard...

DNA-extractie uit speeksel kan een gemakkelijk beschikbare bron van DNA met een hoog moleculair gewicht leveren, met weinig tot geen degradatie/fragmentatie. Dit protocol biedt geoptimaliseerde parameters voor speekselverzameling/opslag en DNA-extractie om van voldoende kwaliteit en kwantiteit te zijn voor downstream DNA-tests met hoge kwaliteitseisen.

En extractie van speeksel DNA voor Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van genomisch DNA van hoge kwaliteit uit volledig speeksel. Dit wordt bereikt door eerst de cellen te lyseren om het DNA vrij te maken. De tweede stap van de procedure is het verwijderen van RNA- en eiwitverontreinigingen.De derde stap is het neerslaan van het genomisch DNA en het verwijderen van eventuele resterende contaminanten of onzuiverheden. De laatste stap is het rehydrateren van het genomisch DNA voor downstream toepassingen zoals PCR en sequencing. Uiteindelijk kunnen spectrofotometrie en amplificatie aantonen dat het verzamelde genomisch DNA van hoge kwaliteit is.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van opvangkits is dat de kosten aanzienlijk worden verlaagd zonder verlies van opbrengst. Een half uur voor het opvangen van het speeksel moeten de proefpersonen hun mond spoelen met water en vervolgens afzien van eten of drinken totdat het monster is afgenomen. Om het monster af te nemen, moet de proefpersoon precies 2,5 milliliters speeksel spugen in een 15 milliliter buis die 2,5 milliliters DNA-stabilisatiebuffer bevat.Raak de binnenkant van de buis of de binnenkant van de dop niet aan. Sluit de buis tijdens dit proces met de dop en homogeniseer het mengsel door om te keren, niet door te schudden. Bewaar het monster vervolgens op korte termijn bij kamertemperatuur of tot drie maanden bij vier graden Celsius.De voorbereidingen omvatten het verwarmen van een waterbad tot 37 °C en het gereedzetten van drie buisjes van 15 ml. Begin met het enkele malen inverteren van het monster en vortex dit vervolgens op gemiddelde snelheid gedurende 15 seconden. Breng 2,5 ml van het monster over naar een van de buisjes.Voeg vijf milliliter cellyse-oplossing toe aan het aliquot en meng de lyse-oplossing in het monster door de buis 50 keer om te keren. Zodra het monster is gemengd, laat u het 30 minuten incuberen. Voeg na een half uur bij kamertemperatuur 40 microliters RNA A met een concentratie van 100 milligram per milliliter toe aan de geleden cel-oplossing.Keer de buis vervolgens snel vijf keer om. Laat de RNA-reactie 15 minuten incuberen bij 37 °C. Koel de buis daarna drie minuten op ijs.Verhoog op dit punt de temperatuur van het waterbad naar 65 °C. Haal vervolgens de buis uit het ijs. Voeg 50 µL proteinase K toe en meng; laat de reactie daarna 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur of 16 tot 24 uur bij 4 °C.Voeg later 1,7 milliliters eiwitprecipitatie-oplossing toe en vortex de buis 20 seconden op hoge snelheid. Laat het monster vervolgens 10 minuten op ijs afkoelen. Centrifugeer het monster na afkoeling 10 minuten bij 3000 Gs en bij vier graden Celsius.Als de pellet niet compact is, koel het monster dan nog vijf minuten extra en centrifugeer het opnieuw gedurende vijf minuten. Herhaal dit proces totdat een compacte pellet is verkregen. Houd het monster hierbij constant koud.Begin de DNA-isolatie door een schone buis van 15 milliliter voor te bereiden met vijf milliliter isopropanol en acht microliters glycogeenoplossing van 20 mg/mL. Giet vervolgens het supernatant van het gecentrifugeerde monster in deze buis. Verwijder de pellet en meng het monster 50 keer door inversie.Centrifuge het monster vervolgens 30 minuten bij 3000 Gs en vier graden Celsius. Giet het supernatant, zonder de pellet mee te nemen, in een andere schone buis van 15 milliliter. Voeg één milliliter 70% ethanol toe en schud de buis 30 seconden lang handmatig op zijn zij.Centrifugeer vervolgens de ethanoloplossing gedurende één minuut bij 2000 Gs en bij ofwel 4 °C of 20 °C. Verwijder het supernatant door het voorzichtig af te gieten en voeg daarna meer ethanol toe aan het pellet. Schud de buis handmatig en herhaal de centrifugatie.Giet vervolgens de ethanol opnieuw langzaam af. Tijdens het wassen kan het pellet losraken. Als dit gebeurt, zorg er dan voor dat het in de ethanoloplossing blijft en niet aan de wanden of het deksel van de buis kleeft.Keer de buis tijdens deze wasstap niet om. Laat de buis na de ethanolwassingen 15 tot 30 minuten aan de lucht drogen. Rehydrateer vervolgens de pellet van genomisch DNA door eerst 300 µL tris EDTA toe te voegen.Vortex vervolgens een monster op gemiddelde snelheid gedurende vijf seconden en breng het monster voor een uur over naar een waterbad van 65 °C. Laat het monster na verhitting in het bad een nacht incuberen bij kamertemperatuur; de volgende dag is het DNA klaar voor gebruik. Bij gel-elektroforese van de DNA-extractie monsters van speeksel zijn duidelijke banden met een hoog molecuulgewicht zichtbaar, zonder de uitvegingen die duiden op gedegradeerd DNA. De stap voor RNA-verwijdering is noodzakelijk en zeer effectief.Na de RNA-digestie is de ratio tussen 260 nanometer en 280 nanometer gemiddeld 1,74. Belangrijk is dat het DNA geschikt is voor high-throughput sequencing. Een target enrichment kit werd toegepast op 24 monsters waarbij 2,6 megabases aan DNA werden getarget; per lane werden 12 gebarcodeerde monsters gesequenced.Alle 24 monsters hadden NGS-gegevens van hoge kwaliteit en zeldzame enkelnucleotide-polymorfismen konden worden geïdentificeerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u genomisch DNA van hoge kwaliteit uit volledig speeksel extraheert.

collection-and-extraction-of-saliva-dna-for-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Rekening houdend met speeksel bemonstering voor toekomstige klinische toepassing, is een lolly-achtige ultrafiltratie (LLUF) probe gemaakt om te passen in de menselijke mondholte. Directe analyse van onverteerd speeksel door nanoLC-LTQ massaspectrometrie werd aangetoond dat LLUF sondes om grote eiwitten en een hoge overvloed eiwitten te verwijderen, en maak een lage overvloedige peptiden meer aantoonbaar.

Bemonstering Human Inheemse Speeksel peptidoom Met behulp van een Lollipop-Like Ultrafiltratie Probe: vereenvoudigen en te verbeteren Peptide Detection voor Klinische massaspectrometrie

Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

We beschrijven een efficiente en rendabele methode voor het extraheren van nucleïnezuur uit uitstrijkjes ter karakterisering van bacteriële 16S rRNA gen gebruiken amplicon sequencing. De methode maakt het mogelijk voor een gemeenschappelijke aanpak voor de verwerking van meerdere soorten monster en herbergt een aantal downstream-analytische processen.

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

Metagenomica werd gebruikt om het microbioom van silage rundveevoer te onderzoeken. Analyse werd uitgevoerd door shotgun sequencing. Deze aanpak werd gebruikt om de samenstelling van de microbiële gemeenschap binnen het rundveevoer te karakteriseren.

Metagenomic Analyse van kuilvoer

De vergelijking en optimalisatie van twee organellaire DNA-verrijkingsmethoden worden voorgesteld: traditionele differentiële centrifugatie en fractionering van het totale gDNA op basis van methyleringsstatus. We beoordelen de resulterende DNA-hoeveelheid en kwaliteit, tonen de prestaties aan bij korte-leesvolgorde-sequencing, en bespreken het potentieel voor gebruik bij langlezen single-molecule sequencing.

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om DNA-vingerafdrukkenprofielen te genereren door de VNTR-locus D1S80 te versterken uit epitheelcel-DNA.

Toepassing van DNA-vingerafdrukken met behulp van de D1S80 Locus in labklassen

Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

Dit protocol beschrijft een alomvattende aanpak voor het kweken, sequentiëren en de novo hybride genoomassemblage van urinebacteriën. Het biedt een reproduceerbare procedure voor het genereren van volledige, circulaire genoomsequenties die nuttig zijn bij het bestuderen van zowel chromosomale als extrachromosomale genetische elementen die bijdragen aan urinaire kolonisatie, pathogenese en verspreiding van antimicrobiële resistentie.

Hybride de novo genoomassemblage voor het genereren van complete genomen van urinebacteriën met behulp van short- en long-read sequencing-technologieën

We presenteren een geoptimaliseerde methode voor DNA-extractie uit ontsmet sputum met behulp van een matrix-gebaseerde extractiemethode in combinatie met een magnetische parelzuivering voor downstream gerichte next-generation sequencing van Mycobacterium tuberculosis.

Matrix-gebaseerde DNA-extractie voor gerichte sequencing van de volgende generatie op ontsmette sputummonsters

Leer een kosteneffectieve methode voor DNA-extractie uit speeksel voor genomisch onderzoek. Dit protocol levert hoogwaardig DNA met minimale degradatie, geschikt voor PCR en next-generation sequencing.

En extractie van speeksel DNA voor Next Generation Sequencing

Meer video's verkennen