Microschaal-Vortex bijgestaan Electroporatie voor Sequential Molecular Delivery
August 7th, 2014
Een microfluïdische vortex bijgestaan elektroporatie platform is ontwikkeld voor sequentiële levering van verschillende moleculen in dezelfde cel populaties met een nauwkeurige en onafhankelijke dosering controle. Het systeem afmeting gebaseerd doelcel zuiveringsstap voorgaande elektroporatie geholpen om moleculaire levering efficiëntie en verwerkt levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren.
Het algemene doel van deze procedure is om verschillende soorten biologisch zinvolle moleculen op een sequentiële en doseerbaar controleerbare manier met hoge efficiëntie te leveren met behulp van de Vortex-geassisteerde microfluïdische porer. Dit wordt bereikt door eerst vier centrifugeerbuisjes van 50 milliliter afzonderlijk te bereiden met DPBS-oplossingen met cellen en biomoleculen, en elke buis aan zijn respectieve flesjeshouder te bevestigen die verbonden is met het pneumatische stroomregelsysteem. De tweede stap is om de inlaatslangen van elk respectief flesje in het microfluïdische apparaat met de ingebedde 15-pins elektroden in te brengen. Vervolgens worden de cellen in het apparaat gevoerd waar ze vast komen te zitten in microschaal voorwerpen die worden gevormd in de elektroporatiekamers.
De laatste stap is om korte elektrische pulsen toe te passen op de vastgezette cellen, onmiddellijk gevolgd door het injecteren van de oplossingen die de te leveren biomoleculen bevatten in de cytosol. Uiteindelijk kunnen de cellen die uit dit proces zijn verkregen worden vrijgegeven en verzameld voor downstream analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de voorgestelde techniek in staat is om op sequentiële wijze gecontroleerde hoeveelheden van meerdere moleculen af te leveren in een vooraf geselecteerde identieke celpopulatie met hoge efficiëntie en levensvatbaarheid.
Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de stappen voor vloeistofuitwisseling moeilijk te leren zijn omdat de timing van de koude stromingsstap bij elke oplossing. De wisselstap bepaalt de stabiliteit van de celvangst. Een metastatische borstkankercellijn M-D-A-M-B 2 31 zal worden gebruikt in dit experiment, één keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in een volume van 10 milliliters per T 75 weefselkweekkolf in Leibovitz's L 15 medium gesupplementeerd met 10%volume per volume, foetaal bovien serum, en 1%penicilline.
Streptomycine bewaar de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met een 0%koolstofdioxide omgeving. Twee dagen na het zaaien, oogst de cellen voor experimenten. Na het wassen van de cellen met bukos fosfaatgebufferde zoutoplossing of DPBS, behandel de cellen met 0,25% tripsine EDTA gedurende twee minuten.
Voeg acht milliliter groeimedium toe om de enzymatische activiteit te inactiveren, bezink de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 200 keer G en hersuspensieer het medium tot een eindconcentratie van vijf keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Het ontwerp en de fabricage van het microfluïdische elektroporatieapparaat worden niet in deze video getoond, maar worden beschreven in het bijbehorende manuscript. Het systeem bestaat uit inlaten voor cellen, moleculen en een spoeloplossing.
Twee rechte kanalen waar inertiefocusering plaatsvindt. 10 elektroporatiekamers met elektroden en een uitlaat om de stromingsexperimenten op te zetten. Plaats een uitlaat, polyether, ether ketone of piekbuis, en de 15-pins aluminium elektrode voor korte puls, hoge voltage toepassing op de aangewezen plaatsen via de gaten in het microkanaal.
De 15-pins elektrode bestaat uit 10 positieve en vijf negatieve elektroden. Elke positieve elektrode is 1,5 millimeter uit elkaar geplaatst van een negatieve elektrode, en elke elektrode van dezelfde polariteit is 1,35 millimeter uit elkaar geplaatst. Verbind de elektrische apparatuur voor het genereren van hoge voltage korte vierkante golfpulsen naar de aluminium elektroden die in contact zijn met stromende oplossingen.
In de PDMS-mal moet de apparatuur bestaan uit een pulsgenerator en een in-house gebouwde hoogspanningsversterker. Bereid vier 50 milliliter centrifugeerbuisjes afzonderlijk voor met DPBS en oplossingen met cellen en moleculen. Bevestig elke buis aan zijn respectieve flesjeshouder verbonden met het pneumatische stromingsregelsysteem.
Verbind de piekbuis van de inlaten van de flesjeshouders met de respectieve inlaatgaten in het microfluïdische apparaat. Vervolgens, stel de grootte van de vierkante golfpulsen in op 100 volt.
Om de elektrische veldsterkte over de elektroporatiekamer gelijk te hebben aan 0,7 kilovolt per centimeter. Stel de drukregelaar in op 40 PSIA, een enkelvoudige handmatig instelbare stikstofbron wordt gebruikt om alle steekproefbuisjes gelijkmatig te belasten en maakt gebruik van een hogesnelheidsverdeler om individuele oplossingspoorten tijdig te activeren. Gebruik de op maat gemaakte labview-software voor klepbesturing.
Open de labview-software met de label klepbesturing en klik op uitvoeren vanuit het vervolgkeuzemenu getiteld Werken. Klik op het overeenkomstige kleppictogramklep één om de klep voor het DPBS-reservoir te openen om de stromingssnelheid te primen die nodig is voor stabiele celvangst en voortwerpselgeneratie gedurende 1,5 minuten. Het kleppictogram zou van grijs naar groen moeten veranderen wanneer het is geactiveerd, stroming, zowel wassen als celoplossingen tegelijkertijd door het apparaat voor 10 seconden voorafgaand aan de celvangststap.
Om een ononderbroken stroming tijdens de oplossingswisselstap te waarborgen, moet deze korte co-stromingsstap bij elke oplossingswisselstap worden herhaald. Schakel de actieve oplossingspoort om van de wasoplossing naar de celoplossing om cellen in de elektroporatiekamer gedurende 30 seconden te vangen. In deze video vertegenwoordigen de blauwe fluorescente signalen levensvatbare haken.
3, 3, 3, 4, 5 fasecellen. Schakel de waspoort in en spoel het apparaat gedurende 20 seconden. Om niet-vastgezette verontreinigende cellen te verwijderen, stroom de oplossing die het eerste molecuul van belang bevat.
Propidiumjodide in het apparaat voor visualisatiedoeleinden. In deze demonstratie worden nucleïnezuurkleuren gebruikt in plaats van fluorescent gelabelde DExT-strengen vanwege de superieure verhouding van het geluid tot signaal van de kleuren. Pas vijf korte pulsen toe onmiddellijk na injectie van de moleculaire oplossing, bewaak de grootte en het aantal van de toege
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Een microfluidic voortgestuwd elektroporeringsplatform maakt de sequentiële levering van meerdere moleculen in identieke celpopulaties mogelijk met nauwkeurige doseringscontrole. Deze methode verbetert de efficiëntie van moleculaire levering terwijl de levensvatbaarheid van cellen behouden blijft.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Microfluidics
- Elektroporatie
- Celbiologie
Achtergrond
- Elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt om moleculen in cellen te introduceren.
- Microfluïdische apparaten zorgen voor nauwkeurige controle van vloeistofstroom en celmanipulatie.
- Sequentiële levering van biomoleculen kan experimentele uitkomsten verbeteren.
- Het behoud van de levensvatbaarheid van cellen tijdens het proces is cruciaal voor downstream toepassingen.
Doel van de studie
- Om een platform te ontwikkelen voor gecontroleerde levering van meerdere biomoleculen.
- Om de efficiëntie van moleculaire levering in cellen te verbeteren.
- Om een hoge cellevensvatbaarheid na elektroporering te waarborgen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van DPBS-oplossingen met cellen en biomoleculen.
- Gebruik van een pneumatisch stroomregelsysteem voor vloeistofleverting.
- Vorming van microschaal voortstuwingen in elektroporeringskamers.
- Toepassing van korte elektrische pulsen om moleculaire opname te faciliteren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle levering van meerdere biomoleculen in cellen.
- Hoge efficiëntie en levensvatbaarheid van verwerkte cellen.
- Aangetoonde mogelijkheid voor sequentiële en gecontroleerde dosering.
- Potentieel voor downstream analyse van behandelde cellen.
Conclusies
- Het ontwikkelde platform biedt een belangrijke vooruitgang in moleculaire leveringstechnieken.
- Het maakt nauwkeurige controle mogelijk over de dosering en timing van biomoleculaire levering.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende biologische studies die hoge cellevensvatbaarheid vereisen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic electroporation platform addresses the need for precise, sequential delivery of multiple biomolecules into homogeneous cell populations, a critical capability for combination therapy screening and mechanistic de-risking in early discovery. By enabling real-time visualization and in situ parameter adjustment, the system enhances predictive confidence in molecular uptake efficiency while maintaining high viability, supporting reliable go/no-go decisions in target validation workflows. The technology’s ability to deliver charged and neutral macromolecules with consistent efficiency (>70%) across molecular weights provides a scalable, reproducible foundation for assay development in oncology and pharmacology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of combinatorial molecular effects on metastatic breast cancer cells through sequential, dosage-controlled delivery of dextran molecules with varying size and charge.
- Operational Value: Isolates uniform cell populations via microscale vortices, reducing variability in electroporation efficiency and enhancing reproducibility across replicates.
- Predictive Value: Real-time fluorescence monitoring allows immediate optimization of pulse parameters, improving delivery efficiency and data quality for downstream functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized, electroporated cell samples suitable for flow cytometry-based quantification of molecular uptake, enabling robust assay readouts.
- Operational Value: Integrates pneumatic flow control and valve automation for consistent fluid exchange, supporting high-throughput sequential molecule delivery campaigns.
- Scalability: Platform design allows reuse across multiple experimental runs with minimal variation, supporting enterprise-level assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains high cell viability post-electroporation, ensuring recovered cells are suitable for downstream analysis such as flow cytometry and functional validation.
- Mechanistic De-risking: Enables controlled testing of molecular combinations to assess synergistic or antagonistic effects, reducing uncertainty in lead combination selection.
- Predictive Confidence: Demonstrated >70% delivery efficiency for both 3,000 and 70,000 Da dextran molecules supports reliable extrapolation to therapeutic macromolecules in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The platform fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where sequential biomolecule delivery enables systematic evaluation of combination effects on disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of molecular synergy by enabling precise, sequential delivery of probes to identical cell populations under controlled conditions.
- Screening: Delivers quantitative, fluorescence-based uptake metrics that allow comparison of molecular efficiency across varying physicochemical properties.
- Analytics: Generates measurable outputs (uptake efficiency, fluorescence intensity) suitable for statistical analysis and hit selection in screening campaigns.
- Translational Research: Preserves cell integrity for functional assays, bridging discovery findings to preclinical evaluation of molecular combinations.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular fluidic system adaptable to various biomolecules and cell types, supporting repeated use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in combination studies by enabling controlled, sequential delivery of multiple agents to uniform cell populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility through precise flow control, vortex-based trapping, and real-time visualization, minimizing operator-dependent variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing success rates in molecular delivery experiments, reducing wasted reagents and failed runs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of molecular combinations based on validated delivery efficiency and cellular response data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system operation, high-voltage pulse generation, and fluorescent microscopy for real-time monitoring.
- Depends on pneumatic flow control systems, pulse generators, high-voltage amplifiers, and oscilloscopes for precise electrical and fluidic control.
- Necessitates standardization of valve timing, pressure settings, and pulse parameters across users to ensure reproducible vortex formation and electroporation efficiency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of flow rates, trapping duration, and pulse parameters based on cell size and membrane properties.
- Practical limitations include the need for careful handling of high-voltage components and potential shear stress on sensitive cell types during vortex formation.
