Microschaal-Vortex bijgestaan ​​Electroporatie voor Sequential Molecular Delivery

Het algemene doel van deze procedure is om verschillende typen biologisch relevante moleculen op een sequentiële en doseringscontroleerbare wijze met hoge efficiëntie af te leveren met behulp van de vortex-ondersteunde microfluidische porer. Dit wordt bereikt door eerst vier centrifugebuizen van 50 milliliter individueel te prepareren met DPBS-oplossingen met cellen en biomoleculen, en elke buis te bevestigen aan de bijbehorende flaconhouder die is verbonden met het pneumatische stromingscontrolesysteem. De tweede stap is het inbrengen van de inlaatslangen van elke betreffende flacon in het microfluidische device met de ingebedde 15-pins elektroden. Vervolgens worden de cellen in het device geleid, waar ze worden gevangen in micro-vortices die zijn gevormd in de electroporatiekamers.

De laatste stap is het toepassen van korte elektrische pulsen op de gevangen cellen, direct gevolgd door het injecteren van de oplossingen die de biomoleculen bevatten die in het cytosol moeten worden afgeleverd. Uiteindelijk kunnen de cellen die via dit proces zijn verkregen, worden vrijgelaten en verzameld voor verdere analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de voorgestelde techniek in staat is om sequentieel gecontroleerde hoeveelheden van meerdere moleculen met een hoge efficiëntie en levensvatbaarheid af te leveren in een vooraf geselecteerde, identieke celpopulatie.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor vloeistofuitwisseling moeilijk aan te leren zijn omdat de timing van de koude stroomstap bij elke oplossing wisseling de stabiliteit van het vangen van de cellen bepaalt. Een gemetastaseerde borstkankercellijn M-D-A-M-B 2 31 zal in dit experiment worden gebruikt; 1 × 10⁵ cellen per milliliter in een volume van 10 milliliter per T 75 weefselkweekfles in Leibovitz's L 15 medium aangevuld met 10% volume per volume foetaal runderserum en 1% penicilline.

Incubeer de cellen met Streptomycine in een bevochtigde incubator bij 37 °C in een omgeving met 0% koolstofdioxide. Oogst de cellen twee dagen na het uitplaten voor de experimenten. Nadat de cellen zijn gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of DPBS, worden de cellen gedurende twee minuten behandeld met 0,25% trypsine-EDTA.

Voeg acht milliliter groeimedium toe om de enzymatische activiteit te inactiveren; pellet de cellen door middel van centrifugatie gedurende vijf minuten bij 200 ×g en resuspendeer in medium tot een uiteindelijke concentratie van 5 × 10⁵ cellen per milliliter. Het ontwerp en de fabricage van het microfluïdische electroporatieapparaat worden niet in deze video getoond, maar worden beschreven in het bijbehorende manuscript. Het systeem bestaat uit inlaatpoorten voor cellen, moleculen en een spoeloplossing.

Twee rechte kanalen waar traagheidsfocussering plaatsvindt. 10 elektroporatiekamers met elektroden en een uitlaat voor het opzetten van de stroomexperimenten. Plaats een uitlaat, polyetheretherketon- of PEEK-buisjes en de 15-pins aluminium elektrode voor kortstondige hoogspanningsapplicaties in de daarvoor bestemde plaatsen via de gaten in het microkanaal.

De 15-penselektrode bestaat uit 10 positieve en vijf negatieve elektroden. Elke positieve elektrode bevindt zich op een afstand van 1,5 millimeter van een negatieve elektrode, en elke elektrode met dezelfde polariteit bevindt zich op een afstand van 1,35 millimeter. Sluit de elektrische apparatuur voor het genereren van hoogspannings-kort-vierkantgolfpulsen aan op de aluminium elektroden die in contact staan met de stromende oplossingen.

Voor de PDMS-mal moet de apparatuur bestaan uit een pulsgenerator en een intern gebouwde hoogspanningsversterker. Bereid vier centrifugebuisjes van 50 milliliter voor die afzonderlijk DPBS en oplossingen met cellen en moleculen bevatten. Bevestig elk buisje aan de bijbehorende vialhouder die is aangesloten op het pneumatische flowcontrolesysteem.

Sluit de toevoerbuisjes van de flaconhouders aan op de overeenkomstige toevoeropeningen in het microfluïdische apparaat. Stel vervolgens de amplitude van de vierkante golfpulsen in op 100 volt.

Om een elektrische veldsterkte van 0,7 kilovolt per centimeter over de electroporatiekamer te verkrijgen, wordt de drukregelaar ingesteld op 40 PSIA. Er wordt gebruikgemaakt van één handmatig instelbare stikstofbron om alle monsterbuisjes gelijkmatig onder druk te zetten, waarbij een hogesnelheidsmanifold wordt gebruikt om de individuele oplossingspoorten tijdig te activeren. Voor de klepbesturing wordt gebruikgemaakt van op maat gemaakte LabVIEW-software.

Open de LabVIEW-software genaamd valve runner en klik op run in het vervolgkeuzemenu Operate. Klik op het bijbehorende klepicoon valve one om de klep van het DPBS-reservoir te openen, om zo de stroomsnelheid in te stellen die nodig is voor stabiele celvangst en vortexgeneratie gedurende 1,5 minuut. Het klepicoon moet van grijs naar groen verkleuren wanneer het is geactiveerd; laat vervolgens zowel de was- als de celoplossingen gedurende 10 seconden gelijktijdig door het apparaat stromen vóór de stap voor celvangst.

Om een ononderbroken stroom tijdens de stap van het wisselen van oplossingen te garanderen, moet deze korte co-stroomstap bij elke stap van het wisselen van oplossingen worden herhaald. Schakel de actieve poort voor de oplossing om van de wasoplossing naar de celoplossing om cellen gedurende 30 seconden in de elektroporatiekamer op te vangen. In deze video vertegenwoordigen de blauwe fluorescentiesignalen levensvatbare hooks.

Cellen in stadium 3, 3, 3, 4, 5. Zet de spoelpoort open en spoel het apparaat gedurende 20 seconden door. Om niet-gevangen contaminerende cellen te verwijderen, laat u de oplossing met het eerste molecuul van belang doorstromen.

Propidiumjodide in het apparaat voor visualisatiedoeleinden. In deze demonstratie worden nucleïnezuurkleurstoffen gebruikt in plaats van fluorescentielabelde DExT-strengen vanwege de superieure signaal-ruisverhouding van de kleurstoffen. Pas direct na injectie van de moleculaire oplossing vijf korte pulsen toe en monitor de grootte en het aantal van de aangebrachte elektrische pulsen in realtime met een oscilloscoop. De fluorescentiesignalen van de moleculen kunnen onder de microscoop worden gevisualiseerd. Incubeer de cellen gedurende 100 seconden in de moleculaire oplossing. Laat vervolgens de oplossing die het tweede molecuul bevat, de nucleïnezuurkleurstof YO-YO-1, door het apparaat stromen.

In deze demonstratie wordt het tweede molecuul afgeleverd zonder aanvullende elektrische pulsen. Deze video bevestigt dat de cellen nu alle drie de fluorescentiesignalen vertonen: groen voor yo-yo, one, rood voor propidiumiodide en blauw voor hooks.

3, 3, 3, 4, 5. Laat de cellen vrij in een 96-wells plaat voor verdere analyse door de werkdruk tot onder vijf PSI te verlagen. Bij elke vrijgave wordt ongeveer 100 µL oplossing met 100 cellen opgevangen.

De elektroporatieprocedure moet ten minste drie keer worden herhaald om voldoende cellen te verzamelen voor flowcytometrie-centrifugatie. Centrifugeer de 96-wellsplaat met de bewerkte cellen bij 228 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant dat de overtollige fluorescerende moleculen bevat en resuspendeer de cellen in DPBS.

Indien fluorescentielabelled DExT-strengen werden afgeleverd, worden de cellen vervolgens geanalyseerd op moleculaire opname. Efficiëntie via flowcytometrie. Succesvolle moleculaire aflevering werd kwalitatief bepaald door veranderingen in fluorescentie-intensiteit van geëlectroporeerde orbitale cellen in C twee te monitoren, wat bevestigde dat 90% van de behandelde cellen een anionisch DExT-strengmolecuul van 70.000 Dalton opnam.

De efficiëntie voor elk overgedragen dextraanmolecuul, gedefinieerd als de verhouding tussen het aantal cellen dat het betreffende molecuul succesvol heeft opgenomen en het totale aantal verwerkte cellen, varieerde niet wezenlijk afhankelijk van het molecuulgewicht of de elektrische ladingen. Alle geteste dextraanmoleculen werden met een efficiëntie van meer dan 70% in het cytosol afgeleverd. Hier worden onze representatieve flowcytometrie-profielen getoond voor cellen die niet met electroporatie waren behandeld. De fluorescentiedrempel die een succesvolle moleculaire aflevering aangeeft, is op basis van de gegevens zodanig ingesteld dat de signalen van controlemonsters onder deze drempel liggen.

Deze representatieve flowcytometriegegevens voor sequentieel geëlectroporeerde cellen tonen het flowcytometrieplot naast de fluorescerende streak-afbeeldingen; de groene kaders vertegenwoordigen signalen van cellen die alleen neutraal dextran van 3000 Dalton opnemen, en de rode kaders vertegenwoordigen signalen van cellen die alleen een ionisch DExT-streng van 3000 Dalton opnemen. Fluorescerende signalen van cellen die beide DExT-strengmoleculen opnemen, worden in geel weergegeven en duiden op een efficiëntie van dubbele molecuullevering van 56%. Na de ontwikkeling zal deze techniek nuttig zijn voor onderzoekers in de geneeskunde, biotechnologie en farmacologie om combinaties van therapeutische reagentia te onderzoeken om synergetische effecten te bereiken bij de behandeling van complexe ziekten.

Vergeet niet dat werken met hoogspanningspulsen extreem gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen, zoals het waarborgen dat u geaard bent.