Name: Een protocol te infecteren Caenorhabditis elegans Met Salmonella typhimurium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Leer een protocol om Caenorhabditis elegans te infecteren met Salmonella typhimurium voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties. Deze methode identificeert essentiële beschermende genen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Diane Baronas-Lowell voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant en een vergrijzende Scholarship van de Ellison Medical Foundation aan KJ

1. XLD (Xylose Lysine desoxycholaat) Agar Plates XLD agar is een selectieve groei medium voor Salmonella, die verschijnt als zwarte kolonies op XLD agar platen. Echter, als er geen problemen van verontreiniging, bijvoorbeeld een LB plaat kan worden vervangen. <ol><li> Weeg 5,5 g XLD agar en resuspendeer in 5 ml gedeïoniseerd water. </li><li> Meng grondig tot alle agar is nat. Voeg 95 ml gedemineraliseerd water tot alle klontjes zijn verdwenen en het medium is volledig geresuspendeerd. </li><li> Kook de middellange tot volledig oplossen (niet in een autoclaaf). </li><li> Koel het medium bij kamertemperatuur tot 50 ° C. </li><li> Giet 25 ml agar elk 95 x 15 mm (diameter x hoogte) plaat (platen met Parafilm afgesloten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 maand). </li></ol> 2. Nematoden groeimedium (NGM) RNAi Feeding Plates Bereiding van C. elegans NGM platen is eerder beschreven 19. Hier procedure kort beschreven om het antibioticum ampicilline en RNAi chemische inductor isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toevoegen aan de NGM media om de RNAi voeden plates. <ol><li> Los 3 g NaCl en 2,5 g Bacto pepton in 1 liter gedemineraliseerd water. </li><li> Voeg 17 g Bacto agar in de media. </li><li> Autoclaaf de media voor 45 minuten en koel het medium tot 50 ° C in een waterbad. </li><li> Voeg de volgende oplossingen: 1 ml cholesterol (5 mg / ml in 95% ethanol), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, en 25 ml 1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 6,0). Meng goed. </li><li> Voeg 1 ml 1 M IPTG en 500 ul ampicilline (100 mg / ml in steriel water). </li><li> Meng de oplossing goed en giet het in 60 x 15 mm (diameter x hoogte) petri platen met behulp van een pipet hulp en 25 ml serologische pipet volgende steriele procedures. Vul elke plaat met 12 ml agar. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 maand. </li></ol> De essentiële Autofagie gen BEC-1 wordt als voorbeeld de functie van een gastheer gen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht. De experimentele procedures zijn weergegeven in figuur 1 en tabel 1. Het protocol voor de bereiding RNAi-behandelde dieren geïnfecteerd volgt met de dag van elke experimentele stap haakjes. <ol><li> Inoculeer BEC-1 RNAi voeden en besturen lege vector L4440 RNAi voeden bacteriën door een vlok van -80 ° C bevroren bacteriën in 2 ml LB-medium aangevuld met 100 mg / ml ampicilline (dag 1). Herhaal deze stap een keer per week gedurende het hele experiment om verse RNAi bacteriën. Bewaar de cultuur in de 4 ° C koelkast wanneer ze niet gebruikt. </li><li> Zaad 100 ml overnacht RNAi bacteriecultuur op RNAi-platen. Bereid drie bec-1 RNAi en drie controle lege vector RNAi platen. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende de nacht (Dag 2). </li><li> Verwijder de RNAi platen uit de 37 ° C incubator en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur op de bank. Pick up weldoorvoede L4 wild type N2 hermafrodieten en overbrengen naar bec-1 RNAi en controle lege vector RNAi platen. Plaats drie wormen per plaat, op drievoud platen. Op dezelfde dag, bereiden RNAi platen zoals beschreven in stap 3.2 (dag 3). </li><li> Incubeer de RNAi platen met wormen in de 20 ° C incubator voor 36-40 uur en overdracht wormen frisse overeenkomstige RNAi platen bereid in stap 3.3. Na wormen worden overgedragen, incubeer de platen in de 20 ° C incubator gedurende 64 uur (dag 4). </li></ol> 4. Bereid je voor Salmonella-infectie <ol><li> Streak Salmonella -80 ° C bevroren bestand op 1 XLD agar plaat en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende de nacht (Dag 5 </strong&gt;). </li><li> Kies een goed geïsoleerde zwart Salmonella kolonie en beënt in 2 ml LB-medium bij 37 ° C onder schudden gedurende de nacht (dag 6). </li><li> Zaad 80 ml ​​Salmonella overnachtkweek op 1 C. elegans 60 x 15 mm (diameter x hoogte) NGM agar plaat en bereiden 6 borden in totaal. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 6 uur. De bacteriecultuur moet drogen en vormen een grasveld op de plaat (Dag 7). </li></ol> 5. Infect RNAi-behandelde Worms met Salmonella <ol><li> Transfer bec-1-RNAi behandelde en controle lege vector-RNAi behandeld L4 N2 hermafrodieten (nakomelingen van wormen is ingesteld in stap 3) Salmonella platen. Plaats 40 wormen per plaat op 3 platen voor elke groep. Incubeer de worm platen bij 20 ° C gedurende 48 uur (dag 7). </li><li> Bereid een set van verse RNAi platen zoals beschreven in stap 3.1 en 3.2 (Dag 7 en <strong&gt; Dag 8). </li><li> Na 48 uur infectie overdraagbaar Salmonella geïnfecteerde wormen in de overeenkomstige RNAi platen bereid in stap 5.2 en incubeer bij 20 ° C (dag 9). </li></ol> 6. Overleving Assay <ol><li> De score van de overleving van wormen dagelijkse en overdragen wormen frisse overeenkomstige RNAi borden tijdens de eierleggende tijd. Bereid een reeks verse RNAi platen voorafgaand aan elke worm overdracht zoals beschreven in stap 3.1 en 3.2. Raak de worm lichaam (hoofd, middenstuk en staart) voorzichtig met een-end afgevlakt platina draad. Een worm wordt gescoord als dood als er geen beweging van de worm lichaam wordt waargenomen. </li><li> De score van de overleving van wormen dagelijks of om de andere dag, en breng wormen frisse overeenkomstige RNAi platen twee keer per week na wormen stoppen het leggen van eieren. </li><li> Immers wormen sterven, bundelen de overleving gegevens van drievoud platen als een dataset. Voer de overleving gegevens van elke groep in de juiste statistische software zoals GraphPad Prism om overlevingscurven genereren en Kaplan-Meier survival analyses uit te voeren. Het gehele experiment ten minste eenmaal herhaald om de conclusie te bevestigen. </li></ol>

<ol><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. , (1997).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+host+for+the+study+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+genetic+model+for+the+study+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity.</a> Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).</li>
<li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).</li>
<li>Ford, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+descriptive+study+of+human+Salmonella+serotype+typhimurium+infections+reported+in+Ontario+from+1990+to+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997.</a> Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).</li>
<li>Voetsch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoodNet+estimate+of+the+burden+of+illness+caused+by+nontyphoidal+Salmonella+infections+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States.</a> Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).</li>
<li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li>
<li>Alegado, R. A., Tan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antimicrobial+peptides+contributes+to+persistence+of+Salmonella+typhimurium+in+the+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine.</a> Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).</li>
<li>Jia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+protect+against+Salmonella+typhimurium+infection+and+mediate+insulin+signaling-regulated+pathogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).</li>
<li>Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans-based+screen+identifies+Salmonella+virulence+factors+required+for+conserved+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions.</a> Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).</li>
<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2, 1-10 (2001).</li>
<li>Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA-mediated+interference+feeding+strategy+to+screen+for+genes+involved+in+body+size+regulation+in+the+nematode+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li>
<li>Fraser, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+mediated+by+ced-3+and+ced-4+protects+Caenorhabditis+elegans+from+Salmonella+typhimurium-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).</li>
<li>Melendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+are+essential+for+dauer+development+and+lifespan+extension+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans.</a> Science. 301, 1387-1391 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

C. elegans is een eenvoudige genetisch modelorganisme dat bacteriën eet als bron van voedingsstoffen. Zo is het gemakkelijk om de normale bacteriële voedsel te vervangen door een intestinale pathogeen interacties tussen C. onderzoeken elegans en de gekozen pathogeen. Hierin een protocol wordt beschreven aan Salmonella-infectie en C. combineren elegans RNAi voeden behandeling om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht. Vor...

De vrijlevende bodem nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudige en genetisch handelbaar modelorganisme gebruikt voor vele biologische vraagstukken te bestuderen. C. elegans overwegend bestaat als zelfbemestende hermafrodieten. Mannetjes worden spontaan gegenereerd door niet-scheiding van het X-chromosoom tijdens gametogenese 1,2. In aanwezigheid van overvloedig voedsel, C. elegans voortdurend te ontwikkelen door middel van vier larvale stadia tot volwassene. Temperatuur beïnvloedt ook C. elegans ontwikkeling; snellere ontwikkeling waargenomen bij hogere temperaturen. In het laboratorium, C. elegans is gekweekt bij een standaard temperatuur van 20 ° C op agar platen met zaadjes bacterie Escherichia coli (stam OP50) als voedsel 1,2. In het laatste decennium, C. elegans heeft zich ontpopt als een ongewerveld organisme om gastheer-pathogeen interacties 3-5 te bestuderen. In de natuur, C. elegans eet bacteriën als nutrient bron 1,2. De normale bacteriële laboratorium voedsel, OP50, kan gemakkelijk worden vervangen door andere pathogenen om de interactie tussen C onderzocht elegans en elke gewenste pathogeen. Onder deze omstandigheden, de darm is de primaire plaats van de infectie. Inderdaad, een groot aantal bacteriële pathogenen aangetoond dodelijk infecteren C. elegans 3-5. De Gram-negatieve bacterie Salmonella is een gastro-intestinale ziekteverwekker die menselijk voedsel overgedragen ziekte veroorzaakt wereldwijd 6,7. C. elegans is een goed model gastheer voor Salmonella typhimurium als deze bacterie repliceert en vertoont aanhoudende darminfecties 8-10. C. elegans is gebruikt om zowel nieuwe identificatie en eerder bekende Salmonella virulentiefactoren 11. Interessant is dat de C. elegans immuunsysteem succes beperkt Salmonella replicatie. Eerder is gerapporteerd dat inhibvulle van autofagie genen maakt verhoogde Salmonella replicatie in C. elegans, resulterend in vroege dood van geïnfecteerde wormen 10. Macroautofagie (hierna autophagy) is een dynamisch proces, waarbij de herschikking van subcellulaire membranen cytoplasma en organellen sekwestreren voor levering aan het lysosoom voor afbraak 12. Autophagy is gemeld dat de Salmonella replicatie in C. beperken elegans en zoogdieren 10,13. De C. elegans genoom was de eerste meercellige eukaryote genoom in kaart gebracht; Het reageert op RNAi behandeling 14-16. Bovendien kan RNAi effectief worden beheerd door het onderwerpen wormen bacteriën die de dubbelstrengs RNA van doelwitgen, bekend als RNAi voeden 16,17 innemen. Hele genoom RNAi voeden bibliotheken zijn gegenereerd voor genoom-brede RNAi screening 16,18. Hierin, een Salmonella-infectie proprotocol is gekoppeld RNAi voeden beproefd C. toestaan elegans genen van belang vanwege hun vermogen om te beschermen tegen Salmonella infectie.

<table><tbody><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD agar</td><td>EMD Chemicals</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 95 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 x 15 mm&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Serological pipet</td><td>Fisher</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Express Pipet-Aid</td><td>Fisher</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 shaking incubator&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

een protocol te infecteren<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; met<em&gt; salmonella typhimurium</em

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In het laatste decennium, C. elegans heeft zich ontpopt als een ongewerveld organisme om interacties tussen gastheren en ziekteverwekkers te bestuderen, met inbegrip van de afweer tegen gram-negatieve bacterie Salmonella typhimurium. Salmonella stelt persistente infectie in de darm van C. elegans en resulteert in vroege dood van de besmette dieren. Een aantal immuniteitsmechanismen geïdentificeerd in C. elegans te verdedigen tegen Salmonella infecties. Autophagy, een evolutionair geconserveerd lysosomale afbraak route, is aangetoond dat de Salmonella replicatie in C. beperken elegans en zoogdieren. Hier wordt een protocol beschreven te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium, waarbij de wormen worden blootgesteld aan Salmonella gedurende een beperkte tijd, vergelijkbaar met Salmonella-infectie bij mensen. Salmonella infectie aanzienlijk verkort de levensduur van C. elegans &lt;/ Em&gt;. De essentiële Autofagie gen BEC-1 als voorbeeld, combineerden we deze infectie methode C. elegans RNAi voeden benadering en toonde dit protocol kan worden gebruikt om de functie van C. onderzocht elegans genen van de gastheer in de verdediging tegen Salmonella infectie. Sinds C. elegans hele genoom RNAi bibliotheken beschikbaar zijn, dit protocol maakt het mogelijk om uitgebreid te screenen op C. elegans genen die beschermen tegen Salmonella en andere intestinale pathogenen met behulp van genoom-brede RNAi bibliotheken.

Bij 20 ° C, de gemiddelde levensduur van wild-type N2 wormen is 17 dagen (Figuur 2A en tabel 2). Salmonella-infectie vermindert aanzienlijk de mediane levensduur van N2 wormen tot 10,5 dagen (p = 0,0002, log-rank test) (Figuur 2A ). Als een C. elegans gen een belangrijke rol in de verdediging tegen Salmonella infectie speelt, wordt voorspeld dat de remming gevoeligheid zal geven Salmonella infectie. In fei...

C. elegans heeft zich ontpopt als een nieuwe genetische model om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium combinatie met een dubbele streng RNAi interferentie techniek om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht.

Een protocol te infecteren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Met<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Het algemene doel van deze procedure is om de elegantie te infecteren met salmonella om interacties tussen gastheer en pathogeen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst de expressie van een gastheergen te remmen via RNAi. De tweede stap van de procedure is het infecteren van de met RNAi behandelde wormen met salmonella.De infectie wordt gestopt door de geïnfecteerde wormen over te brengen naar niet-pathogene rna eye voedingsplaten. De laatste stappen bestaan uit het registreren van de overleving van de geïnfecteerde wormen. Bereken de overleving op basis van deze gegevens om uiteindelijk genen te identificeren die essentieel zijn voor bescherming tegen salmonella.De procedure wordt gedemonstreerd door Julie John, een laborant. Begin met het voorbereiden van de benodigde kweekplaten. Maak eerst XLD-agarplaten.Deze zijn selectief voor salmonella, die als zwarte kolonies op deze platen verschijnen. Zorg ervoor dat de XLD-agar in water wordt resuspendeerd in een concentratie van één gram per milliliter voordat het wordt gemengd in het volledige watervolume. Niet autoclaveren.Deze agar is zojuist verhit met een warmteplaat. Ga verder met het maken van XLD-platen met een diameter van 95 millimeter, waarbij 25 milliliters agar per plaat wordt toegevoegd. Om de NGM-voedingsplaten met RNAi voor te bereiden om te komen tot wat RNAi-platen worden genoemd, gebruikt u standaardmethoden; voeg kort na het autoclaveren ampicilline en de RNAi-chemische inductor, IPTG, toe aan het medium.Zodra ze zijn afgekoeld, vult u platen van 60 millimeter met 12 milliliters agar; de platen zijn tot een maand houdbaar wanneer ze vóór gebruik worden bewaard bij vier graden Celsius. Vervolgens worden ze geïncubeerd met bacteriën. In dit voorbeeld is Beck 1 het doelgen, aangezien dit essentieel is voor de verdediging tegen salmonella.Begin met het maken van de RNAi- en controleculturen. Voeg een schilfer bevroren bacteriën uit de opslag bij -80 °C toe aan twee milliliter LB met ampicilline. De bacteriën moeten ofwel de RNAi tot expressie brengen, of niet, maar nog steeds een lege vector bevatten.Breng deze twee culturen over naar een incubator en laat ze gedurende de nacht groeien. Dit dient wekelijks te gebeuren, zodat de bacteriën de volgende dag altijd beschikbaar zijn. Ent 100 µL van de cultuur op de RNA eye-platen.Maak van elk type plaat minstens drie experimentele en drie controleplaten. Incubeer deze platen gedurende de nacht bij 37 °C. Breng de platen de volgende dag naar kamertemperatuur.Breng vervolgens goed gevoede L4 wild-type N2 hermafrodieten over naar de platen. Drie wormen per plaat zijn voldoende. Incubeer deze platen op dezelfde dag bij 20 °C.Bereid meer RNAi-platen voor met gekweekte bacteriën. Na 36 tot 40 uur bij 20 °C worden de wormen van de eerste RNAi-platen overgebracht naar de nieuwe RNAi-platen. Plaats ze vervolgens opnieuw bij 20 °C voor nog eens 64 uur.Begin met het uitplaten van een salmonella-stock uit de vriezer van -80 °C op een XLD-plaat. Incubeer de plaat gedurende één nacht bij 37 °C. Selecteer de volgende dag een geïsoleerde zwarte kolonie van de plaat en inoculeer twee milliliter LB.Stel het in om een nacht te schudden bij 37 °C tot de volgende ochtend. Gebruik het geinoculeerde LB om zes NGM-platen aan te zaaien. Breng 80 µL aan op elke plaat; na zes uur bij kamertemperatuur zou de bacteriële cultuur moeten zijn opgedroogd en zal deze een biofilm vormen op de NGM-platen.Breng vervolgens de RNAi-behandelde wormen en de controle-behandelde wormen over naar de zes platen. Plaats 40 wormen op elke plaat en laat deze 48 uur incuberen bij 20 °C. Begin vanaf dit moment dagelijks met het voorbereiden van nieuwe RNAi-platen.Dit is om ervoor te zorgen dat ze na twee dagen en elke dag daarna klaar zijn voor de survival assay. Na 48 uur worden de geïnfecteerde wormen teruggeplaatst op vers bereide RNAi-platen of op controleplaten met een lege vector. Plaats deze platen daarna elke dag rond hun eiafleggingstijd terug in de incubator van 20 °C.Bepaal de overlevingskans van de wormen en breng de overlevers over naar verse RNA-oogplaatjes om de overleving te scoren. Prik de worm voorzichtig aan met een afgeplatte platina draad. Als er geen reactie is, is de worm dood.Tijdens de periode van de eiafzetting moet men wormen identificeren die zijn gestorven door interne hygiëne. Deze wormen moeten tijdig worden verwijderd.De gegevens zouden aanzienlijk geordend zijn als deze eiwitwormen duidelijk als experimentele wormen worden geteld. Zodra de wormen stoppen met het leggen van eieren, is het slechts noodzakelijk om ze twee keer per week over te brengen naar verse RNAI-platen. Wanneer de populaties zijn gestorven, voegt u hun gegevens samen en zet u hun overleving uit in Kaplan-Meier-curves.Wat de conclusie ook is, voer het experiment minstens tweemaal uit ter bevestiging. Bij 20 °C is de mediane levensduur van wild-type N two wormen 17 dagen. Salmonella-infectie vermindert de mediane levensduur van N two wormen aanzienlijk tot 10,5 dagen, zoals verwacht bij behandeling met Beck one RNAi.Afgenomen overlevingskans na salmonellainfectie. De gemiddelde levensduur daalde van 10,5 naar negen dagen, en de maximale levensduur was eveneens significant korter. Dit ondersteunt de rol van Beck one bij de verdediging van sea elegance tegen infectie.Dieren behandeld met Beck one RNAi, maar niet behandeld met salmonella. Er was geen merkbare verandering in de levensduur. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de RNA-benadering en het infectieprotocol toepast om de rol van het gastheergen bij de verdediging tegen een salmonella-infectie te onderzoeken.

a-protocol-to-infect-caenorhabditis-elegans-with-salmonella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Chen, Y., et al. Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a survival assay using C. elegans to model Aeromonas pathogenesis, where oral ingestion of the bacteria leads to intestinal infection and mortality, enabling quantitative assessment of bacterial virulence in a live host system.

Modeling Aeromonas Pathogenesis in C. elegans Using a Survival Assay

De wormsorter vergemakkelijkt genetische screens in Caenorhabditis elegans door het sorteren wormen volgens expressie van fluorescerende verslaggevers. Hier beschrijven we een nieuw gebruik: sorteren volgens kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker, en we gebruiken het om de slecht begrepen rol van pathogeen herkenning bij het initiëren van immuunreacties te onderzoeken.

Geautomatiseerde Scheiding van<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.

Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Zebrafish (Danio rerio) worden een veel gebruikte gewervelde diermodel voor microbiële kolonisatie en de pathogenese. Dit protocol beschrijft het gebruik van de protozoan Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infectie in zebrafish larven. P. caudatum gemakkelijk internaliseert bacteriën en krijgen overgenomen door larvale zebrafish via natuurlijke azen gedrag.

Met behulp van de eencellige Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infecties in Zebrafish larven

Dit protocol beschrijft een muismodel van door salmonella gedreven intestinale fibrose dat lijkt op belangrijke pathologische kenmerken van de ziekte van Crohn, waaronder Transmurale ontsteking en fibrose. Deze methode kan worden gebruikt om gastheerfactoren te evalueren die fibrotische uitkomsten veranderen met Mutant muizen gehandhaafd op een C57Bl/6 genetische achtergrond.

Chronische salmonella infectie veroorzaakte intestinale fibrose

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een beoordeling van veranderingen in proteostase.

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.

High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Leer een protocol om Caenorhabditis elegans te infecteren met Salmonella typhimurium voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties. Deze methode identificeert essentiële beschermende genen.

Een protocol te infecteren

Meer video's verkennen