Name: Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Leer whole-cell patch-clamp opnamen van geïdentificeerde hippocampus interneuronen met GABA B receptor karakterisering. Deze methode combineert elektrofysiologie met morfologische analyse voor precieze classificatie van remmende neuronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Ina Wolter bedanken voor haar uitstekende technische bijstand. VGAT-Venus transgene ratten werden gegenereerd door Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi en Y. Kawaguchi in Nationaal Instituut voor Fysiologische Wetenschappen, Okazaki, Japan, met behulp pCS2-Venus die door Dr A. Miyawaki.

Ethische Verklaring: Alle procedures en dierlijke onderhoud werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen, de Duitse wet op de dierenbescherming, de Europese Richtlijn 86/609 / EEG van de Raad betreffende de bescherming van dieren, en de richtlijnen van de lokale autoriteiten (Berlijn, T-0215/11 ) 1 Voorbereiding van de Acute-hippocampus Slices <ol><li> Neem een transgeen rat (17 tot 24 dagen oud), de uiting van de fluorescerende Venus / YFP eiwit onder de vGAT promotor, die de meerderheid van de corticale remmende interneuronen 13 etiketten. Onthoofden de rat. Snel ontleden de hersenen (&lt;40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) sucrose gebaseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF sucrose-figuur 1A). </li><li> Beoordeel de ontleed hersenen van de rat voor Venus / YFP fluorescentie met een 505 nm LED-lamp en 515 emissie filter, gemonteerd op een bril. </li><li> Verwijder het voorste derde van de cortex en Cerebellum; Vervolgens scheiden de hemisferen, allemaal met een scalpel. Verwijder het dorsale oppervlak van de cortex naar een vlakke ondergrond om de hersenen te lijmen bieden, zoals eerder beschreven 14. </li><li> Snijd dwarse plakjes (300 micrometer) van de hippocampus formatie op een vibratome, moet de hemisferen worden omringd met semifrozen, carbogenated sucrose-ACSF (Figuur 1B) 14. Verwijder de extra gebieden van rostrale cortex, middenhersenen en hersenstam. Transfer elk plakje een ondergedompelde bedrijf kamer met sucrose-ACSF, die wordt carbogenated en opgewarmd tot 35 ° C. </li><li> Laat de plakjes te herstellen bij 35 ° C gedurende 30 minuten vanaf het tijdstip van de laatste snede die het verwarmd ACSF. Doe dit met het oog op de metabole processen te reactiveren en het opnieuw afdichten van gesneden neuronale processen te faciliteren. Vervolgens transfer naar kamertemperatuur opslag (Figuur 1C). </li></ol> 2 Fabrication en vullen van opname Pipettes <ol><li> Pull patch pipetten van glazen capillairen, zodat een pipet weerstand van 2-4 MQ wordt bereikt wanneer gevuld met gefilterd (spuitfilter, poriegrootte: 0,2 urn) intracellulaire oplossing die 0,1% biocytine (voor intracellulaire labeling). Houd de intracellulaire oplossing gekoeld op ijs om afbraak van de bestanddelen te voorkomen. </li><li> Vul patch pipetten voor de identificatie van postsynaptische stroom met een oplossing die een fysiologisch relevant lage Cl - concentratie (E R (Cl) = -61 mV zie oplossing lijst). </li><li> Voor opnamen gekoppeld aan de presynaptische receptor gemedieerde responsen te identificeren, vul patch pipetten met intracellulaire oplossing met lage Ca2 + buffercapaciteit om interferentie met generatoraanspreektemperatuur presynaptisch voorkomen, alsmede 4-voudig hogere Cl - concentratie (E R (Cl) = -20 mV) aan signaal-ruis waargenomen IPSCs 5 waardoor nauwkeurige vaststelling van de farmacologische resp verbeterenonsiveness. Merk op dat het veranderen van Cl - concentratie IPSC kinetiek 15 kan veranderen. </li></ol> 3 Whole Cell Patch-clamp-opname van FS-ins <ol><li> Carbogenate de ACSF en diervoeders via het perfusie systeem de opname kamer door middel van een peristaltische pomp (die ook verwijderd ACSF van de opname kamer via een zuigleiding figuur 2A). Zet alle apparatuur op de setup in de voorbereiding op de opname. </li><li> Transfer een stukje aan de opname kamer en op zijn plaats houden met een platina ring bespannen met enkele vezels van zijde. Plaats het segment waardoor het stratum (str.) Van CA1 pyramidale loopt verticaal door het gezichtsveld toegang geven met 2 pipetten zowel de str. radiatum en str. oriens gelijktijdig (Figuren 2C en 4A). </li><li> Plaats de kamer in de setup en beginnen perfusie van carbogenated en verwarmd (32-34 ° C) het opnemen van eenCSF met een stroomsnelheid van 5-10 ml / min. </li><li> Beoordelen slice kwaliteit onder IR-DIC optiek bij 40X objectieve vergroting, en visualiseren met een CCD-camera weergegeven op een display. Veronderstel goede slice kwaliteit als een groot aantal ronde, matig contrast CA1 pyramidale cellen (CA1 PC) is te zien in str. pyramidale op een diepte van 20-30 micrometer onder een glad en licht bekraterd oppervlak (figuur 2C). Slechte kwaliteit schijfjes bevatten grote aantallen hoog contrast, gekrompen of gezwollen cellen, met een oneffen oppervlak slice. </li><li> Identificeer vermoedelijke FS interneuronen onder epifluorescentie verlichting als die tot expressie Venus / YFP (figuur 2B), met grote multipolaire somata in of nabij het ​​str. pyramidale. Selecteer cellen redelijk diep in de slice (50-100 urn, figuur 2C) om hun morfologische integriteit beter behouden. </li><li> Monteer de registratie-elektrode in de pipet houder op de headstage; dan apply een lage positieve druk (20-30 mbar) door de buis lijn. Laat de pipet om het oppervlak van het deel, enigszins af naar het midden van de geselecteerde neuron. </li><li> Verkrijgen whole-cell opname configuratie zoals eerder beschreven 14,16 en zie ook de figuren 2D en 2E: <ol><li> Richten zich op een cel: Verhoog de ​​druk tot 70-80 mBar en snel te doen dalen de pipet door het schijfje tot net boven de soma van de geselecteerde cel (figuur 2D, boven). </li><li> Benader de cel: Druk op de pipet tegen de celmembraan het produceren van een &#39;kuiltje&#39; op het (figuur 2D, boven). Voer deze stap snel, teneinde biocytine etikettering van naburige cellen te voorkomen. </li><li> Maak een zegel giga-ohm: Laat de druk en gelijktijdig toepassen van een 20 mV spanning commando om de pipet. Een zegel giga-ohm (1-50 GQ Figuur 2D, bodem en figuur 2E midden) typicbondgenoot ontwikkelt zich snel. Eenmaal afgesloten, de verwachte rust membraanpotentiaal (typisch tussen -70 en -60 mV) toegepast als een spanning opdracht. </li><li> Doorbreken van de patch: Eenmaal afgesloten, scheuren het membraan patch met een korte puls van negatieve druk; waardoor het whole-cell configuratie (figuur 2E, onder) bereiken. </li></ol></li><li> Compenseren whole-cell capaciteit en serie weerstand (R S). Rs is gewoonlijk 5-20 MQ en stabiel tot 120 minuten. Abandon cellen als membraan potentiaal (V M) op doorbraak is meer gedepolariseerde dan -50 mV; R S aanvankelijk groter dan 30 MQ; of R S wijziging van meer dan 20% in de loop van de opname. </li><li> Identificeer FS-ins door hun reactie (in de huidige-clamp-modus) tot een familie van hyper naar stroompulsen depolariserende (-250 tot +250 pA, figuur 2F, boven). FS-ins zijn relatief gedepolariseerd V M (meestal -50 to -60 mV), korte membraan tijd-constante (&lt;20 ms) en te reageren op een 500 Pa depolariserende stroom injectie met een trein van actiepotentialen (AP&#39;s) bij frequenties&gt; 100 Hz 11 (figuur 2F, bodem), die duidelijk zijn verschillen van die in CA1 pc&#39;s (figuur 2F, midden). </li></ol> 4 extracellulaire elektrische stimulatie aan GABA B R-gemedieerde reacties Evoke <ol><li> Om synaptically reacties van de consument in acht te nemen, plaatst u een extracellulaire stimulatie-elektrode (een patch pipet gevuld met 2 M NaCl; Resistance: 0,1-0,3 MQ) in de slice op de grens van str. radiatum en str. lacunosum-moleculare. Plaats de elektrode 200-300 urn lateraal van de soma directe elektrische stimulering van de cel voorkomen en minimaliseren stimulatie artefacten (Figuur 3A). </li><li> Nadat de stimulatie-elektrode is gepositioneerd verkrijgen whole-cell registratie vande gekozen cel en beoordeelt de fysiologische fenotype in de huidige-clamp-modus als in paragraaf 3.9 (figuur 3B). </li><li> Met de neuron opgenomen in voltage-clamp (V M -65 mV), leveren elektrische stimulatie van presynaptische axonen bij 50 V (~ 500 uA effectieve stimulus) elke 20 seconden, met een geïsoleerd constante spanning stimulator. Gebruik enkele stimuli (100 msec duur, figuur 3C, boven) om GABA B R gemedieerde IPSCs observeren, en elkaar mogen treinen van verschillende stimuli (bij 200 Hz) tot een grotere afgifte van transmitter produceren. </li><li> Bad gelden ionotropic glutamaatreceptorantagonisten (AMPA receptor: DNQX [10 uM]; NMDA receptor: d-AP5 [50 uM]) om de geïsoleerde monosynaptic IPSC (Figuur 3C, midden boven) te onthullen. Verder isoleren het GABA B-R gemedieerde IPSC met toepassing van een GABA A R blokker (gabazine [10 uM] Figuur 3C middle lower). </li><li> Bevestig de resulterende langzaam naar buiten stroom (Figuur 3C lager, uitgebreid) als zijnde GABA B R-gemedieerd door de latere toepassing van CGP-55845 [5 uM] (Figuur 3C lager, underlain in grijs) </li></ol> 5 Gekoppelde Opnamen van synaptically Coupled FS-IN en CA1 pc <ol><li> Beoordelen GABA B-R gemedieerde presynaptische controle remmende synaptische transmissie met gelijktijdige opnames, uitgevoerd tussen synaptisch-gekoppelde IN en PC paren zoals hieronder beschreven. </li><li> Eerste, de oprichting van een whole-cell opname van een presynaptische interneuron (zoals beschreven in hoofdstuk 3) en bevestig de FS fenotype (Figuur 4A). </li><li> Patch dan een naburige CA1 PC (20-100 micrometer afstand, figuur 4A) en korte bovendrempelige depolariserende stroom pulsen (1 msec duur, 1-5 nA amplitude) aan de presynaptische IN (gehouden in de huidige-clamp-modus) om AP&#39;s te lokken passen. Als een synaptisch coAansluitingen aanwezig, AP in de IN resultaat in IPSCs in het CA1 PC, gehouden in voltage-clamp (compenseren R S tot ongeveer 80%). </li><li> Vul zonodig een nieuwe registratie-elektrode en opnemen van verdere CA1 computers tot een verbinding is gevonden. </li><li> Zodra een verbinding is gemaakt, wekken paren AP in de presynaptische FS-IN zowel de unitaire synaptische respons en dynamisch rijgedrag. Gebruik een typisch gepaarde-pulse-protocol van 2 depolariserende stimuli met een 50 msec interval (Figuur 4B). </li><li> Verzamel controle sporen in uitgangssituatie. Breng daarna de selectieve GABA B R agonist baclofen (10 uM) aan het perfuseren ACSF, waardoor GABA B Rs, gevolgd door de antagonist CGP-55.845 (5 uM) activeren van de receptor gemedieerde effecten volledig blokkeren. Verzamel ~ 50 sporen tijdens steady state toestand van elk geneesmiddel (Figuur 4B en C). </li><li> Nadat de opname is voltooid, sluit de somatische membraan door het vormen van een buitee-out patch: Zuig langzaam de pipet uit de cel lichaam in V-klem en als de R S toeneemt, verminderen de V M tot -40 mV. Doe dit tot de vorming van de outside-out patch te vergemakkelijken; verwijder vervolgens de pipet uit het bad. </li></ol> 6 Analyse van de elektrofysiologische eigenschappen <ol><li> OPMERKING: Een veelheid van verschillende software pakketten zijn beschikbaar voor de aankoop van elektrofysiologische gegevens. Hier, WinWCP, een Windows-programma in de vrije Strathclyde Electrofysiologie software pakket wordt gebruikt, die de opname van maximaal 16 analoge ingangen en uitgangen van de 10 digitale signalen mogelijk maakt. </li><li> Laagdoorlaatfilter alle data: 5-10 kHz en monster bij 20 kHz. </li><li> Analyseer fysiologische gegevens met een off-line analyse suite. OPMERKING: Stimfit, een open source softwarepakket dat een Python shell wordt gebruikt in dit geval omvat; maar andere alternatieven kunnen gemakkelijk worden gebruikt. <ol><li> Analyseer passief membraan pigenschappen van opgenomen neuronen, verworven in stroomtang, van rust membraanpotentiaal. </li><li> Meet de gemiddelde rust membraanpotentiaal van de basislijn van opgenomen antwoorden van het begin van de opname. </li><li> Bereken ingangsweerstand, met de wet van Ohm, van de spanning reactie op de kleinste hyperpolarizing stroompulsen (≤ -50 pA). Om signaal-ruisverhouding, average meerdere sporen verbeteren. Let op: onze voorbeelden zijn meestal gemiddelden van 10-50 individuele veegt. </li></ol></li><li> Schat de schijnbare membraantijdsconstante door het aanbrengen van een mono-exponentiële curve aan het verval van de reacties op de kleinste hyperpolarizing stroompulsen. </li><li> Analyseer actiepotentiaal golfvorm drempel, amplitude (drempel tot piek) en duur (breedte gemeten op halve hoogte) opgewekt door drempelwaarde depolariserende stroom pulsen te bepalen. </li><li> Analyseer GABA B R gemedieerde IPSCs van voltage clamp opnames. Filter sporen off-line op500 Hz (Gaussian filter) en beoordeelt de piek amplitude en latentie van de GABA B R gemedieerde respons (in gemiddelden van ten minste 10 sporen). </li><li> Detecteer effect van GABA B Rs op de remmende uitgang van INs als een verandering in de piek amplitude van de GABA A-R gemedieerde IPSCs gemeten tussen piek en voorafgaande baseline. Bereken de gemiddelde amplitude van ≥50 sporen voor de controleperiode en de steady-state van alle farmacologische tijdperken. </li></ol> 7 Visualisatie en Immunocytochemie van FS-Ins <ol><li> Na de opnamen bevestigen de plakjes door onderdompeling in 4% paraformaldehyde met 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH = 7.35) O / N bij 4 ° C. </li><li> Eventueel segmenten kunnen worden overgedragen PB en bewaard tot ~ 1 week voor verwerking. </li><li> Wash segmenten vrijelijk in vers PB vervolgens in 0.025 M PB met 0,9% NaCl (PBS, pH = 7.35). </li><li> Aan niet-specifiek antilichaam binding verminderen, blokkeren de plakjes for 1 uur bij kamertemperatuur in een oplossing die 10% normaal geit serum (NGS), 0,3% Triton-X100 (een detergens membranen doorlaatbaar) en 0,05% NaN3, opgemaakt in PBS. </li><li> Om label voor PV expressie, gebruik een anti-PV monoklonaal muizenantilichaam verdund in een oplossing die 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN3 in PBS. Incubeer primaire antilichamen gedurende 2-3 dagen bij 4 ° C 12. Spoel plakjes grondig in PBS. </li><li> Breng fluorescent anti-muis secundaire antilichamen (bijvoorbeeld Alexafluor-546.) Samen met de biotine-bindingseiwit streptavidine geconjugeerd aan een fluorochroom (bijvoorbeeld Alexafluor-647); en incuberen in een oplossing die 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN3, verdund in PBS en geïncubeerd O / N bij 4 ° C. </li><li> Royaal spoelen plakjes 2-3x met PBS, gevolgd door 2-3 spoelt in PB. Monteer de plakjes op glasplaatjes. Gebruik maken van een 300 micrometer agar spacer om te voorkomen dat de slice instorten. Cover-slip plakjes met een fluoresmontage cent medium en afdichting met nagellak. </li></ol> 8 Imaging en Reconstructie van Visualized FS-Ins <ol><li> Visualiseer de plakjes met behulp van een scanning confocale microscoop, met de fluorochome verslaggever enthousiast met de juiste laser lijn (diodelaser 635 nm voor Alexafluor-647; Helium-Neon 543 nm voor Alexafluor-546 etikettering voor PV en Argon 488 of 515 nm voor Venus / YFP). </li><li> Neem beelden op een geschikte Z-resolutie (gewoonlijk 0,5-1 urn stappen, met een 20X objectief) een Z-stack van de gehele cel produceren. Meerdere stapels zijn normaliter nodig is om het de hele cel, die digitaal kunnen worden gestikt off-line gebruik van FIJI / ImageJ software (Figuur 5A). </li><li> Reconstrueren de cel van de samengevoegde foto stack met een semi-automatische tracing methode (Gewone neurieten Tracer plugin in Fiji / ImageJ softwarepakket 17, figuur C). </li><li> Tot slot beoordeelt de PV-immunoreactiviteit van de interneuron met een hoge numerieke apertuur objectief (60X silicium-immersie, NA = 1.3). Maak foto&#39;s van de soma, proximale dendrieten en proximale axonen, of als alternatief van axon terminals als somatische wash-out van de PV is te sterk. Cellen worden immuunreactieve voor PV beschouwd als immuno-etikettering wordt gezien om af te stemmen met de-biocytine gelabelde structuren (figuur 5B). </li></ol>

<ol><li>Freund, T. F., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the hippocampus.</a> Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).</li>
<li>Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+labeling+of+parvalbumin-positive+interneurons+and+analysis+of+electrical+coupling+in+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons.</a> Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).</li>
<li>Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+IPSPs+evoked+by+interneurons+at+the+stratum+radiatum-stratum+lacunosum-moleculare+border+in+the+CA1+area+of+the+rat+hippocampus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiolology%22%5BJournal%5D)">Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro.</a> Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).</li>
<li>Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+cleft+at+GABA+synapses+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bridging the cleft at GABA synapses in the brain.</a> Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).</li>
<li>Bartos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+inhibition+promotes+synchronized+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks.</a> PNAS. 99, 13222-13227 (2002).</li>
<li>Cobb, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+effects+of+identified+interneurons+innervating+both+interneurons+and+pyramidal+cells+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).</li>
<li>Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+mechanisms+of+synchronized+gamma+oscillations+in+inhibitory+interneuron+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks.</a> Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).</li>
<li>Ascoli, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+properties+of+anatomically+identified+basket+and+bistratified+cells+in+the+CA1+areas+of+the+rat+hippocampus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro.</a> Hippocampus. 6, 294-305 (1996).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+spiking+cells+in+rat+hippocampus+%28CA1+region%29+contain+the+calcium-+binding+protein+parvalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin.</a> Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).</li>
<li>Booker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+GABAB-Receptor-Mediated+Effects+in+Perisomatic-+and+Dendrite-Targeting+Parvalbumin+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).</li>
<li>Uematsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+composition+of+cortical+GABAergic+neurons+revealed+in+transgenic+Venus-expressing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats.</a> Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).</li>
<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li>
<li>Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Chloride+Ions+Regulate+the+Time+Course+of+GABA-Mediated+Inhibitory+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission.</a> Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Geiger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+in+brain+slices+with+improved+slicer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology.</a> Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shunting+inhibition+improves+robustness+of+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks+by+homogenizing+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates.</a> Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).</li>
<li>Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li>
<li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit%2C+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic%2C+basket%2C+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

We beschrijven een werkwijze die elektrofysiologische en neuroanatomisch technieken combineert functioneel karakteriseren morphologically- en neurochemisch geïdentificeerde neuronen in vitro; in het bijzonder de verschillende vormen van corticale remmende ins. Belangrijke aspecten van de procedure zijn: (1) pre-selectie van potentiële INs; (2) intracellulaire opname en neuron visualisatie; en tenslotte (3) morfologische en immunocytochemische analyse van opgenomen INs. Hoewel dit onderzoek is gericht PV-ins bijzonder ka...

Hippocampale neuronale circuits zijn al lange tijd het onderwerp van intensief onderzoek, zowel met betrekking tot de anatomie en fysiologie, als gevolg van hun essentiële rol bij leren en geheugen en ruimtelijke navigatie in zowel mensen als knaagdieren. Ook de prominente, maar eenvoudige laminaire organisatie van de hippocampus maakt deze regio een geliefd onderwerp van onderzoeken naar structurele en functionele eigenschappen van de corticale netwerken. Hippocampale circuits bestaan ​​uit prikkelende OG cellen (&gt; 80%) en een kleinere (10-20%), maar zeer divers cohort van remmende interneuronen 1-3. Interneuronen laat γ-aminoboterzuur (GABA) vanaf het axon terminals die optreedt bij hoge ionotrope GABA A-receptoren (GABA A ±) en langzame metabotrope GABA B-receptoren (GABA B Rs) 4. Deze remmende mechanismen compenseren excitatie en reguleren van de prikkelbaarheid voornaamste cellen, en dus deir timing en het patroon van de lozing. Echter, GABA model van interneuronen werkt niet alleen OG cellen, maar ook van de interneuronen zelf 5,6. Pre-en postsynaptische receptoren bemiddelen feedback regulatie en remmende onderlinge interacties tussen de verschillende soorten interneuron. Deze remmende mechanismen in interneuron netwerken worden verondersteld centraal in de opwekking en de vormgeving van de bevolking activiteitspatronen, met name oscillaties om bij verschillende frequenties 7. Whole-cell patch-clamp opname is een bekende methode voor het onderzoek van de intrinsieke eigenschappen en synaptische interacties van neuronen. Vanwege de grote diversiteit van interneuronen, onderzoek remmende interneuronen vereist strikte identificatie van de opgenomen cellen. Zoals hippocampus types interneuron worden gekenmerkt door duidelijke morfologische kenmerken en neurochemische markerexpressie, gecombineerd anatomische en immunocytochemische eNALYSE kan een middel zijn om precieze interneuron identiteit 6,8,9 te bepalen. In dit artikel beschrijven we een experimentele benadering waarin whole-cell patch-clamp opnamen van enkelvoudige neuronen of synaptisch-gekoppelde paren gecombineerd met intracellulaire labeling, gevolgd door post-hoc morfologische en immunocytochemische analyse, waardoor de karakterisering van langzame GABA B receptor gemedieerde remmende effecten in geïdentificeerd interneuronen. Als voorbeeld, richten we ons op een groot type interneuron, een deelverzameling van de zogenaamde &quot;basket cellen&quot; (BC), die de soma en proximale dendrieten van de postsynaptische targets innerveert en wordt gekenmerkt door een &quot;snelle spiking&quot; (FS) sproeipatroon, een axon dicht die het cellichaam laag en expressie van de calcium bindend eiwit parvalbumin (PV) 10,11. Deze interneuronen tonen grote remmende postsynaptische stromingen, alsmede prominente presynaptische modulatie van hun synaptische productie, in reactie op GABA B R activering 12. De combinatie van technieken die hier beschreven kan evengoed worden toegepast op intrinsieke of synaptische mechanismen in een verscheidenheid van andere types geïdentificeerde neuron onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Transgene vGAT-venus ratten</td><td></td><td></td><td>zie Uematsu, &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>Venus (515 nm) veiligheidsbril</td><td>BLS Ltd., Hongarije</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie-instrumenten</td><td>&lt;em&gt;d.w.z.&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>Voor het verwijderen van de hersenen</td></tr><tr><td>Vibratoom</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Of een andere high-end vibratoom met minimale verticale oscillatie</td></tr><tr><td>Slices-houdkamers</td><td></td><td></td><td>In eigen laboratorium vervaardigd</td></tr><tr><td>Rechtopstaande IR-DIC-microscoop</td><td>Olympus, Japan</td><td>BX50WI</td><td>Met micromanipulatorsysteem; &lt;em&gt;d.w.z.&lt;/em&gt; Luigs en Neumann, Kleindiek &lt;em&gt;Enz.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>505 nm LED-systeem</td><td>Cairn Research</td><td>OptiLED-systeem</td><td>Of kwiklamp of ander LED-systeem &lt;em&gt;d.w.z.&lt;/em&gt; CooLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Als alternatief 2x Axopatch 200B-versterkers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>WinWCP-acquisitiesoftware</td><td>John Dempster, Strathclyde University</td><td></td><td>Eventuele software voor kwaliteitsacquisitie kan worden gebruikt, &lt;em&gt;d.w.z.&lt;/em&gt; EPHUS, pClamp, Igor etc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Elektrode-trekker</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>Gebruikt met box-filament</td></tr><tr><td>Borosilicaat pipetteglas</td><td>Hilgenberg, Duitsland</td><td>1405020</td><td>2 mm buiten- en 1 mm binnendiameter, zonder filament</td></tr><tr><td>Peristaltische pomp</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>Andere pompen of zwaartekrachttoevoer kunnen in plaats daarvan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Digitale thermometer</td><td></td><td></td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Digitale manometer</td><td>Supertech, Hongarije</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; Huidige datum: 24-08-2026&quot;Omdat er geen brontekst is opgegeven, kan ik geen vertaling produceren. Voer aub de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.&quot;&gt;Geïsoleerde constantspanningsstimulator&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; U heeft geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voeg aub de Engelse tekst toe die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben.&quot;Leeg&quot;&gt;DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Biocytinine</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>Anders bekend als &amp;epsilon;-Biotinoyl-L-lysine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DL-AP5(V) dinatriumzout</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>DNQX-dinatriumzout</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120169</td><td>Als alternatief NBQX of CNQX</td></tr><tr><td>Gabazine (SR95531)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120042</td><td>Als alternatief bicuculline-methiodide</td></tr><tr><td>R-Baclofen</td><td>Abcam Biochemische Stoffen</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>CGP-55,845 hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>anti-PV muizen monoklonaal antilichaam</td><td>Swant, Zwitserland</td><td>235</td><td>Werkconcentratie 1:5.000-1:10.000</td></tr><tr><td>anti-muis secundair antilichaam&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>Indien Venus of GFP bij knaagdieren wordt gebruikt met een rood kanaal (&lt;em&gt;d.w.z.&lt;/em&gt; (546 nm) is raadzaam.</td></tr><tr><td>Normaal geiten serum</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscooppreparaten</td><td></td><td></td><td>Elk merk van hoge kwaliteit</td></tr><tr><td>Glasdekglasjes</td><td></td><td></td><td>Meestal 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>Agar-spacers</td><td></td><td></td><td>Agarblok, met vibratoom gesneden tot 300 µm &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Laser-scanning confocale microscoop</td><td>Olympus, Japan</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Of een ander vergelijkbaar systeem</td></tr><tr><td>Fiji (Fiji is simpelweg ImageJ)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>Zie Schindelin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

whole-cell patch-clamp opnamen van morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus interneurons

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergische remmende interneuronen spelen een centrale rol in neuronale circuits van de hersenen. Interneuronen omvatten een klein deel van de neuronale populatie (10-20%), maar vertonen een hoge mate van fysiologische, morfologische en neurochemische heterogeniteit, als gevolg van hun verschillende functies. Daarom is onderzoek naar interneuronen biedt belangrijke inzichten in de organisatie principes en de functie van neuronale circuits. Dit vereist echter een geïntegreerde fysiologische en neuroanatomisch benadering voor de selectie en identificatie van individuele types interneuron. Whole-cell patch-clamp opnamen van acute hersenen plakjes van transgene dieren, de uiting van fluorescerende eiwitten onder de initiatiefnemers van interneuron-specifieke markers, biedt een efficiënte methode te richten en elektrofysiologisch karakteriseren intrinsieke en synaptische eigenschappen van specifieke soorten interneuron. Gecombineerd met intracellulaire kleurstof etikettering, kan deze aanpak worden uitgebreid met post-hoc-morphological en immunocytochemische analyse, waardoor de systematische identificatie van de geregistreerde neuronen. Deze werkwijzen kunnen worden aangepast aan een breed scala van wetenschappelijke vragen betreffende functionele eigenschappen van diverse soorten corticale neuronen te passen.

Op voorwaarde dat stukje kwaliteit is aanzienlijk goed, het opnemen van zowel CA1 pc&#39;s en FS-ins kunnen worden bereikt met een minimum aan moeite. De transgene rat lijn uiten Venus / YFP onder de vGAT promotor 13 niet ondubbelzinnig te identificeren FS-ins, of zelfs graad. Echter opnamen van IN&#39;s in en rond str. pyramidale, waar de dichtheid van de FS-ins is doorgaans hoog 1, resulteert in een hoge waarschijnlijkheid van FS-ins (Figuur 2B) te selecteren. FS-ins kun...

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Het algemene doel van deze procedure is om GABA B-receptor-gemedieerde effecten te karakteriseren in geïdentificeerde hippocampus parvalbumine-positieve interneuronen. Dit wordt bereikt door eerst acute hippocampus-snedes van hoge kwaliteit te produceren. De tweede stap is het gebruik van een videomicroscoop om neuronen te selecteren op basis van veneuze YFP-expressie en bekende kenmerken van parvalbumine-positieve neuronen.Vervolgens worden whole-cell patchclamp-opnames gemaakt, waarbij ofwel extracellulaire stimulatie of gepaarde opnames worden gebruikt om de effecten die door GABA B-receptoren worden gemedieerd te onderzoeken. De laatste stap is het visualiseren van de neuronen om te bevestigen dat de geregistreerde neuronen inderdaad paralbumine-positief zijn en ofwel parasomatische of dendritische inhiberende neuronen zijn. Uiteindelijk maakt deze methode de karakterisering van GABA B-receptor-gemedieerde inhiberende effecten mogelijk en staat het een eenduidige classificatie van de geregistreerde interneuronen toe.Deze methode kan cruciale vragen in het vakgebied van de interneuronen beantwoorden. Bijvoorbeeld hoe interneuronen met elkaar communiceren en hoe hun exciteerbaarh

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Paaropnamen zijn gelijktijdige gehele cel patch clamp opnamen van twee synaptisch verbonden neuronen, waardoor een nauwkeurige elektrofysiologische en farmacologische karakterisering van de synapsen tussen individuele neuronen mogelijk wordt. Hier beschrijven we de gedetailleerde methodologie en vereisten voor het vestigen van deze techniek in organotypische hippocampale plakculturen in elk laboratorium dat is uitgerust voor elektrofysiologie.

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Subcellulaire patch-clamp opnames bieden de mogelijkheid om de functionele eigenschappen van dendrieten te onderzoeken. Deze fijne structuren zijn echter niet gemakkelijk toegankelijk vanwege hun kleine diameter. Het hier beschreven protocol is bedoeld om het verzamelen van stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopamine neuronen in slicen in vitro te vergemakkelijken.

Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Het huidige protocol beschrijft hoe primaire hippocampale microglia van volwassen muizen kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd, gevolgd door instructies voor het uitvoeren van patch-clamp-opnames van hele cellen op deze acuut geïsoleerde cellen.

Isolatie en opname van patch-clamp met hele cellen van hippocampale microglia van volwassen muizen

Leer whole-cell patch-clamp opnamen van geïdentificeerde hippocampus interneuronen met GABA B receptor karakterisering. Deze methode combineert elektrofysiologie met morfologische analyse voor precieze classificatie van remmende neuronen.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Meer video's verkennen