Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons
September 30th, 2014
Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.
Het algemene doel van deze procedure is om GABA B-receptorgemedieerde effecten in geïdentificeerde parvalbumine-positieve interneuronen in de hippocampus te karakteriseren. Dit wordt bereikt door eerst hoogwaardige acute hippocampussneden te produceren. De tweede stap is om een videomicroscoop te gebruiken om neuronen te selecteren op basis van veneuze YFP-expressie en bekende kenmerken van paralbumine-positieve neuronen.
Vervolgens worden hele-cel patch clamp-opnamen verkregen en wordt ofwel extracellulaire stimulatie of gepaarde opnamen gebruikt om GABA B-receptorgemedieerde effecten te onderzoeken. De laatste stap is om de neuronen te visualiseren en te bevestigen dat de opgenomen neuronen in feite paralbumine-positief zijn en ofwel parasomatisch of dendritisch remmende neuronen zijn. Uiteindelijk stelt deze methode de karakterisering van GABA B-receptorgemedieerde remmende effecten mogelijk en biedt een ondubbelzinnige classificatie van de opgenomen interneuronen.
Deze methode kan sleutelvragen in het interneuronveld beantwoorden. Bijvoorbeeld, hoe interneuronen met elkaar communiceren, hoe hun prikkelbaarheid, hun synaptische output wordt geregeld door neuromodulerende systemen. Hoewel deze methode inzicht geeft in GABAerge controle van hippocampale interneuronen, kan deze ook worden toegepast op andere hersengebieden, neuromodulerende systemen of celtypen.
Haal de hersenen uit een 17 tot 24 dagen oude transgene rat die fluorescent veneus YFP tot expressie brengt, bewaard in semi-bevroren carbogen-suikeroplossing, A CSF met behulp van een scalpel, verwijder het frontale derde van de cortex, het cerebellum en scheid de hemisferen. Verwijder het dorsale oppervlak van de cortex om een vlak oppervlak te bieden om de hersenen te lijmen voor het doorsnijden. Lijm de hemisferen op de viome-standaard met de viome-bad gevuld met rozen carbogen-native suikeroplossing.
A CSF snijd 300 micrometer transversale plakjes van de hippocampusformatie. Breng elke plak over naar een ondergedompelde houderkamer met carbogen-suikeroplossing, A CSF bij 35 graden Celsius. 30 minuten Na het plaatsen van de laatste plak in de verwarmde suikeroplossing, A CSF breng de plakjes over naar kamertemperatuur voor opslag.
Trek patch pipetten uit glascapillairen zodat een pijpweerstand van twee tot vier mega ohm wordt bereikt. Wanneer gevuld, breng een hippocampussnede over naar de opnamekamer, houd deze op zijn plaats met een platina ring met enkele vezels van zijde. Plaats de kamer in de opname-instelling en begin met perfusie met carbogen-verwarmde opname A CSF met een stroomsnelheid van vijf tot tien milliliter per minuut.
Gebruik een videocamera om de kwaliteit van de plak onder I-R-D-I-C-optiek bij 40 x objectiefvergroting te beoordelen. Ga ervan uit dat de plak van goede kwaliteit is. Als een groot aantal ronde matig gecontrasteerde ca een parametaal cellen kan worden gezien in het stratum parameter op diepten van 20 tot 30 micrometer onder een glad en licht gekarteld oppervlak.
Gebruik epifluorescente verlichting om putatieve snelle spiekende interneuronen te identificeren als diegene die veneus YFP tot expressie brengen met grote multipolaire somatische in of nabij het stratum parama. Doe vervolgens, vul de patch pipetten met een oplossing die een lage en fysiologisch relevante chlorideconcentratie bevat voor identificatie van postsynaptische stromen en plaats deze in de pijphouder op de hoofdtrap. Breng vervolgens een lage positieve druk aan via de buislijn.
Laat de pijp naar het oppervlak van de plak zakken, iets uitgelijnd ten opzichte van het centrum van het geselecteerde neuron. Verhoog de druk tot 70 tot 80 millibar en laat de pijp snel door de plak zakken tot net boven het soma van de geselecteerde cel. Druk de pijp tegen het celmembraan om een kuiltje te produceren.
Voer deze stap snel uit. Om biotinylering van naburige cellen te voorkomen, creëer een giga-ohmverbinding door de druk vrij te geven en tegelijkertijd een negatieve 20 millivolt voltage commando naar de pijp toe te passen. Zodra het afsluiten begint, verlaag de voltagecommando tot het verwachte rustmembraanpotentiaal, typisch tussen negatieve 70 en negatieve 60 millivolt.
Breng nu een korte puls van negatieve druk aan om het membraanpatch te scheuren, waardoor de hele-celconfiguratie wordt bereikt. Gebruik de stroomklemmodus om snelle spiekende interneuronen te identificeren aan de hand van hun reactie op een reeks hyperpolariserende tot depolariserende stroompulsen. Om synaptisch geïnduceerde reacties waar te nemen, plaats een extracellulaire stimulatie-elektrode in de plak aan de rand van het stratum radium en stratum laun oum moleculair opname.
In spanningskleminstelling, gebruik een geïsoleerde constante spanning stimulator om elke 20 seconden een of 200 hertz treinen van vijf 50 volt elektrische stimuli te leveren aan de presynaptische axonen. Breng vervolgens ionotropische glutamaatreceptorantagonisten naar het bad toe om de geïsoleerde monos te onthullen. Synaptische IPSC.
Isoleer verder de GABA B-receptorgemedieerde IPSC met toepassing van een GABA a-receptorantagonist. Om gepaarde opnamen te beginnen. Eerst, stel een hele-celopname van een presynaptisch interneuron vast zoals eerder en bevestig het snelle spiekende fenotype.
Patch vervolgens een CA een parametaal cel binnen een afstand van 20 tot 100 micrometer van het interneuron dat het presynaptische interneuron vasthoudt. In stroomklemmodus. Breng korte SRA-drempel depolariserende stroompulsen aan om actiepotentialen in het interneuron te veroorzaken.
Als er een synaptische verbinding aanwezig is, resulteren actiepotentialen in het interneuron in IPC's in de spanningsklemmige ca een parametaal cel. Eenmaal een verbinding is vastgesteld, roep paar actiepotentialen op in het presynaptische snelle spiekende interneuron met een typisch gepaard pulsprotocol van twee depolariserende stimuli met een interval van 50 milliseconden. Na het verzamelen van de controle-traces, breng de selectieve GABA B-receptoragonist baclofen aan op de perfusie A CSF, waardoor GABA B-receptoren worden geactiveerd.
Breng vervolgens de antagonist CGP 55 8 45 aan om de receptorgemedieerde effecten volledig te blokkeren. Zodra de op
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op de karakterisering van GABA B receptor-gemedieerde effecten in geïdentificeerde hippocampale parvalbumine-positieve interneuronen. De methode omvat acute hippocampale slices van hoge kwaliteit, gerichte neuronselectie en whole-cell patch clamp-opnamen om remmende effecten te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Cellulaire biologie
Achtergrond
- Remmende interneuronen spelen een cruciale rol in corticale netwerken.
- Parvalbumine-positieve interneuronen zijn belangrijk voor het begrijpen van remmende controle.
- GABA B receptoren zijn belangrijk bij het mediëren van remmende neurotransmissie.
- Gegevensverzameling en identificatie van interneuronen zijn essentieel voor functionele studies.
Doel van de studie
- Karakteriseren van GABA B receptor-gemedieerde effecten in hippocampale interneuronen.
- Bevestigen van de identiteit van opgenomen neuronen als parvalbumine-positief.
- Onderscheid maken tussen verschillende soorten remmende neuronen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van acute hippocampale slices.
- Selectie van neuronen met behulp van videomicroscopie op basis van YFP-expressie.
- Whole-cell patch clamp-opnamen van geselecteerde neuronen.
- Post-hoc morfologische en immunocytochemische analyse om de neuronidentiteit te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle karakterisering van GABA B receptor-gemedieerde effecten.
- Identificatie van parvalbumine-positieve interneuronen als perisomatisch of dendritisch.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het bestuderen van remmende circuits.
- Duidelijke classificatie van opgenomen interneuronen op basis van morfologische criteria.
Conclusies
- De gecombineerde benadering maakt een nauwkeurig onderzoek van de interneuronfunctie mogelijk.
- Begrip van GABA B receptor-effecten vergroot de kennis van remmende mechanismen.
- Deze methodologie kan worden toegepast op andere soorten interneuronen voor bredere inzichten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Characterizing GABA B receptor-mediated inhibition in defined interneuron populations supports target validation in CNS drug discovery by linking molecular mechanisms to circuit-level function. This approach enables mechanistic de-risking of GABAergic modulators through direct measurement of synaptic effects in genetically identified cell types. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from disease-relevant neuronal systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of GABA B receptor function in parvalbumin-positive interneurons to validate target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for isolating and recording from genetically defined interneuron subtypes using fluorescent markers.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by confirming neuron identity through post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.
- Operational Value: Facilitates paired recording configurations to assess synaptic connectivity and inhibitory transmission in hippocampal circuits.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative measurements of GABA B receptor-mediated IPSCs to enable dose-response analysis of agonists and antagonists.
- Operational Value: Establishes a reproducible assay platform with defined stimulation protocols and pharmacological isolation steps for compound screening.
- Scientific Value: Allows isolation of monosynaptic IPSCs through ionotropic glutamate receptor blockade to assess direct interneuron-to-neuron signaling.
- Operational Value: Supports scalability through acute slice preparation and standardized perfusion conditions for multi-day electrophysiological studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links hippocampal interneuron function to disease-relevant circuit dynamics in models of epilepsy, anxiety, and cognitive disorders.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of GABAergic modulation across developmental stages using transgenic rodent models.
- Scientific Value: Supports biomarker alignment by correlating electrophysiological phenotypes with morphological and neurochemical identification.
- Operational Value: Provides a platform for evaluating target selectivity and off-target effects of GABAergic compounds in native tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing mechanistic insights into GABAergic modulation in defined neuronal populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of GABA B receptor role in inhibitory control of hippocampal interneuron excitability and synaptic output.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized whole-cell patch clamp recordings with quantifiable IPSC amplitudes and kinetics.
- Analytics: Enables comparative analysis of synaptic responses under control, agonist, and antagonist conditions to assess compound efficacy and potency.
- Translational Research: Connects electrophysiological findings to morphological validation for enhanced target-to-pipeline continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform adaptable to other interneuron types and brain regions via promoter-driven fluorescent labeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking GABA B receptor modulation to measurable inhibitory effects in identified interneurons.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized slice preparation, fluorescent neuron targeting, and post-hoc confirmation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement in native neuronal circuits.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of GABAergic modulators based on functional validation in disease-relevant interneuron populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, fluorescent microscopy, and histological processing for neuron identification.
- Dependent on transgenic animal models expressing fluorescent markers under interneuron-specific promoters.
- Necessitates vibration-dampened recording chambers and perfusion systems for stable whole-cell recordings.
- Involves optimization of pipette resistance and sealing parameters for reliable gigaohm formation in acute slices.
- Limited by slice viability duration, requiring timely experimentation post-dissection for optimal recording quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
1:46
Preparation of Acute-hippocampal Slices
0:05
Title
3:00
Whole Cell Patch-clamp Recording from Fast-spiking Interneurons
5:58
Extracellular Electrical Stimulation to Evoke GABAB Receptor-mediated Responses
6:56
Paired Recordings of Synaptically Coupled Fast-spiking INs and CA1 PCs
8:42
Visualization and Immunocytochemistry of Fast-spiking Interneurons
11:30
Results: GABAB Receptor-mediated Currents and Presynapitc Inhibition in Identified Hippocampal Parvalbumin Interneurons
13:59
Conclusion
