Name: Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Leer hoe elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide-coating wordt gebruikt voor het onderzoek naar gap junctionale communicatie. Deze methode maakt analyse van intercellulaire verbindingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Lowell Cochran voor deskundige video-assistentie. De financiële steun van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), de Canadian Breast Cancer Research Alliance, de Ontario Centers of Excellence, de Breast Cancer Action Kingston en het Clare Nelson beursfonds door middel van subsidies aan LR wordt dankbaar erkend. SG was de ontvanger van een NSERC-beurs. MG werd ondersteund door een postdoctorale beurs van het US Army Breast Cancer Program, het Ministerie van Onderzoek en Innovatie van de provincie Ontario en het Adviesonderzoekscomité van Queen’s University.

1 Plating de cellen in de Electroporatie Chambers <ol><li> In een laminaire stroming kap, trypsinize de cellen met behulp van steriele techniek gebruikelijk. Opmerking: Het is belangrijk te elimineren door centrifugeren alle sporen van trypsine, deze kunnen belemmeren spreiding van de cellen op het glas, waardoor de vorming van adherens en gap junctions. </li><li> Pipetteer 1 ml van de celsuspensie in de steriele elektroporatie kamers voorzien van de in situ electroporator (figuur 1), en in een 37 ° C, CO2 incubator. OPMERKING: Cel adhesie kunnen worden verbeterd door uitplaten op fibronectine, collageen, poly-lysine of cellen en weefsel lijm (zie Materialen tabel). </li><li> Wanneer de cellen een confluente laag gevormd zijn, klaar voor GJIC onderzoek. </li></ol> 2 elektroporatieprocedure Elektroporatie voor GJIC onderzoek kan worden uitgevoerd buiten een laminaire stroming kap,want het duurt slechts een paar minuten. Indien langere incubatietijden vereist voor een bepaald experiment, dan kan geheel worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. In alle gevallen moet de kamers waarin de cellen worden gekweekt steriel zijn. <ol><li> Bereid een 5 mg / ml Lucifer gele oplossing: Los 10 mg poeder LY (voorzien van de electroporator) in 2 ml-Calcium gratis groeimedium. Voor experimenten die langere incubatietijd nodig, filter-steriliseren van de oplossing en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Zuig het groeimedium en was de cellen met calcium vrij medium, en let niet te krassen op de monolaag of drogen de cellen. Als de cellen worden gedroogd ze hebben meestal donkerder kernen en pick-up LY zonder elektroporatie. Het effect is meer uitgesproken in het midden van de schuif die meer is blootgesteld aan luchtstromen (Figuur 4F). </li><li> Met een Eppendorf pipet, pipet de kleurstofoplossing aan de cellen (400 ul voor de gehele kamer), aan de rand van de kamer, bAanspreekbaar voorzichtig dat u de cellaag raken. </li><li> Plaats de kamer in de met de electroporator meegeleverde houder en een puls van de juiste sterkte (zie Discussie) van toepassing. </li><li> Zuig voorzichtig enkele LY oplossing. Het kan worden hergebruikt nogmaals minder belangrijke experimenten. </li><li> Add-Calcium DMEM dat 10% gedialyseerd serum. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 3-5 min in de incubator kleurstofoverdracht via gap juncties laten. OPMERKING: De opname van gedialyseerd serum op dit moment helpt de poriën sluiten. </li><li> Was het niet opgenomen kleurstof met Calcium DMEM voor live cell observatie. Alternatief kunnen cellen worden vastgesteld in dit stadium, door toevoeging van 4% formaldehyde aan het goed, dan gewassen met PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing). In alle gevallen moet het wassen alle achtergrond te verwijderen. Opmerking: In preliminaire experimenten om de optimale omstandigheden te bepalen, of de spanning te laag is, dan is het mogelijk om de cellen te laten herstellen de incubator voor een paar minuten en electroporate dezelfde dia een tweede keer, om te besparen op de kosten van de dia&#39;s. </li></ol> 3 microscopisch onderzoek <ol><li> Let op de cellen onder fluorescentieverlichting, met een omgekeerde microscoop uitgerust met de geschikte filter voor de kleurstof wordt gebruikt. Voor Lucifer geel, excitatie is 423nm, 555nm emissie, WBV-filter voor een Nikon IX70 microscoop. </li><li> Elimineer meniscus effecten door een glazen deksel-slip bovenop de plastic goed, na het vullen aan de top met vloeistof, zodat celmorfologie onder fasecontrast onderzoeken. Voor betere beelden, kan het goed worden losgemaakt van de glijbaan en het dekglaasje geplaatst op het frame. Voor vaste cellen, kan de put gevuld met glycerol voor microscopische waarneming, terwijl levende cellen moet worden gevuld met groeimedium. OPMERKING: Wassen en fotograferen is gemakkelijker als de cellen gefixeerd met formaldehyde na de overdracht van de kleurstof (stap 2.7). Als de cellen niett vastgesteld fluorescentie wordt uit de cellen in ongeveer 60 minuten, afhankelijk van het celtype, spanning en hoeveelheid LY geïntroduceerd terwijl gefixeerde cellen fluorescentie wordt gehandhaafd gedurende verscheidene uren. Echter, fluorescentie vervaagt of verdwijnt na O / N incubatie, zelfs in gefixeerde cellen. Daarom, foto&#39;s moeten worden snel na elektroporatie (figuur 2) genomen. </li></ol> 4 Kwantificering van intercellulaire communicatie <ol><li> &#39;s De cellen met een 20x objectief onder fluorescentie en fasecontrast (figuur 3). </li><li> Identificeren en markeren met een ster de geëlektroporeerde cellen op de grens met de niet-geëlektroporeerde gebied (figuur 2, pijl, elektroporatie rand). </li><li> Identificeren en markeren met een stip fluorescerende cellen bij de niet-geëlektroporeerde kant, waar de kleurstof overgedragen via gap junctions (Figuren 3A en 3B). </li><li> Verdeel het totaal aantalfluorescerende cellen op de niet geëlektroporeerd gebied door het aantal geëlektroporeerde cellen langs de rand (figuren 3A en 3B). Opmerking: De transfer van ten minste 200 aaneengesloten geëlektroporeerde cellen rand wordt berekend voor elk experiment. Het aantal verkregen is de GJIC waarde. </li></ol>

<ol><li>Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaptis%2C+L+%22Electroporation+protocols%22">Electroporation protocols</a>. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).</li>
<li>Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+phosphotyrosine-binding+domain+inhibitors+on+insulin+receptor+signalling+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking.</a> Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).</li>
<li>Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epithelial+tubules+by+growth+factor+HGF+depends+on+the+STAT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway.</a> Nature. 391, 285-288 (1998).</li>
<li>Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+signal+transducers+from+oncogenic+MET+mutants+abrogates+cell+transformation+and+inhibits+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).</li>
<li>Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ets+up-regulates+met+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ets up-regulates met transcription.</a> Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+affecting+Stat3+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques affecting Stat3 activity levels.</a> Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).</li>
<li>Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+human+T+cell+anergy%3A+blocking+of+IL-2+gene+transcription+by+activated+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1.</a> Science. 278 (5335), 124-128 (1997).</li>
<li>Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+Ras+activation%3B+electroporation+of+%5Balpha-32%5DGTP%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP.</a> DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).</li>
<li>Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+compounds+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells.</a> DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides%3A+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+A+Laboratory+Handbook%2C+Celis%2C+Ed%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li>
<li>Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+crk+II+in+actin+cytoskeleton+organization+and+mitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis.</a> J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).</li>
<li>Raptis, L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+adherent+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of adherent cells in situ.</a> DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).</li>
<li>Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+tethered+enzyme+improves+efficiency+in+gene-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy.</a> Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).</li>
<li>Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+regulation+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+the+SRC+oncogene+product+and+its+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors.</a> Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).</li>
<li>Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer%3A+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+intercellular%2C+junctional+communication%3B+electroporation+of+adherent+cells+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide.</a> DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).</li>
<li>Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+in+situ+electroporation+on+two+co-planar+indium-tin+oxide+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes.</a> Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+assay+for+intercellular%2C+junctional+communication+in+cultured+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells.</a> Lab Invest. 78, 639-640 (1998).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+communication+in+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gap junctional communication in lung carcinoma cells.</a> Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).</li>
<li>Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+activity+is+required+for+gap+junctional+permeability+in+normal+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts.</a> DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+a+positive+regulator+of+gap+junctional+intercellular+communication+in+cultured%2C+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 12, 605(2012).</li>
<li>Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+is+involved+in+gap+junction+closure+in+mouse+fibroblasts+or+preadipocytes+but+not+in+differentiated+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes.</a> DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).</li>
<li>Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+of+gap+junction+channels+to+probes+of+different+size+is+dependent+on+connexin+composition+and+permeant-pore+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities.</a> Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+Adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res+7%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).</li>
<li>Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+growth+factor-stimulated+mitogenesis+by+a+cell-permeable+Grb2-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide.</a> J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+Growth+Factor-stimulated+ERK1%2F2+activation+in+intact+cells+by+electroporation+of+a+Grb2-SH2+binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide.</a> Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).</li>
<li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+molecular+permeability+of+connexin+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assaying the molecular permeability of connexin channels.</a> Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).</li>
<li>Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gap+junctional+intercellular+communication+based+on+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).</li>
<li>Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+phenotype+and+expression+of+polyomavirus+middle+T+antigen+in+rat+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).</li>
<li>Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+membrane-associated+protein+kinase+C+activity+correlates+to+tumorigenicity+but+not+anchorage-independence+in+a+clone+of+mouse+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells.</a> Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).</li>
<li>Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+required+for+full+neoplastic+transformation+by+the+Simian+Virus+40+Large+Tumor+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen.</a> Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).</li>
</ol>

De corresponderende auteur is de uitvinder in een patent dat wordt beheerd door Queen’s University en dat is gelicentieerd aan Cell Projects Inc. Het bedrijf of de universiteit had geen invloed op de inhoud van het artikel.

Kritische stappen in het protocol Geëlektroporeerde materiaal De zuiverheid van het materiaal dat moet worden geëlektroporeerd is heel belangrijk. Als de cellen zeer vlak, moet dan hogere concentraties van de tracking kleurstof worden (tot 20 mg / ml voor LY) en in dergelijke gevallen zuiverheid nog belangrijker dan in cellen met een bolvorm 1. Naast LY een grote verscheidenheid aan andere kleurstoffen of nonpermeant moleculen zijn gebruikt, zoals een reeks v...

De toepassing van elektrische stroom aan een cel leidt tot de vorming van poriën in het celmembraan, een werkwijze genoemd elektroporatie. De poriën laten de passage van verschillende nonpermeant moleculen door het membraan. Het elektrische veld kan nauwkeurig worden geregeld, zodat de poriën gevormd zijn erg klein en hersluiten snel, met minimale verstoring van de cellulaire fysiologie. Interessant is dat hechtende cellen worden gekweekt op een glasplaatje gecoat met geleidend en transparant indium-tin oxide (ITO) en geëlektroporeerd in situ, dat op het oppervlak waar ze groeien, zonder los te geëlektroporeerd in suspensie. Cellen kunnen goed groeien op dit oppervlak, en als deze zijn bevestigd en uitgebreid, gedetailleerde microscopische waarneming mogelijk. Met deze techniek kunnen kleine nonpermeant moleculen direct worden ingevoerd en in wezen 100% van de cellen, dat deze techniek bijzonder geschikt voor studies op de activatie van beeld metonents van een traject na ligand stimulatie van een receptor (beoordeeld in 1). Elektroporatie wordt meestal gebruikt voor de introductie van DNA (ook wel electrotransfection). Echter, elektroporatie in situ waardevol voor de invoering van een grote verscheidenheid van moleculen, zoals peptiden 2-4, oligonucleotiden zoals antisense RNA, dubbelstrengs DNA decoy-oligonucleotiden kunnen remmen transcriptiefactor binding of siRNA 3,5, 6, radioactieve nucleotiden 7-10, eiwitten 11 12 of pro-drugs 13. Na elektroporatie, kunnen cellen worden gelyseerd voor biochemische analyses en gefixeerd en gekleurd met antilichamen. De geleidende ITO coating is zeer dun, 800-1,000Å, waardoor celgroei niet wordt verstoord door het hoogteverschil van de twee oppervlakken, als de cellen groeien over de rand van de geleidende coating. Dit biedt het voordeel dat niet-electroporated cellen kunnen worden gekweekt zij aan zij met geëlectroporeerd degenen, om te dienen als controle. Dezelfde benadering kan worden gebruikt voor het onderzoek van spleetovergangen, intercellulaire communicatie (GJIC), zoals beschreven in de Video. Gapjuncties zijn kanalen verbinden het interieur van aangrenzende cellen 14. Spleetovergangen, intercellulaire communicatie speelt een belangrijke rol in tumorvorming en metastase, terwijl oncogenen zoals Src onderdrukken GJIC 15,16. Om GJIC onderzoeken van een fluorescente kleurstof zoals Lucifer geel (LY) wordt vaak geïntroduceerd in gekweekte cellen door micro-injectie of schrapen laden 17 en de diffusie van de kleurstof in naburige cellen microscopisch waargenomen onder fluorescentieverlichting. Deze technieken echter steeds celbeschadiging veroorzaken. We beschrijven nu een techniek waarbij cellen worden gekweekt op een glasplaatje dat gedeeltelijk bedekt met ITO 18. Een elektrische puls wordt toegepast in aanwezigheid van LY (of andere kleurstoffen) camet de penetratie in de cellen groeien op het geleidende deel van de schuif, terwijl kleurstofmigratie van de aangrenzende, niet-geëlektroporeerde cellen microscopisch waargenomen door fluorescentieverlichting. Om storende gevoelige cellen die de neiging hebben los te maken van de monolaag te voorkomen, een samenstel is gemaakt dat geen elektrode nodig was om bovenop de cellen voor toepassing van de elektrische stroom 19 worden geplaatst. Deze benadering biedt de mogelijkheid om GJIC kwantificeren in een groot aantal cellen, zonder meetbare verstoring van cellulair metabolisme, zoals aangegeven door de afwezigheid van een effect op de lengte van de G1 fase na stimulatie serum 12, verhoging in de niveaus van de fos protooncogen eiwit (Raptis, ongepubliceerd) of twee kinasen geassocieerd met cellulaire stress, de p38 varken of JNK / SAPK kinase 1. Deze aanpak kan het onderzoek van het verband tussen de niveaus van oncogene expressie, transformatie en GJ gemaaktIC 18, en het effect van Src en Stat3 op GJIC in verschillende celtypen, waaronder vers gekweekte cellen van long tumor specimens 20-23. Bovendien, in situ elektroporatie met de instellingen beschreven die een bovenste elektrode is met succes toegepast voor het aantonen van gap junction sluiting tijdens adipocytic differentiatie mist, hoewel cellulaire hechting aan het substraat wordt verkleind dat stadium 19,24.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM zonder Calcium</td><td>Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>Donor Calf Serum&nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td><td>Cat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td><td>Cat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Electroporatieapparaat</td><td>Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/</td><td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Kammers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-04-CC</td><td>4-wells</td></tr><tr><td>Kammers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-08-CC</td><td>8-wells</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-25-LY</td><td>Hoge zuiverheid</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>Cel en weefselkleefstof</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collageen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

een functionele test voor gap junctionele onderzoek; elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

Bij deze techniek worden cellen gekweekt op een glasplaat die gedeeltelijk bedekt is met indium-tinoxide (ITO), een transparant, elektrisch geleidend materiaal. Een verscheidenheid aan moleculen, zoals peptiden of oligonucleotiden, kan op een niet-traumatische manier in wezen 100% van de cellen worden geïntroduceerd.  Hier beschrijven we hoe het kan worden gebruikt om intercellulaire, gap junctionele communicatie te bestuderen. Lucifer geel dringt de cellen binnen wanneer een elektrische puls, toegepast op het geleidende oppervlak waarop ze groeien, ervoor zorgt dat er poriën door het celmembraan worden gevormd. Dit is elektroporatie. Cellen die groeien op het niet-geleidende glasoppervlak onmiddellijk naast het geëlektropoteerde gebied nemen Lucifer geel niet op door elektroporatie, maar verwerven de fluorescerende kleurstof als deze wordt doorgegeven via gap junctions die hen verbinden met de geëlektropoteerde cellen. De resultaten van de overdracht van kleurstof van cel naar cel kunnen onder microscopisch zichtbaar worden waargenomen bij fluorescentie-verlichting. Deze techniek maakt een nauwkeurige kwantificering van gap junctionele communicatie mogelijk. Bovendien kan het worden gebruikt voor de introductie van peptiden of andere niet-doorlaatbare moleculen, en de overdracht van kleine geëlektropoteerde peptiden via gap junctions om het signaal in de aangrenzende, niet-geëlektropoteerde cellen te remmen, is een krachtige demonstratie van signaalremming.

Figuur 2 toont rattenleverepitheliale T51B cellen 22 geëlektroporeerde LY en gefotografeerd onder fluorescentie (paneel A en B), of fase-contrast (C) belichting, na fixatie en wassen. In paneel A, wordt de rand van de geëlectroporeerd gebied gemarkeerd in het rood. De helling van fluorescentie aan de rechterkant van de rode lijn geeft de overdracht via gap junctions. In figuur 3A en 3B, is de kwantificering van gap junctions communicatie getoond: De cellen aa...

Deze presentatie demonstreert een methode waarbij elektroporatie van adherante, gekweekte cellen wordt gebruikt voor het bestuderen van intercellulaire, junctionele communicatie, terwijl de cellen groeien op een plaatje dat bedekt is met geleidend en transparant indium-tinoxide.

Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Elektroporatie is een techniek waarbij een elektrische stroom wordt aangelegd over levende cellen om tijdelijke poriën in het celmembraan te openen. Via deze poriën kunnen kleurstoffen en andere moleculen die normaal gesproken het celmembraan niet passeren de cel binnendringen; de poriën sluiten snel weer zonder de cel te beschadigen. We zullen beschrijven hoe hechtende cellen geëlektroporeerd kunnen worden terwijl ze groeien op een objectglas dat gedeeltelijk is gecoat met elektrisch geleidend en transparant materiaal.Het materiaal is indiumtinoxide en aangezien dit elektrische stroom geleidt, opent het poriën waardoor een kleurstof de cel kan binnendringen. Vervolgens is het mogelijk om te onderzoeken of de cellen gap junctions hebben of niet, en hoeveel gap junctions er zijn; dit zijn kleine kanalen die de binnenkant van naburige cellen met elkaar verbinden en de passage van kleine moleculen mogelijk maken. Het is al lang bekend dat communicatie via gap junctions diverse belangrijke functies in de cel heeft, waaronder neoplastische transformatie en metastase.Welkom bij deze presentatie over celprojecten over het uitvoeren van elektroporatie van adherente cellen met behulp van de

a-functional-assay-for-gap-junctional-examination-electroporation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

We beschrijven hier hoe je een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen, en een aantal nuttige tips. We verwachten dat dit artikel iedereen zal helpen om de mate van cellulaire koppeling te evalueren door functionele gap junctions. Alles hier beschreven kan zijn, in principe, aangepast aan andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder 1000 Dalton.

Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Hier presenteren we een protocol voor een roman gap junction intercellulaire communicatie assay ontworpen voor de high-throughput screening van gap junction-modulerende chemicaliën voor drugontdekking en toxicologische beoordeling.

Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay

Darmepitheel verleent niet alleen opname van voedingsstoffen, maar ook bescherming tegen schadelijke stoffen. De apicale meest epitheliale intercellulaire junctie, d.w.z. de tight junction, reguleert paracellulaire opgeloste stof en ionenpermeabiliteit. Hier wordt een protocol beschreven voor de bereiding van mucosale vellen en beoordeling van de ionenselectiviteit van tight junctions met behulp van Ussing-kamertechniek.

Functionele beoordeling van intestinale tight junction barrier en ionendoorlaatbaarheid in inheems weefsel door Ussing Chamber Technique

Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.

Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Poreuze substraatelektroporatie (PSEP) combineert een consistente, hoge doorvoer met een hoge cellevensvatbaarheid. De introductie van transepitheliale elektrische impedantiemetingen (TEEI) geeft inzicht in de intermediaire processen van PSEP en maakt labelvrije levering mogelijk. In dit artikel wordt een methode besproken voor het gelijktijdig uitvoeren van PSEP-afgifte-experimenten en TEEI-meetanalyse.

Poreuze elektroporatie op basis van substraat met transepitheliale elektrische impedantiebewaking

Leer hoe elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide-coating wordt gebruikt voor het onderzoek naar gap junctionale communicatie. Deze methode maakt analyse van intercellulaire verbindingen mogelijk.

Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

Meer video's verkennen