Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

Elektroporatie is een techniek waarbij een elektrische stroom wordt aangelegd over levende cellen om tijdelijke poriën in het celmembraan te openen. Via deze poriën kunnen kleurstoffen en andere moleculen die normaal gesproken het celmembraan niet passeren de cel binnendringen; de poriën sluiten snel weer zonder de cel te beschadigen. We zullen beschrijven hoe hechtende cellen geëlektroporeerd kunnen worden terwijl ze groeien op een objectglas dat gedeeltelijk is gecoat met elektrisch geleidend en transparant materiaal.

Het materiaal is indiumtinoxide en aangezien dit elektrische stroom geleidt, opent het poriën waardoor een kleurstof de cel kan binnendringen. Vervolgens is het mogelijk om te onderzoeken of de cellen gap junctions hebben of niet, en hoeveel gap junctions er zijn; dit zijn kleine kanalen die de binnenkant van naburige cellen met elkaar verbinden en de passage van kleine moleculen mogelijk maken. Het is al lang bekend dat communicatie via gap junctions diverse belangrijke functies in de cel heeft, waaronder neoplastische transformatie en metastase.

Welkom bij deze presentatie over celprojecten over het uitvoeren van elektroporatie van adherente cellen met behulp van de Insitu. Deze afbeelding laat zien wat we kunnen bereiken: de fluorescente gele kleurstof is geïntroduceerd in cellen die groeien op een transparant en geleidend glas. Tot aan deze lijn, waarbij de lijn gemakkelijker te zien is onder fasecontrast.

Hier is het resultaat. Men kan zien dat de kleurstof via gap junctions is gediffundeerd van de cellen aan de linkerkant, die via elektroporatie met kleurstof zijn geladen, naar de cellen aan de rechterkant. Dit resulteert in deze gradiënt van fluorescentie in de cellen.

Geïnitialiseerd en vervolgens overgebracht naar een centrifugebuis. Het is zeer belangrijk dat de cellen goed verspreid zijn terwijl ze in de kamer groeien. Om deze reden is het raadzaam de cellen te centrifugeren om alle sporen van trypsine te verwijderen.

Het medium met sporen van trypsine wordt afgezogen, de cellen worden geresuspendeerd in ongeveer één milliliter kweekmedium en vervolgens in de kamer geplaatst. De pipet bevat de celsuspensie; verwijder het deksel van de kamer en pipetteer de cellen druppelsgewijs in de kamer om het transport te vergemakkelijken. De kamer wordt in een Petri-schaal van zes centimeter geplaatst.

De kamer gaat terug in de incubator zodat de cellen kunnen groeien. De uitgeplaatte cellen zullen zich goed verspreiden en groeien tot ze elkaar raken en gap junctions vormen. Wanneer de cellen klaar zijn voor elektroporatie, stelt u de in situ pulsgenerator in op de gewenste condities.

Raadpleeg de handleiding voor een beschrijving van het eenvoudige installatieproces. Wanneer de spanning op de insitu is ingesteld, gaat het rode lampje op het toetsenbord branden. Haal de twee verwarmde flesjes DMEM zonder calcium uit het waterbad; één is DMEM zonder calcium maar met gedialyseerd serum, en één is DMEM.

Zonder calcium, zorg dat de pipetten klaarstaan en vul de pipeteerder met de gele oplossing. Haal de cellen uit de incubator. Verwijder het medium door deze eerst om te keren in het wasbekertje.

Dep het weefsel vervolgens één keer af met DMEM zonder calcium; probeer niet al het DMEM volledig te verwijderen, omdat de cellen kunnen uitdrogen. Voeg de Lucifer yellow voorzichtig toe aan de barrière, zodat de cellen niet worden verstoord, maar doe dit snel genoeg om uitdroging van de cellen te voorkomen. Gebruik 200 µL voor elk halve deel van de kamer.

Plaats het deksel op de insitu-kamer en schuif deze vervolgens in de slider. Zorg ervoor dat de uiteinden van de kamer in de sleuven van de slider passen door tegen de slider te duwen. Plaats de kamer in de kamerhouder.

Druk op de pulsknop op het toetsenbord van de pulsgenerator. De LED op de pulsgenerator en op de kamerhouder knippert rood tijdens het elektroporatieproces en knippert vervolgens groen om aan te geven dat de initiële cyclus is voltooid. Trek de schuif terug onder de kamerhouder en verwijder de kamer.

Zuig het grootste deel van het Lucifergeel af om het opnieuw te gebruiken, maar let erop dat de cellen niet uitdrogen. Voeg DMEM zonder calcium toe. Met gedialyseerd serum helpt het serum de poriën te sluiten; de kamer gaat terug in de incubator zodat de overdracht van Lucifergeel via gap junctions kan plaatsvinden.

De timing moet consistent zijn tussen de experimenten onderling. De standaard is drie minuten. Giet het medium af in het afvalbekerglas.

Voeg met een pasta of pipet 4% formaldehydefixeeroplossing toe en wacht minstens twee minuten bij kamertemperatuur. Giet het formaldehyde af en spoel een paar keer na met PBS; de cellen zijn nu aan het glas gefixeerd, waardoor er weinig risico is dat ze tijdens het wassen loslaten.

Om de cellen onder fasecontrast te kunnen zien, is het belangrijk om een dekglas op de kamer te plaatsen. Vul de kamer met PBS zodat er een bolle meniscus ontstaat. Plaats het dekglas zonder luchtbellen te introduceren.

Maak u geen zorgen als de PBS overloopt; absorbeer het overtollige PBS simpelweg met een tissue. U heeft een omgekeerde fluorescentiemicroscoop nodig, bij voorkeur met fasecontrast en met een filterblok voor Lucifer yellow. Zoek onder fasecontrast naar de rand van het geëlectroporeerde gebied.

U zult twee lijnen zien onder fluorescentiecellen. Op de helft van het preparaat zullen de cellen intens fluoresceren. De lijn die het dichtst bij de gloeiende cellen ligt, is de rand van het geëlectroporeerde gebied.

Elke fluorescentie daarbuiten is te wijten aan de overdracht van lucifergeel via gap junctions. Bijvoorbeeld, deze afbeelding van epitheelcellen toont cellen die aan de linkerkant van de afbeelding zijn geëlectroporeerd, waarbij lucifergeel wordt overgedragen naar naburige niet-geëlectroporeerde cellen, wat een gradiënt van lichtgevende cellen creëert van de rand van de geleidende coating naar rechts. Deze afbeelding toont hetzelfde frame van cellen onder fasecontrast.

Let op dat de X-lijn zeer duidelijk zichtbaar is. Een kwantitatieve maatstaf voor de mate van gap junction-overdracht kan handmatig worden bepaald door te werken met de fluorescentie- en fasecontrastbeelden van de geëlectroporeerde cellen. De sterren langs de rand van het geleidende gebied worden beschouwd als donorcellen.

Ze zijn geëlektroporeerd en hebben losse moleculen voor geel opgenomen. Ze geven luc voor geel door aan naburige cellen aan de rechterkant, die het vervolgens weer doorgeven. Dit gaat nog verder in afnemende hoeveelheden.

De verhouding tussen de stippen en sterren (41 op 8 in dit geval) kan een getal opleveren om te vergelijken hoe uitgebreid de overdracht via gap junctions in deze casus is. 5,1 is de gap junction-index. Een alternatief voor het handmatig markeren en tellen van cellen is het gebruik van beeldanalyse-software om de relatieve hoeveelheden fluorescentie te meten langs de niet-geëlectroporeerde zijde van een electroporeerde celrand.

Deze cellen hebben geen gap junctions. Hier is de rechterrand van het geëlektroporeerde gebied. Let op dat er geen fluorescentiegradiënt aanwezig is, wat duidt op de afwezigheid van gap junctions onder fasecontrast.

Alle cellen zijn duidelijk zichtbaar. Let op dat de X-lijn in dit voorbeeld ook duidelijk zichtbaar is.

Alle cellen in de kamer werden gestimuleerd met epidermale groeifactor EGF en 10 minuten later gefixeerd en onderzocht op phospho arc. Let op dat de gekleurde cellen aan de rechterkant niet zijn geëlectroporeerd, en de cellen aan de linkerkant tot aan deze lijn wel zijn geëlectroporeerd. De niet-geëlectroporeerde cellen vertonen een bruine kleuring met een phospho irk-antilichaam en immunoperoxidase.

De geëlectroporeerde cellen vertonen geen kleuring, aangezien het geëlectroporeerde fosfopeptide het SSH2-domein van Grb2 heeft geblokkeerd en de ERK-fosforylering van EGF heeft geremd. Let op het gebied van drie tot vier cellengrootte rechts van de lijn waar cellen nog niet geëlectroporeerd waren, maar toch geen kleuring vertonen. Dit zijn cellen die het blokerende peptide van hun geëlectroporeerde buren hebben overgenomen via gapjunctions.

Dit is het krachtigste mogelijke bewijs dat de inhibitie van het signaal te wijten moet zijn aan het peptide en geen artefact van electroporatie kan zijn. Aangezien deze cellen niet zijn geëlectroporeerd, is dit hetzelfde beeld dat onder fasecontrast wordt getoond. Let op de afwezigheid van elke verandering in de morfologie na electroporatie.

Bij sommige patiënten kan de gap-junction communicatie nauwkeurig kwantitatief worden bepaald in een grote verscheidenheid aan gecultiveerde cellen. De introductie van peptiden om specifieke signaleringsroutes te onderbreken is een krachtige aanpak om de relevantie in levende cellen te beoordelen van eiwit-eiwitinteracties die zijn geïdentificeerd met gezuiverde eiwitten. Dit kan de eerste belangrijke stap zijn in de ontwikkeling van peptidomische geneesmiddelen.