Name: RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Leer een snelle, fluorescentie-gebaseerde in vitro-assay voor het monitoren van mitochondriale RNA-editing in Trypanosoma brucei. Deze methode maakt high-throughput screening van editosoom-remmers mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Najmeh Nikpour en Fiona Alum gaven suggesties en bewerkten dit manuscript. Het Department of Biochemistry aan de McGill University ondersteunde HM en VM met de CIHR Training Initiative in Chemical Biology. Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (aan R. S.).

Het onderstaande protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van de fluorescentie gebaseerde RNA editing test. De test kan worden uitgevoerd in een PCR-buis, 96 putjes of 384 putjes afhankelijk van de omvang van het experiment. Vervolgens wordt de fluorescentie-signaal kan worden gelezen op een geschikte real-time PCR-detectie systeem. De test hier beschreven in de context van 384 putjes. 1. Kweken T. brucei Cellen <ol><li> Bereid een groeimedium voor T. brucei procyclische vorm cellen. Voor 1 liter medium: <ol><li> Los op 25,4 g SDM-79 poeder in 800 ml miliQ water. </li><li> Voeg 2 g NaHCO3 en pH op 7,3 met 10 M NaOH. </li><li> Voeg nanozuiver water tot een eindvolume van 900 ml, filter steriliseren. </li><li> Voeg foetaal runderserum (FBS), penicilline-streptomycine-oplossing en hemine (2,5 mg / ml) tot eindconcentraties van 10% (v / v), 100 U / ml en 7,5 mg / L respectievelijk. </li></ol></li><li> Grow 300 ml T. &lt;em&gt; brucei 1,7 A wildtype (procyclische vorm) cellen bij 28 ° C, onder schudden bij 70 rpm tot een dichtheid van 1,5 x 10 7 cellen / ml. 0,5 mg totaal eiwit, voldoende voor 600 bewerken reacties Dit moet 3 ml actieve editosome produceren met ~: NOTE. </li><li> Oogst de cellen door centrifugatie bij 6.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Was de pellet met 50 ml koud PBSG buffer (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2PO 4, 145 mM NaCI en 6 mM glucose) en spin down de cellen weer door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li></ol> 2. Isolatie van ruwe Mitochondriën Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C tot editosome activiteit behouden. <ol><li> Resuspendeer de geoogste cellen in 30 ml DTE buffer (1 mM Tris-HCl pH 8,0 en 1 mM EDTA). Gebruik een 40 ml steriele Dounce homogenisator (voorgekoeld) aan het celmembraan verstoren door strijken en neer ten minste 10 keer op ijs. </li&gt; <li> Voeg onmiddellijk 4.3 ml 60% sucrose (gew / vol, dwz 1,75 mol) aan het homogenaat tot een eindconcentratie van 0,25 M. Centrifugeer bij 15.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, om bij voorkeur neerhalen mitochondria. </li><li> Resuspendeer de pellet in mitochondriale 4,6 ml STM-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sucrose en 2 mM MgCl2). Voeg 13,8 ul van 0,1 M CaCl2 en 4 pi RNase-vrij DNase I tot eindconcentraties van 0,3 mM en 9 U / ml. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur op ijs. </li><li> Voeg 4,6 ml STE-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sucrose en 2 mM EDTA) aan de DNase I Centrifugeer inactiveren bij 15.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet in 400 ui lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1 ug / ml pepstatine, 1 mM DTT, en 1 x volledige-EDTA-vrije proteaseremmer) en overbrengen in een microfugebuis. </li><li> Voeg 10% Triton X-100 tot een eindconcentratie van 1% pernd incubeer het lysaat gedurende 15 minuten bij 4 ° C op een buis rotator. </li><li> Schakel de mitochondriale lysaat met tweemaal centrifugeren bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C; behoud van de heldere supernatant telkens. </li></ol> 3. Editosome Zuivering <ol><li> Giet 10 ml 10% -30% (v / v) glycerol lineaire gradiënt (tabel 1) in een ultracentrifuge buis met 2x HHE gradiënt buffer (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCl, en 2 mM EDTA) en een gradiënt maker door het volgen van de handleiding. </li><li> Verwijder voorzichtig 500 pi oplossing van de bovenkant van de glycerol gradiënt en voorzichtig laden 500 ul van de geklaarde lysaat mitochondriale. Spin bij 178.000 xg gedurende 6 uur bij 4 ° C met behulp van een ultracentrifuge. </li><li> Verzamel 500 pi fracties achtereenvolgens van boven tot onderaan de helling bij 4 ° C. Snap dan bevriezen de fracties met vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol><ol><li> Gloeien de respectieve DNA-matrijs die sequentie complementair aan T7 promotersequentie (tabel 2) met een T7 promoter-oligonucleotide (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) in een 1:1 molverhouding door verwarming bij 90 ° C gedurende 3 minuten en afkoelen bij kamertemperatuur gedurende tenminste 10 minuten. </li><li> Transcriberen RNA met behulp van een in vitro transcriptie kit door het volgen van de handleiding. </li><li> Stop de transcriptie reactie door het toevoegen van een gelijk volume van 7 M ureum kleurstof (7 M ureum, 0,05% Xyleen Cynol, en 0,05% Broomfenolblauw). Voer een filter gesteriliseerde 9% denaturerende polyacrylamidegel (9% acrylamide, 7 M ureum, 1x TBE). </li><li> Gebruik de ultraviolette (UV) schaduwen met een kortegolf UV-lamp op te sporen en accijnzen respectieve RNA. Plaats de uitgesneden gelstuk in een microcentrifugebuis en voeg 400 ul gel elutiebuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA en 0,25% SDS). Elueren nacht bij kamertemperatuur op een buis rotator. </li><li> Precipitate de geëlueerde RNA door toevoeging van 1 ml van koude 100% ethanol en incubatie hetzij bij -80 ° C gedurende 30 minuten of -20 ° C overnacht. </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C, tot pellet door het RNA. </li><li> Was de pellet met 1 ml 75% ethanol. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de RNA pellet adequate wijze RNase-free water om de gewenste concentraties te bereiken, zoals getoond in Tabel 2. </li></ol> 5. Fluorescentie-gebaseerde RNA bewerken Assay <ol><li> Voor een enkele reactie, combineer 1 pmol (1 pl) van preA6Rbz en 2,5 pmol (1 pl) van gA6Rbz (molaire verhouding 1:2,5) in een microfuge buis, incubeer bij 70 ° C gedurende 3 minuten en laat het zitten bij kamertemperatuur gedurende minste 10 minuten. </li><li> Maak ondertussen een master mix met behulp van tabel 3, zonder de preA6Rbz en gA6Rbz, voor het bewerken reactie die 1x HHE buffer (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl en 10 mM EDTA), 1 mMATP, 5 mM CaCl2, 16 ng / ul Torula gist RNA, 0,1% Triton X-100, en de gezuiverde editosome. </li><li> Voeg getemperd preA6Rbz en gA6Rbz aan de master mix te voltooien. </li><li> Pipetteer 18 ul van de master mix (tabel 3) in putjes bestaande uit 2 pl RNase-vrij water (putjes zonder verbindingen) of 2 ui 200 uM chemische verbindingen bevatten controlemonsters in de plaat volgens figuur 5. </li><li> Dicht de plaat met een plaatafdichter en draai de plaat naar beneden, om eventuele luchtbellen te verwijderen. Incubeer bij 28 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Voeg 25 pmol (2 pl) van gA6Rbz concurrent aan elk putje. Zet een nieuwe sealer, draai de plaat naar beneden en leg hem op een real-time PCR machine. Programmeer het volgende experiment: Stap 1: 85 ° C gedurende 5 minuten; Stap 2: 24 ° C gedurende 10 min; Stap 3: Stop. </li><li> Voeg 15 pmol (1 pl) van FRET substraat aan elk putje tot een eindvolume van 23 pi. Dicht de plaat met een frisse sealer.Snel draaien de plaat en plaats het terug op de real-time PCR machine. </li><li> Programmeer een nieuw experiment met de volgende stappen: Stap 1: 37 ° C gedurende 1 min; Stap 2: Lees; Stap 3: Ga naar 1, 40 maal Stap; Stap 4: Stop. </li><li> Setup de plaat door het selecteren van alle putten die het lezen nodig hebben en kiezen voor de FAM filter. Volume input 23 ul en start de run. </li><li> Bereken de helling van de verkregen uit elk putje / monster een kinetische meting te verkrijgen door het uitzetten van de hellingen op een staafdiagram voor analyse waarden. OPMERKING: Een kinetisch gelezen verbetert de signaal-ruisverhouding tussen het monster en de achtergrond; als de achtergrond monster een helling dicht bij nul zou hebben. Een eindpunt lezing heeft een hogere achtergrondgeluiden. </li></ol>

<ol><li>Benne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcript+of+the+frameshifted+coxII+gene+from+trypanosome+mitochondria+contains+four+nucleotides+that+are+not+encoded+in+the+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA.</a> Cell. 46, 819-826 (1986).</li>
<li>Hajduk, S., Ochsenreiter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+in+kinetoplastids%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">RNA editing in kinetoplastids.</a> RNA biology. 7, 229-236 (2010).</li>
<li>Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine+insertion%2Fdeletion+editing+in+trypanosomes%3A+a+playground+for+RNA-guided+information+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer.</a> Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).</li>
<li>Seiwert, S. D., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing%3A+transfer+of+genetic+information+from+gRNA+to+precursor+mRNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro.</a> Science. 266, 114-117 (1994).</li>
<li>Weng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+RNA-binding+complex+from+mitochondria+of+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular%22%5BJournal%5D)">Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids.</a> Molecular. 32, 198-209 (2008).</li>
<li>Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TbRGG1%2C+an+essential+protein+involved+in+kinetoplastid+RNA+metabolism+that+is+associated+with+a+novel+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex.</a> RNA. 14, 970-980 (2008).</li>
<li>Ammerman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+trypanosome+RNA+editing+accessory+complex%2C+MRB1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).</li>
<li>Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+the+RNA+editing+complex+in+Trypanosoma+brucei+requires+band+III+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein.</a> Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).</li>
<li>Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+in+Trypanosoma+brucei+requires+three+different+editosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes.</a> Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).</li>
<li>Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+RNA+editing+complex%3A+band+II+is+structurally+critical+and+maintains+band+V+ligase%2C+which+is+nonessential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential.</a> Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).</li>
<li>Schnaufer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+ligase+essential+for+RNA+editing+and+survival+of+the+bloodstream+form+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei.</a> Science. 291, 2159-2162 (2001).</li>
<li>Tarun, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KREPA6+is+an+RNA-binding+protein+essential+for+editosome+integrity+and+survival+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei.</a> RNA. 14, 347-358 (2008).</li>
<li>Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+trypanosomiases+and+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis.</a> Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).</li>
<li>Denise, H., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+mode+of+action+of+drugs+used+against+sleeping+sickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness.</a> Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).</li>
<li>Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+uridylate+deletion+in+vitro+suggests+a+mechanism+for+kinetoplastid+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing.</a> Cell. 84, 831-841 (1996).</li>
<li>Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridylate+addition+and+RNA+ligation+contribute+to+the+specificity+of+kinetoplastid+insertion+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing.</a> Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).</li>
<li>Igo, R. P. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+uridylate-specific+exoribonuclease+activity+in+Trypanosoma+brucei+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing.</a> Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).</li>
<li>Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hammerhead+ribozyme+substrate+and+reporter+for+in+vitro+kinetoplastid+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing.</a> RNA. 8, 548-554 (2002).</li>
<li>Moshiri, H., Salavati, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+reporter+substrate+for+monitoring+RNA+editing+in+trypanosomatid+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens.</a> Nucleic Acids Res. 38, e138(2010).</li>
<li>Jenne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+characterization+of+hammerhead-ribozyme+inhibitors+using+fluorescence-based+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology.</a> Nature. 19, 56-61 (2001).</li>
<li>Hartig, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-dependent+ribozymes+report+molecular+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time.</a> Nature. 20, 717-722 (2002).</li>
<li>Famulok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+aptamers+and+aptazymes+as+probes+for+screening+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+molecular+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches.</a> Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).</li>
<li>Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+an+apolipoprotein+B+messenger+RNA+editing+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein.</a> Science. 260, 1816-1819 (1993).</li>
<li>Jurica, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+a+wrench+to+throw+into+the+splicing+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Searching for a wrench to throw into the splicing machine.</a> Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).</li>
<li>Spahn, C., Prescott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Throwing+a+spanner+in+the+works%3A+antibiotics+and+the+translation+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus.</a> Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een nieuwe high-throughput screening methode om remmers tegen de RNA editing complex van Trypanosomen identificeren werd gepresenteerd, het verstrekken van een nieuw instrument voor drug discovery aan ziekten veroorzaakt door trypanosomatids tegen te gaan. FRET-gebaseerde ribozym test wordt veelvuldig gebruikt voor verschillende doeleinden 20-22; echter, hebben we de capaciteit van FRET-gebaseerde ribozym assay in vitro volgen van RNA editing activiteit 19 gebruikt. Deze assay zou kunnen w...

Het proces van RNA editing, een post-transcriptionele mRNA modificatie, werd voor het eerst ontdekt in trypanosomatids 1. Sindsdien is veel werk verricht bij het ​​bestuderen van het mechanisme achter RNA editing in Trypanosoma brucei 2,3. In een reeks enzymatische reacties, het editosome, een kerncomplex van ongeveer 20 eiwitten creëert rijpe mitochondriale mRNAs voor meerdere componenten van de energieopwekking oxidatieve fosforylering systeem. De volgorde van katalytische gebeurtenissen is endonucleolytische splitsing, uridylate (U) toevoegen of verwijderen, en ligatie, zoals gedicteerd door gids-RNA&#39;s (gRNAs) 4. Naast de kern editosome complexe eiwitten, een aantal toebehoren factoren ook geïdentificeerd 5-7. Deze eiwitten worden meestal gezien gegroepeerd onafhankelijke complexen. De volgorde van de proteïne assemblage in de kern editosome complex en interactiepatronen van de kerncomplex de accessoirecomplexen moeten nog worden bepaald. Gericht op de RNA bewerkingsproces in trypanosomatids kan chemische dissectors bieden die helpen bij het bestuderen van de aanmaak en functie van de editosome complex. Bovendien, functionele studies op verschillende editosome eiwitten hebben aangetoond wezenlijkheid in verschillende levensfasen, met vermelding van hun potentieel als drug targets 8-12. Daarom kunnen de gevonden remmers van de editosome ook als lead verbindingen tegen trypanosomatids. Dit is tijdig, zoals thans beschikbare middelen tegen ziekten veroorzaakt door trypanosomatid zijn giftig, inefficiënt en duur 13,14. Een efficiënte en gemakkelijk in vitro test moet de chemische universe specifieke remmers die RNA editing blokkeren verkennen. Drie assays zijn ontwikkeld en gebruikt voor het bewaken editosome activiteiten: (a) volledig door in vitro RNA editing assay 15, (b) vooraf gesplitst in vitro RNA editing assay 16,17, eennd (c) hammerhead ribozyme (HHR)-gebaseerde test 18. De eerste twee assays afhankelijk directe visualisatie van het bewerkte product (ATPase 6 mRNA) met behulp van radioactiviteit. De HHR-gebaseerde test gebruikt een gewijzigde versie van de ATPase 6 mRNA dat wordt gemodelleerd te gedragen als een ribozym na bewerking. De functionele ribozym vervolgens splitst specifiek een radioactief gemerkt RNA substraat, die als verslaggever. Recentelijk Moshiri et al.. Ontwikkelde een &quot;meng en meet&quot; HHR-gebaseerde in vitro reporter assay te controleren RNA editing waarbij het ​​radioactief gemerkte RNA-substraat wordt vervangen door een fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) substraat 19. Het principe voordelen van deze test zijn: (a) het een snelle en makkelijke mix en meet type assay, de productie van actieve ribozym en substraat splitsing plaatsvinden gelijktijdig in dezelfde buis klein volume (bijvoorbeeld 20 pi), (b ) vermijdt het gebruik van radioactief gemerkt materiaal, (c) gevoeligheid eenfforded door fluorescentie instrumenten in een micro-titer plaat formaat, en (d) een hoge signaal-ruisverhouding. Met deze test wordt het effect van bekende RNA editing ligase remmers tegen gezuiverd editosome bevestigd 19. Dit experiment gevalideerd assay voor de snelle identificatie van RNA editing remmers, vooral tegen hele editosomes van T. brucei. Figuur 1 is een uitvoerige stap-voor-stap schema van de fluorescentie gebaseerde in vitro RNA editing assay. Dit protocol kan worden gebruikt voor het bewaken RNA editing in vitro of gemakkelijk worden aangepast voor het screenen van bibliotheken van verbindingen van verschillende schalen.

<table><tbody><tr><td>SDM-79 Medium</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td>heat inactivation bij 55 &#176;C gedurende 1 uur</td></tr><tr><td>Hemin, minimaal 80%</td><td>Sigma</td><td>H5533-10G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine-oplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1 recombinant, Rnase Vrij&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMax Express Large&nbsp; schaal RNA&nbsp; productiesysteem</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes Dounce weefselmolen&nbsp;&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>K885300-0040&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Master, versie 5.25&nbsp;</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Clear Tube, 13,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100XP&nbsp; Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti ROTOR</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>MicroSeal 'B' Seal, Seals</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>CFX 384 Touch Real-Time PCR Detectiesysteem</td><td>Biorad</td><td>185-5484</td><td></td></tr><tr><td>Acryel/Bis oplossing (19:1), 40% (w/v)</td><td>Bio Basic</td><td>A0006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea, moleculaire biologiekwaliteit, 1 kg</td><td>Life Technologies</td><td>AM9902</td><td></td></tr></tbody></table>

rna catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen rna bewerken in trypanosomen

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het bepalen van het mechanisme van mitochondriale RNA editing in trypanosomen. Ook heeft aanzienlijke vooruitgang geboekt in het identificeren van de onderdelen van de editosome complex dat RNA editing katalyseren. Het is echter nog niet duidelijk hoe deze eiwitten samenwerken. Chemische verbindingen die wordt verkregen uit een high-throughput-scherm tegen de editosome kunnen blokkeren of invloed hebben op een of meer stappen in de montage cyclus. Daarom zal de identificatie van nieuwe chemische verbindingen waardevolle moleculaire probes voor het ontleden van de editosome functie en assemblage. In eerdere studies, werden in vitro bewerken testen uitgevoerd met behulp van radio-gelabelde RNA. Deze testen zijn tijdrovend, inefficiënt en niet geschikt voor high-throughput doeleinden. Hier, een homogene fluorescentie-based &quot;mix en meet&quot; hammerhead ribozym in vitro reporter assay om RNA editing bewaken, wordt gepresenteerd. Slechts als gevolg van RNA editing vande hamerhaai ribozyme een fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) oligoribonucleotide substraat ondergaat decollete. Dit resulteert in scheiding van de fluorofoor door de quencher waardoor een signaal produceert. Wanneer daarentegen de editosome functie wordt geremd, het fluorescentie signaal wordt gedoofd. Dit is een zeer gevoelige en eenvoudige test die algemeen voor monitoring van in vitro RNA editing of hoge doorvoer screening van chemische stoffen die de editosome functie kan remmen moeten zijn.

De nodige stappen voor het opzetten van een grootschalige scherm tonen, figuren 2-5 zijn representatief controle-experimenten betreffende de kwaliteit van de assay. Deze zijn essentieel controleproeven voor een consistente bepaling meerdaagse screening of vergelijking van verschillende schermen. Het beoordelen van de fluorescentie-signaal-ruis verhouding Om de stabiliteit en kwaliteit van de met fluoresceïne gemerkte oligoribonuc...

Een zeer gevoelige ribozyme-gebaseerde test, toepasbaar voor high-throughput screening van chemicaliën die zich richten op het unieke proces van RNA-bewerking bij trypanosomatiden-pathogenen, wordt in dit artikel beschreven. Remmers kunnen worden gebruikt als hulpmiddelen voor hypothese-gedreven analyse van het RNA-bewerkingsproces en uiteindelijk als therapeutische middelen.

RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Het algemene doel van deze procedure is om RNA-editing te analyseren met behulp van functionele omes die zijn geëxtraheerd uit Trias Broce voor de snelle identificatie van de omes-remmers. Dit wordt bereikt door eerst mitochondria en de doel-edito-zones uit tbr te isoleren. De tweede stap is het voorbereiden van het synthetische RNA-editing reporter-substraat.Vervolgens worden de verbindingen gebonden aan gezuiverde edito-zones, samen met de RNA-editingreporter. In aanwezigheid van verbindingen die de functie van de edito-zones blokkeren, zal de RNA-reporter geen editing ondergaan en inactief blijven. De laatste stap is het toevoegen van het F-thread-substraat en het monitoren van het vermogen van de RNA-editingreporter om dit substraat selectief en specifiek te splitsen.In het geval van een remmende verbinding wordt de RNA-editing geblokkeerd en zal een verminderd of geen fluorescent signaal worden gedetecteerd. Uiteindelijk wordt een real-time PCR-apparaat gebruikt om de fluorescentie die door het fret-substraat wordt uitgezonden als functie van de tijd te monitoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele in vitro editing-assays is dat het een

rna-catalyst-as-reporter-for-screening-drugs-against-rna-editing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.

Antilichamen-vrije assay voor analyse van RNA-methyltransferase activiteit

NMR-based activiteit assays zijn ontwikkeld om te identificeren en te karakteriseren remmers van twee nucleoside ribohydrolase enzymen. De protocollen worden verstrekt voor aanvankelijke samenstellings analyses bij 500 μM en 250 μM, dosis-reactie analyses voor het bepalen van IC50 waarden, detergent tegen het scherm analyses, sprong-verdunnings tegen het scherm analyses, en analyses in de gehele cellen van E. coli .

NMR-based activiteit assays voor het bepalen van samengestelde remming, IC50 waarden, artefactuele activiteit, en de hele cel activiteit van nucleoside Ribohydrolases

Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Snelle detectie en betrouwbare kwantificering van RNA-bewerkingsgebeurtenissen op genomische schaal blijven een uitdaging en vertrouwen momenteel op directe RNA-sequencingmethoden. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) als een eenvoudige, snelle en draagbare methode om RNA-bewerking te detecteren.

Een nonsequencing-benadering voor de snelle detectie van RNA-bewerking

Leer een snelle, fluorescentie-gebaseerde in vitro-assay voor het monitoren van mitochondriale RNA-editing in Trypanosoma brucei. Deze methode maakt high-throughput screening van editosoom-remmers mogelijk.

RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen

Meer video's verkennen