Een gemiddelde van virale envelop glycoproteïne Spikes uit Electron Cryotomography Reconstructies met Jsubtomo

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de structuren van glycoproteïnecomplexen die aanwezig zijn op de oppervlakken van omhulde virussen. Dit wordt bereikt door eerst de virusdeeltjes te lokaliseren in de tomografische volumes die eerder zijn berekend op basis van cryo-elektronenmicroscopiedata. De tweede stap bestaat uit het maken van twee statistisch onafhankelijke initiële modellen van de glycoproteïnecomplexen met behulp van een handmatig gedefinieerde subset van data.

Vervolgens worden deze modellen verfijnd en daarna gebruikt om automatisch alle glycoproteïnecomplexen op de viruspartikels te detecteren. De laatste stap is het verfijnen van de structuur van het glycoproteïnecomplex met behulp van de volledige dataset. Tot slot worden moleculaire visualisatietools gebruikt om de uiteindelijke structuur te interpreteren.

Driedimensionale structurele analyse van deze glycoproteïnespikes is van onschatbare waarde voor het begrijpen van de virale pathogenese en voor het ontwerp van geneesmiddelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals röntgendiffractie, is dat deze techniek het mogelijk maakt om structuren van membraaneiwitten op te lossen in hun natuurlijke membraanomgeving. Deze techniek kan helpen bij het adresseren van kernonderwerpen binnen de structurele biologie.

Bijvoorbeeld de structuur van veel virussen die een membraan bevatten. Hoewel deze techniek inzicht kan geven in glycoproteïnecomplexen in deze virussen, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals membraaneiwitten die in liposomen zijn ingebed. De procedure zal worden gedemonstreerd door twee leden van mijn groep, Slee en David Bittel.

Open voor het begin een autogrambestand in B show. Selecteer handmatig viruspartikels in de grammen door de centrumcoördinaat van een viruspartikel te definiëren met de particle picking tool. Herhaal deze stap totdat alle varianten zijn verwerkt.

Sla de viruscoördinaten op in een star-bestand. Herhaal dit proces voor alle tomogrammen. Voer vervolgens J sub tomo py uit in extractiemodus. Om variëren op subvolumes naar individuele volumebestanden te extraheren, gebruikt u de opgeslagen star-bestanden als invoerbestanden om twee onafhankelijke initiële modellen te genereren.

Open eerst het volume-map-bestand van de eierstoksubvolumes. Toon dit in B. Selecteer een subset van spikes in de Varian-subvolumes door de centrale coördinaat van een spike te definiëren met de particle picking-tool, die toegankelijk is via het toolbox-venster.

Herhaal deze stap totdat alle duidelijk onderscheidbare spikes zijn verwerkt. Sla de coördinaten van de spikes op in een star-bestand. Herhaal deze stap totdat er ongeveer 200 glycoproteïne-spikes zijn verwerkt.

Nadat de aanzichten aan de varianten zijn toegewezen zoals beschreven in het tekstprotocol, maakt u een reële-ruimtemasker met J sub tomo create mask py. Genereer vervolgens een reciproke-ruimtemasker met J sub tomo create wedge mask py.

Het reciproke ruimtemasker wordt gebruikt om regio's in het 'missing wedge'-gebied uit te sluiten, die voortvloeien uit tomografische gegevensverzameling met een enkele as. Maak vervolgens twee initiële gemiddelden met J.Sub tomo create averages. PY, waarbij een opgeslagen selectiebestand als invoerbestand wordt gebruikt.

Gebruik ization om ruis in de initiële gemiddelden te verminderen door de twee eerder gegenereerde modellen iteratief uit te lijnen en te middelen met J sub tomo iterate gold PY. Details voor beide fasen van dit proces zijn te vinden in het tekstprotocol. Beoordeel de graad van symmetrie in de structuur door het resulterende laagdoorgefilterde map-bestand in kyira te onderzoeken. Als de spike bijvoorbeeld een trimeer complex is, zou drievoudige symmetrie duidelijk zichtbaar moeten zijn.

Zet de verfijning van de structuur voort zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Genereer vervolgens seeds die gelijkmatig over het Varian-oppervlak zijn verspreid voor template-matching en wijs een initiële viziervector toe aan de seeds door JVs py uit te voeren. Gebruik de eerder gegenereerde star-bestanden als invoerbestanden en genereer ongeveer 1,5 keer zoveel seeds als het verwachte aantal spikes.

Deze kijkvector benadert de richting van de spike die het dichtst bij elk zaadpunt ligt. Genereer vervolgens, zoals eerder beschreven, twee onafhankelijke gemiddelden van het virusoppervlak. Verfijn daarna de positie van de zaadpunten zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.

Genereer ten slotte com-markerbestanden van de verfijnde seed-starbestanden met behulp van jvs.py. Onderzoek de seeds door de CMM-bestanden en de bijbehorende virion-mapbestanden te openen in kyira.

Zorg ervoor dat de verfijnde seeds correct zijn uitgelijnd ten opzichte van het virusmembraan. De verfijnde markers kunnen worden gekleurd op basis van hun cross-correlatiecoëfficiënten. Lokaliseer automatisch alle spikes in de variant-subvolumes met behulp van lokale template matching rond de verfijnde seeds; lijn de gelokaliseerde spikes uit en bereken het gemiddelde. Gebruik de gemiddelden die zijn gegenereerd uit een subset van handmatig geselecteerde spikes als initiële templates. Aanvullende details voor dit proces zijn te vinden in het tekstprotocol. Om de resultaten te visualiseren, opent u de verfijnde structuur van de spike in kyira voor visualisatie.

Ga verder met het fitten van de atoomstructuren. Maak vervolgens een composietmodel van het virion met j Subo Create model DO py. Open tot slot het composietmodel voor visualisatie in kyira.

Het initiële model werd verfijnd met behulp van 205 handmatig geselecteerde spikes. Een drievoudige symmetrie van de meest centrale spike was duidelijk zonder dat er symmetrie werd toegepast; deze werd opgelegd bij de daaropvolgende verfijningsrondes om alle spikes op de Varian-oppervlakken handmatig te detecteren. Voor elk vion werden 106 seeds gegenereerd op een straal van 43 nanometers en een tussenruimte van 20 graden, waarvan de posities iteratief ten opzichte van het membraan werden verfijnd.

De best correlerende glycoproteïne-spike-patches werden gebruikt om het uiteindelijke gemiddelde te berekenen. Het gemiddelde werd opgelost tot een resolutie van 35 angstrom. Dit onthulde een trimerische spike-structuur in het midden, naast een bepaalde bijdrage van zes naburige spikes.

Samengestelde modellen van de varis, berekend door de structuur op de bekende posities te plaatsen, onthulden de plaatsing van spikes op het oppervlak van de Varian. Af en toe waren lokaal geordende clusters van spikes zichtbaar. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alleen de beste gegevens te gebruiken en alle tussenresultaten zorgvuldig te controleren.

Na deze procedure kunnen röntgendiffractiestructuren in het uiteindelijke gemiddelde worden geplaatst om een nauwkeuriger beeld te krijgen van eiwit-eiwitinteracties. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u structuren van virale envelop-glycoproteïnen kunt middelen met behulp van J Omo.