Name: Een gemiddelde van virale envelop glycoproteïne Spikes uit Electron Cryotomography Reconstructies met Jsubtomo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Leer sub-tomogram averaging van virale envelop glycoproteïne spikes met Jsubtomo en electron cryo-tomografie. Deze methode onthult trimerische structuren voor inzicht in virale pathogenese en drug design.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Academie van Finland (130750 en 218080 aan J.T.H.), de Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z aan T.A.B.), en door de MRC (MR/J007897/1 aan J.T.H en T.A.B; MR/L009528/1 aan T.A.B.).

<ol><li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li>
<li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li>
<li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles%3A+structural+implications+for+coat+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li>
<li>Grünewald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li>
<li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li>
<li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li>
<li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).</li>
<li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li>
<li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li>
<li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles%3A+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li>
<li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li>
<li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li>
<li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li>
<li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li>
<li>Pietilä, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li>
<li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li>
<li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li>
<li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).</li>
<li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li>
<li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li>
<li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bsoft%3A+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li>
<li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Kennis van virale spike glycoproteïne structuur het virion membraan essentieel voor het begrijpen van virusreplicatie en ontwikkeling van therapeutica voor de behandeling en preventie van infectie. Elektron cryo-microscopie gecombineerd met enkel deeltje middeling heeft ontpopt als de meest gebruikte methode om de structuren van de omhulde virusdeeltjes, met inbegrip van het glycoproteïne spikes op te lossen. Echter, deze werkwijze beperkt tot symmetrische virussen icosahedrally. Hier, door de toepassing van elektronen cryo-tomografie en subtomogram middeling in Jsubtomo, we hebben een algemeen protocol voor het bepalen van glycoproteïne spikes op pleomorfe omhulde virussen die niet vatbaar zijn voor andere lopende structurele biologie methoden zijn beschreven. De representatieve resultaten tonen aan dat de oplossing van deze werkwijze voldoende is om inzicht in domeinarchitectuur, oligomerisatie en hogere orde ordening glycoproteïne spikes op intacte virions onthullen. jove_content &quot;&gt; De meest kritische stap in dit protocol is de bouw van twee betrouwbare start modellen die zijn statistisch onafhankelijk van elkaar. Succesvolle uitvoering van deze stap gaat ervan uit dat glycoproteïne spikes zijn voldoende groot en niet gepakt tegen elkaar te strak, zodat de individuele pieken kunnen visueel herkend en handmatig kozen in het tomogram, en twee onafhankelijke modellen gemiddeld. Als dit niet mogelijk, twee wijzigingen aan het protocol kan worden geprobeerd. eerste twee onafhankelijke stochastische modellen kunnen worden geconstrueerd door eerst definiëren twee deelverzamelingen van subtomograms en het middelen van de subtomograms binnen deze subgroepen 30. tweede, als een structuur van de geïsoleerde piek is afgeleid door andere middelen, bijvoorbeeld door röntgenkristallografie, kan het worden gebruikt als uitgangspunt model. Wel moet erop worden genomen lage- pass filter dit model met een lage resolutie cut-off (50-70 Å), als de twee resulterende modellen in de volgende ronde van verfijning zalzijn statistisch onafhankelijk alleen buiten deze resolutie. Vanwege dit voorbehoud, is de vroegere aanpak aanbevolen. De verkrijgbare resolutie van dit protocol is afhankelijk van vier belangrijke factoren: i. gegevensverzameling strategie en de kwaliteit van de invoergegevens, ii. nummer van de subtomograms, iii. uitlijnnauwkeurigheid van de subtomograms en iv. heterogeniteit van de structuur. Terwijl de eerste en tweede begrenzing kan grotendeels worden ondervangen door een hoge signaal-ruis direct electron detectors gecombineerd met CTF gecorrigeerde tomography en geautomatiseerde gegevensverzameling, wordt de nauwkeurigheid uitlijning verder beïnvloed door de grootte en vorm van de structuur plaats zelf. Bij toepassing van dit protocol kleine pieken ontbreken opvallende kenmerken, kan het voordelig zijn om Fab fragmenten binden aan de nagel om de uitlijning nauwkeurigheid en resolutie dus 31 verbeteren. Ten slotte, als de structuren moeten worden gemiddeld vertonen meerdere conformaties, sub-Tomografieam classificatie methoden kunnen worden gebruikt om verschillende conformaties gemiddeld afzonderlijk. Daartoe Jsubtomo integreert met de Dynamo-pakket, die een krachtige subtomogram classificatie 9. Het bovenstaande protocol is een aanvulling op de X-ray kristallografie van geïsoleerde virale glycoproteïnen. Kristallografische structuren kunnen worden aangebracht in gemiddelden sub-tomogram de precieze oriëntatie van het glycoproteïne te verkrijgen met betrekking tot het virion membraan. Toepassing van deze methode zal ongetwijfeld blijven licht te werpen op omhuld virus structuur en pathobiology.

Electron cryo-tomografie is een elektronen cryo-microscopie techniek waardoor de berekening van een driedimensionaal (3D) reconstructie van complexe biologische monsters. Geschikte monsters variëren van gezuiverde macromoleculaire complexen 1, filamenten 2, bekleed blaasjes 3 en pleomorfe membraan virussen 4 op hele prokaryote cellen 5 en zelfs dunne gebieden van gehele eukaryotische cellen 6. Na het verzamelen van gegevens van een tilt-serie, 3D tomografie volumes of tomogrammen, kan worden berekend met behulp van een aantal gevestigde softwarepakketten, waaronder bsoft 7 en IMOD 8. Twee aspecten inherent aan de studie van biologische monsters met cryo-electron tomografie beperken de biologische interpretatie van de overeenkomstige tomografische volumes. Ten eerste vanwege de beperkte elektron dosis die kan worden toegepast op biologische materialen vóór de invoering aanzienlijke stralingsschade, signal-ruisverhouding in tomografische gegevens zijn typisch zeer laag. Ten tweede, als gevolg van beperkte monster tilt geometrie tijdens gegevensverzameling, een uitzicht van het object afwezig blijft, leidt tot een zogenaamd &quot;missing wig&quot; artefact in het tomografische volume. Echter, beide beperkingen kunnen worden overwonnen als de tomografische volume bevat herhalende identieke structuren, zoals macromoleculaire complexen, die met succes kunnen worden gemiddeld 9-12. Voorafgaand aan een gemiddelde van structuren uit tomogram reconstructies, moeten objecten van belang te vinden en afgestemd op de dezelfde richting. Lokaliseren van dergelijke structuren kan worden bereikt door kruiscorrelatie van een sjabloon structuur in het tomografische volume met een benadering vaak aangeduid als template matching 13. De template gebruikt in dit vergelijkingsproces kan worden afgeleid uit elektronen cryo-electron microscopie of cryo-tomografie gecombineerd met 3D reconstructie of het kan een dichtheid kaart gesimuleerd uit teeen atomaire structuur. Verschillende computational zijn ontwikkeld om deze taken uit te voeren 11. Het middelen van glycoproteïne spikes membraan virussen, zoals HIV-1, heeft een bijzonder succesvolle benadering voor het bestuderen van de structuur 14-16 geweest. Een goed begrip van de structuur is integraal voor het openbaren van zowel de moleculaire basis van virus-gastheer interacties en begeleiden van antivirale en vaccin ontwikkeling van het ontwerp. Terwijl macromoleculaire kristallografie is de techniek van keuze voor hoge-resolutie (gewoonlijk beter dan 4 A) structuuranalyse van individuele virale glycoproteïnen complexen, de röntgenstructuren gevolg van deze methode van eiwitten geïsoleerd uit de natuurlijke omgeving membraneuze de virion . Aldus belangrijke details zoals de hogere orde structuur van virale glycoproteïnen, in het kader van het virion, blijven ontbreekt. Anderzijds, elektronen cryo-microscopie en enkel deeltje reconstructievan de gehele omhulde virussen is beperkt tot virusdeeltjes met icosahedrale symmetrie 17,18. Elektron cryotomography gecombineerd met sub-volume afstemming heeft dus ontpopt als een complementaire techniek waardoor de studie van glycoproteïne spikes van onregelmatig gevormde, pleomorfe virussen in situ. We hebben software ontwikkeld genaamd Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) voor de detectie, de uitlijning en middeling van tomografische sub-volumes. Jsubtomo is gebruikt in de structuurbepaling van een aantal cellulaire en virale structuren 19-26. Hier schetsen we een gedetailleerd protocol, dat de bepaling virale oppervlakte-spike structuren mogelijk maakt. Te omzeilen over-verfijning van gemiddeld structuren door correleren ruis, is de &#39;gouden standaard&#39; verfijning regeling aangenomen 10,27. Tot slot, de strategieën voor visualisatie en interpretatie van typische resultaten worden besproken.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>University of Oxford</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

een gemiddelde van virale envelop glycoproteïne spikes uit electron cryotomography reconstructies met jsubtomo

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Omhulde virussen gebruiken membraanglycoproteïnen op hun oppervlak tot toetreding in gastheercellen bemiddelen. Driedimensionale structurele analyse van deze glycoproteïne &#39;spikes&#39; is vaak technisch uitdagend, maar belangrijk voor het begrijpen van virale pathogenese en in geneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor virale spike structuurbepaling door middel van computationele middeling van elektronen cryo-tomografie gegevens. Electron cryo-tomografie is een techniek elektronenmicroscopie gebruikt om drie-dimensionale tomografische reconstructies volume of tomogrammen van pleomorfe biologische monsters afkomstig zoals membraan virussen in een bijna-natieve, bevroren gehydrateerde toestand. Deze tomogrammen tonen structuren plaats in drie dimensies, zij het met lage resolutie. Computationele middeling van sub-volumes, of sub-tomogrammen, nodig is om een ​​hogere resolutie detail van het herhalen van structurele motieven, zoals virale glycoproteïne spikes te verkrijgen. Een gedetailleerde computationele aanpak voor aliGning en gemiddelde sub-tomogrammen behulp van de Jsubtomo softwarepakket wordt geschetst. Deze benadering maakt visualisatie van de structuur van virale glycoproteïne spikes aan resolutie in het bereik van 20-40 A en studie van de studie van hogere orde spike naar spike interacties op het virion membraan. Typische resultaten worden gepresenteerd voor Bunyamwera virus, een omhuld virus uit de familie Bunyaviridae. Deze familie is een structureel diverse groep van ziekteverwekkers die een bedreiging vormen voor de gezondheid van mens en dier.

We tonen de toepassing van het sub-tomogram middeling workflow hierboven voor de omhulling glycoproteïne complex van Bunyamwera virus (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) met een eerder gepubliceerde data set 24. Gegevensverzameling en verfijning parameters worden opgesomd in tabel 1. Een vertegenwoordiger tomogram weergegeven in figuur 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parameter (unit) </td><td> Waarde </td></tr><tr><td> Het verzamelen van gegevens </td><td></td></tr><tr><td> Spanning (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Gekalibreerd vergroting (X) </td><td> 111.000 </td></tr><tr><td> Pixelgrootte (A) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Geschatte dosis (e - / A 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (pm) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Eerste CTF nul (a) een </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Tilt bereik (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Tilt bemonstering (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Data en verfijning </td><td></td></tr><tr><td> Tomogrammen </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virionen </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Zaden per virion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Totaal aantal zaden </td><td> 3.074 </td></tr><tr><td> Spikes gedetecteerd </td><td> 1.346 </td></tr><tr><td> Spikes na het verwijderen van overlappingen </td><td> 1.401 </td></tr><tr><td> Spikes na cross-correlatie gebaseerde selectie </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Spikes in de definitieve gemiddelde </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Symmetrie </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Hoek sampling (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Resolutiewaaier gebruikt in de verfijning (A) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Uiteindelijke schatting resolutie (a) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Bunyamwera dataverzameling en verfijning statistieken. een CTF, contrast transfer functie. b Berekend met behulp van Fourier-shell correlatie tussen twee onafhankelijk verfijnde structuren op een drempel van 0,143. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figuur 2:. Plak door een tomogram van Bunyamwera virions Verschillende spike zijaanzichten zichtbaar in de omtrek van elk virion zijn aangegeven met pijlpunten. De tomogram is low-pass gefilterd tot 60 Å. Schaalbalk 100 nm. Ten eerste hebben we verfijnd een eerste model met 205 handmatig geplukt spikes ( <strong&gt; Figuur 3). Drie-voudige symmetrie van de meest centrale spike was duidelijk zonder toepassing van enige symmetrie (Figuur 3B) en werd in de daaropvolgende ronden van verfijning (figuur 3C) opgelegd. Voor het detecteren automatisch alle pieken op het virion oppervlakken genereerden wij 106 zaden per virion aan de straal van 43 nm en afstand van 20 graden (figuur 4A) en iteratief verfijnd hun posities ten opzichte van het membraan (Figuur 4B). <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Figuur 3: Verfijning van de uitgangstemplate structuur. (A) cilindrisch gemiddeld (C100) sjabloon gemaakt van handmatig gedefinieerde posities van spikes. (B) Averaged dichtheid na vijf rondes van verfijning zonder symmetrie (C1) opgelegd toont een piek met drie-voudigesymmetrische functies. De resolutie van het model is 48 Å. (C) Gemiddelde van de piek werd besloten op 41 Å na vijf rondes van verfijning met drie-voudige symmetrie. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Figuur 4:. Verfijning van de zaden AB) Een subgroep van zaden voor (A) en na (B) verfijning zijn vertegenwoordigd op een virion dichtheid van figuur 2 Zaden (B) zijn kleurgecodeerd op basis van de respectieve cross. correlatiecoëfficiënten (blauw, lage correlatie, rood, hoge correlatie). De beste correleren spike glycoproteïne pleisters (boven 75% na verwijderen overlappingen; ~ 1000 spikes) werden gebruikt om de uiteindelijke gemiddelde berekenen. Het gemiddelde werd besloten 35-Å resolutie (figuur 5). Het bleek een trimeric piek structuur in het midden, inNaast een bijdrage uit zes naburige pieken. Composiet modellen van de virions, berekend door het plaatsen van de constructie in de bekende posities, onthulde plaatsing van de spikes op het virionoppervlak (figuur 6A). Af en toe, ter plaatse te reserveren flarden van spikes waren duidelijk (figuur 6B). <img alt="Figuur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Figuur 5: Geraffineerde structuur van een patch van het glycoproteïne piek laag na template matching. (AB) Two maps &quot;even&quot; en &quot;oneven&quot;, gereconstrueerd uit twee helften van de gegevens worden getoond. De twee kaarten tonen een opmerkelijke mate van overeenstemming, het verifiëren van de validness van de aanpak. De oriëntatie rond de piek lange as anders als de twee kaarten volledig onafhankelijk gereconstrueerd van elkaar. (C) Het gemiddelde van de twee kaarten is te zien opde uiteindelijke resolutie van 35 Å. <img alt="Figuur 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Figuur 6: Plaatsing van de spikes op de Bunyamwera virion. (A) Samengestelde model van een virion. Bekijk vectoren (stokken) geven de oriëntaties van de spikes. Kleuren geven de cross-correlatie tussen elke spike en de template structuur (blauw, lage correlatie, rood, hoge correlatie). (B) Een close-up van een geordende patch van spikes.

Er wordt een benadering gepresenteerd voor het bepalen van structuren van virale membraan glycoproteïne complexen door gebruik te maken van een combinatie van elektronen cryo-tomografie en sub-tomogram averaging met het computationele pakket Jsubtomo.

Een gemiddelde van virale envelop glycoproteïne Spikes uit Electron Cryotomography Reconstructies met Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de structuren van glycoproteïnecomplexen die aanwezig zijn op de oppervlakken van omhulde virussen. Dit wordt bereikt door eerst de virusdeeltjes te lokaliseren in de tomografische volumes die eerder zijn berekend op basis van cryo-elektronenmicroscopiedata. De tweede stap bestaat uit het maken van twee statistisch onafhankelijke initiële modellen van de glycoproteïnecomplexen met behulp van een handmatig gedefinieerde subset van data.Vervolgens worden deze modellen verfijnd en daarna gebruikt om automatisch alle glycoproteïnecomplexen op de viruspartikels te detecteren. De laatste stap is het verfijnen van de structuur van het glycoproteïnecomplex met behulp van de volledige dataset. Tot slot worden moleculaire visualisatietools gebruikt om de uiteindelijke structuur te interpreteren.Driedimensionale structurele analyse van deze glycoproteïnespikes is van onschatbare waarde voor het begrijpen van de virale pathogenese en voor het ontwerp van geneesmiddelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals röntgendiffractie, is dat deze techniek het mogelijk maakt om structuren van membraaneiwitten op te lossen in hun natuurlijke membraanomgeving. Deze techniek kan helpen bij het adresseren van kernonderwerpen binnen de structurele biologie.Bijvoorbeeld de structuur van veel virussen die een membraan bevatten. Hoewel deze techniek inzicht kan geven in glycoproteïnecomplexen in deze virussen, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals membraaneiwitten die in liposomen zijn ingebed. De procedure zal worden gedemonstreerd door twee leden van mijn groep, Slee en David Bittel.Open voor het begin een autogrambestand in B show. Selecteer handmatig viruspartikels in de grammen door de centrumcoördinaat van een viruspartikel te definiëren met de particle picking tool. Herhaal deze stap totdat alle varianten zijn verwerkt.Sla de viruscoördinaten op in een star-bestand. Herhaal dit proces voor alle tomogrammen. Voer vervolgens J sub tomo py uit in extractiemodus. Om variëren op subvolumes naar individuele volumebestanden te extraheren, gebruikt u de opgeslagen star-bestanden als invoerbestanden om twee onafhankelijke initiële modellen te genereren.Open eerst het volume-map-bestand van de eierstoksubvolumes. Toon dit in B. Selecteer een subset van spikes in de Varian-subvolumes door de centrale coördinaat van een spike te definiëren met de particle picking-tool, die toegankelijk is via het toolbox-venster.Herhaal deze stap totdat alle duidelijk onderscheidbare spikes zijn verwerkt. Sla de coördinaten van de spikes op in een star-bestand. Herhaal deze stap totdat er ongeveer 200 glycoproteïne-spikes zijn verwerkt.Nadat de aanzichten aan de varianten zijn toegewezen zoals beschreven in het tekstprotocol, maakt u een reële-ruimtemasker met J sub tomo create mask py. Genereer vervolgens een reciproke-ruimtemasker met J sub tomo create wedge mask py.Het reciproke ruimtemasker wordt gebruikt om regio's in het 'missing wedge'-gebied uit te sluiten, die voortvloeien uit tomografische gegevensverzameling met een enkele as. Maak vervolgens twee initiële gemiddelden met J.Sub tomo create averages. PY, waarbij een opgeslagen selectiebestand als invoerbestand wordt gebruikt.Gebruik ization om ruis in de initiële gemiddelden te verminderen door de twee eerder gegenereerde modellen iteratief uit te lijnen en te middelen met J sub tomo iterate gold PY. Details voor beide fasen van dit proces zijn te vinden in het tekstprotocol. Beoordeel de graad van symmetrie in de structuur door het resulterende laagdoorgefilterde map-bestand in kyira te onderzoeken. Als de spike bijvoorbeeld een trimeer complex is, zou drievoudige symmetrie duidelijk zichtbaar moeten zijn.Zet de verfijning van de structuur voort zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Genereer vervolgens seeds die gelijkmatig over het Varian-oppervlak zijn verspreid voor template-matching en wijs een initiële viziervector toe aan de seeds door JVs py uit te voeren. Gebruik de eerder gegenereerde star-bestanden als invoerbestanden en genereer ongeveer 1,5 keer zoveel seeds als het verwachte aantal spikes.Deze kijkvector benadert de richting van de spike die het dichtst bij elk zaadpunt ligt. Genereer vervolgens, zoals eerder beschreven, twee onafhankelijke gemiddelden van het virusoppervlak. Verfijn daarna de positie van de zaadpunten zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.Genereer ten slotte com-markerbestanden van de verfijnde seed-starbestanden met behulp van jvs.py. Onderzoek de seeds door de CMM-bestanden en de bijbehorende virion-mapbestanden te openen in kyira.Zorg ervoor dat de verfijnde seeds correct zijn uitgelijnd ten opzichte van het virusmembraan. De verfijnde markers kunnen worden gekleurd op basis van hun cross-correlatiecoëfficiënten. Lokaliseer automatisch alle spikes in de variant-subvolumes met behulp van lokale template matching rond de verfijnde seeds; lijn de gelokaliseerde spikes uit en bereken het gemiddelde. Gebruik de gemiddelden die zijn gegenereerd uit een subset van handmatig geselecteerde spikes als initiële templates. Aanvullende details voor dit proces zijn te vinden in het tekstprotocol. Om de resultaten te visualiseren, opent u de verfijnde structuur van de spike in kyira voor visualisatie.Ga verder met het fitten van de atoomstructuren. Maak vervolgens een composietmodel van het virion met j Subo Create model DO py. Open tot slot het composietmodel voor visualisatie in kyira.Het initiële model werd verfijnd met behulp van 205 handmatig geselecteerde spikes. Een drievoudige symmetrie van de meest centrale spike was duidelijk zonder dat er symmetrie werd toegepast; deze werd opgelegd bij de daaropvolgende verfijningsrondes om alle spikes op de Varian-oppervlakken handmatig te detecteren. Voor elk vion werden 106 seeds gegenereerd op een straal van 43 nanometers en een tussenruimte van 20 graden, waarvan de posities iteratief ten opzichte van het membraan werden verfijnd.De best correlerende glycoproteïne-spike-patches werden gebruikt om het uiteindelijke gemiddelde te berekenen. Het gemiddelde werd opgelost tot een resolutie van 35 angstrom. Dit onthulde een trimerische spike-structuur in het midden, naast een bepaalde bijdrage van zes naburige spikes.Samengestelde modellen van de varis, berekend door de structuur op de bekende posities te plaatsen, onthulden de plaatsing van spikes op het oppervlak van de Varian. Af en toe waren lokaal geordende clusters van spikes zichtbaar. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alleen de beste gegevens te gebruiken en alle tussenresultaten zorgvuldig te controleren.Na deze procedure kunnen röntgendiffractiestructuren in het uiteindelijke gemiddelde worden geplaatst om een nauwkeuriger beeld te krijgen van eiwit-eiwitinteracties. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u structuren van virale envelop-glycoproteïnen kunt middelen met behulp van J Omo.

averaging-viral-envelope-glycoprotein-spikes-from-electron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het bepalen van de structuren van membraaneiwitten met behulp van cryo-electron tomografie-en 3D-beeldverwerking. Het omvat de details van prepareren, data verzamelen, data verwerken en interpreteren, en afgesloten met het vervaardigen van een vertegenwoordiger doelstelling voor de aanpak, de HIV-1 Envelop glycoproteïne. Deze computationele procedures zijn ontworpen op een manier die onderzoekers en studenten in staat stelt om op...

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Dit artikel beschrijft een methode om een ​​drie-dimensionale (3D) structuur van spiraalvormig geassembleerd moleculen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie te verkrijgen. In dit protocol maken we gebruik van HIV-1 capside vergaderingen om de gedetailleerde 3D-reconstructie procedure te illustreren voor het bereiken van een dichtheid kaart door de iteratieve rechte real-ruimte reconstructie methode.

Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw

We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.

Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Dit artikel presenteert een protocol voor gegevensverwerking van influenzavirussen, in beeld gebracht met behulp van cryo-elektronentomografie en daaropvolgende subtomogrammiddeling van het hemagglutinineglycoproteïne. Dit protocol omvat stapsgewijze gegevensverwerking, van beeldvoorverwerking tot de verfijning van het uiteindelijke model.

Subnanometer-resolutie structurele bepaling van hemagglutinine uit cryo-elektronentomografie van griepvirussen

De Virochip is een pan-virale microarray ontworpen om gelijktijdig alle bekende virussen, alsmede nieuwe virussen te detecteren op basis van de geconserveerde sequentie homologie. Hier laten we zien hoe een Virochip test uitvoeren om klinische monsters te analyseren op de aanwezigheid van zowel bekende als onbekende virussen.

Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

Leer sub-tomogram averaging van virale envelop glycoproteïne spikes met Jsubtomo en electron cryo-tomografie. Deze methode onthult trimerische structuren voor inzicht in virale pathogenese en drug design.

Een gemiddelde van virale envelop glycoproteïne Spikes uit Electron Cryotomography Reconstructies met Jsubtomo

Meer video's verkennen