DNA-affiniteit-gezuiverd Chip (DAP-chip) methode om Gene Doelen bepalen voor bacteriële Twee componenten Regulatory Systems

Het algemene doel van het volgende experiment is om de genomische bindingsplaatsen van bacteriële twee-componentenresponsregulatoren te bepalen met behulp van een in vitro microarray-gebaseerde assay. Dit wordt bereikt door een getagd responsregulator-eiwit te kloneren en te zuiveren, dit te activeren via in vitro fosforylering en één targetgen te bepalen middels electrophoretic mobility shift assays om als positieve controle te dienen voor de daaropvolgende microarray-stappen. Als tweede stap wordt het gezuiverde responsregulator-eiwit gemengd met het genomische DNA, waardoor het eiwitgebonden DNA middels affiniteitszuivering kan worden gescheiden van het input-DNA.

Vervolgens worden het eiwitgebonden DNA en het input-DNA geamplificeerd, via qPCR geverifieerd voor de verrijking van het positieve controle-gentarget in de eiwitgebonden fractie, fluorescent gelabeld, samengevoegd en gehybridiseerd op een tiling microarray. Om de genomische bindingsplaatsen van de responsregulator te bepalen, tonen de resultaten de meest waarschijnlijke genen die worden gereguleerd door de bestudeerde responsregulator; deze resultaten kunnen verder worden gevalideerd met behulp van electrophoretic mobility shift assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals de in vivo chip-chip, is dat deze kan worden gebruikt, zelfs wanneer de activerende signalen en de condities voor de tweekomponentsystemen niet bekend zijn.

Deze methode is van groot belang voor het veld van bacteriële signalering, aangezien een overgrote meerderheid van de responsregulatoren onbekende gentargets heeft en deze methode helpt om complexe regulatoire netwerken te ontrafelen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Amy Chen, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium, voorafgaand aan de start van deze procedure.

Zuiver een rr, specifiek het DVU 3 0 2 3-eiwit dat tot expressie is gebracht vanuit een gekloond DVU 3 0 2 3-genmengsel. Meng 0,5 picomoles DVU 3 0 2 3-eiwit met 100 femtomoles van een eerder bereid gefosforyleerd DNA-substraat in een gebufferde oplossing tot een totaalvolume van 20 µL. Nadat een reactie zonder eiwit als controle is opgezet, worden de reacties 20 minuten bij kamertemperatuur op de bench geïncubeerd.

Voeg na incubatie vijf µL van 5x laadbuffer toe aan de bindingsreacties. Laad 18 µL van elke reactie op een eerder bereide mini 6% polyacrylamide 0.5 XTBE-gel en laat deze twee uur lang lopen bij 100 volt. Nadat de gel is gelopen, wordt een geladen nylon membraan op de grootte van de gel gesneden en minimaal 10 minuten geweekt in 0.5 XTBE. Verwijder vervolgens de gel uit de cassette.

Snijd eventuele randen van de gel af en plaats de gel en het membraan tussen twee dikke filterpapieren gedrenkt in 0,5 XTBE. Plaats de gel en het membraan in een semi-dry blotting-apparaat en laat dit 30 minuten lopen bij 20 volt. Plaats het membraan vervolgens in een commercieel UV-licht crosslinker-instrument en stel de tijd in op drie minuten nadat de blot is ontwikkeld met een chemiluminescente detectiekit; leg het vast met een computer die is aangesloten op een camera uitgerust met een CCD.

Let bij de aanwezigheid van rr op een verschuiving in de mobiliteit van het DNA-substraat, wat aangeeft dat RR bindt aan het geteste DNA. Meng vervolgens twee tot drie micrograms gedeeld genomisch DNA met 0,5 picomoles DVU 3 0 2 3 in een gebufferde oplossing. Na incubatie van de reactie bij 25 °C gedurende 30 minuten, brengt u 10 µL hiervan over naar een 1,5 mL buisje en labelt u dit als input DNA.

Voeg 30 µL nikkel-NTA-agarosehars toe aan een microcentrifugebuis van 0,6 mL. Centrifugeer het monster bij 100 ×g gedurende één minuut om de hars na centrifugatie onderin de buis te verzamelen. Verwijder op dit punt het supernatant.

Voeg 100 µL wasbuffer toe en tik tegen de buis om de inhoud te mengen. Na centrifugatie bij 100 G gedurende twee minuten, wordt het supernatant verwijderd. Voeg de resterende 90 µL van de bindingsreactie toe aan de gewassen nikkel-NTA-hars.

Incubeer het monster vervolgens 30 minuten in een rotatie menger. Centrifugeer het monster na afloop gedurende twee minuten bij 100 Gs. Verwijder het supernatant en herhaal de wasstappen nog drie keer.

Voeg vervolgens 35 µL elutiebuffer toe aan de hars en meng door te vortexen. Incubeer het monster op het aanrecht bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Centrifugeer het monster en breng daarna de supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 mL en label deze als de eiwitgebonden DNA-fractie.

Voeg vervolgens 35 µL van de elutiebuffer toe aan het input-DNA na zuivering van de input- en eiwitgebonden DNA-fracties. Voeg 10 µL van elk toe aan aparte PCR-buisjes. Voeg vervolgens één µL van 10 x fragmentatiebuffer, twee µL library-preparatiebuffer en één µL library-stabilisatieluiding toe aan elk monster en meng de monsters goed door te vortexen.

Incubeer de monsters in een thermocycler bij 95 °C gedurende twee minuten. Koel de monsters na afloop af op ijs. Voeg vervolgens één µL library-preparatie-enzym toe aan de monsters en meng de inhoud door te pipetteren.

Incubeer de monsters in een thermocycler. Voeg na incubatie 47,5 µL water, 7,5 µL van een 10 x amplificatie-mastermix en vijf µL polymerase toe aan elke buis. Zodra de monsters zijn gemengd, worden ze verhit in een thermocycler.

Stel voor elk DNA-template qPCR-reacties in triplicaat op door een 1x mastermix voor te bereiden voor elke eerder ontworpen primerset, en verdeel vervolgens 18 µL van de mastermix per putje van een 96-well PCR-plaat. Verdun de geamplificeerde en gezuiverde input- en proteïnegebonden DNA-monsters met water tot 5 ng/µL en voeg 2 µL van elk monster toe aan de putjes. Sluit de plaat daarna af met een UltraClear qPCR-sealingfolie.

Centrifugeer de plaat 1 minuut lang bij 200 GS. Nadat de plaat in een real-time QPCR-machine is geplaatst, worden de volgende condities gebruikt om input-DNA te labelen met s si three en verrijkt DNA met sci five: meng 1 µg DNA met 40 µL S3 SCI-FI gelabelde negen-meren en vul het volume aan tot 80 µL met water. Denatureer vervolgens de monsters in een thermocycler 10 minuten lang bij 98 °C in het donker.

Zodra dit voltooid is, worden de monsters twee minuten snel afgekoeld op ijs. Voeg vervolgens twee microliters 3 prime, 5 prime exo polymerase, vijf millimolar deoxynucleotidetrifosfaat en acht microliters water toe aan elke reactie. Na het mengen worden de reacties twee uur bij 37 °C in het donker geïncubeerd in een thermocycler. Voeg op dit punt EDTA toe tot 50 millimolar om de reacties te stoppen en een natriumchloride-oplossing tot 0,5 molar.

Breng het daarna over naar 1,5 milliliter buisjes die 0,9 volume isopropanol bevatten, gevolgd door een incubatie van 10 minuten in het donker. Centrifugeer de monsters 10 minuten lang bij 12.000 GS. Voeg zes microgram van elk van het S3- en sci-fi-gelabelde DNA samen in een 1,5 milliliter buisje en droog deze onder vacuüm in een centrifuge op lage temperatuur in het donker door het centrifuge-deksel af te dekken indien dit transparant is.

Zodra de pellets droog zijn, suspenderen we deze in vijf µL water. Voeg vervolgens 13 µL van een eerder bereide 1x hybridisatie-oplossing mastermix toe aan de monsters na 15 seconden vortexen, en incubeer de monsters vijf minuten bij 95 °C in een droge bad. Haal de monsters uit het droge bad en plaats ze in een hybridisatiesysteem bij 42 °C totdat ze klaar zijn voor het laden.

Plaats vervolgens de eerder voorbereide mengplaat-assemblage in het hybridisatiesysteem. Laad 16 µL monster in de vulpoort. Sluit daarna de poorten af met een plakfolie en schakel het mengen in het systeem in. Laat dit 16 tot 20 uur hybridiseren bij 42 °C.

Schuif de mixer in een demontage-instrument en plaats dit in een schaal met warme buffer. Pel de mixer eraf terwijl u krachtig aan het demontage-instrument schudt. Plaats de slide in een houder met 50 milliliters wasbuffer één en schud krachtig gedurende twee minuten.

Herhaal vervolgens de vorige stap met 50 milliliters wasbuffer twee en 50 milliliters wasbuffer drie RRR DVU 3 0 2 3 shifted. De upstream regio van DVU 3 0 2 5 QPCR toonde aan dat de DVU 3 0 2 5 upstream regio is verrijkt in de eiwitgebonden fractie ten opzichte van het input DNA, wat aangeeft dat de bindingscondities geschikt waren voor DVU 3 0 2 3 DVU 0 0 1 3 was een negatieve controle. De bovenste vier pieken verkregen na DAP chipp-analyse werden gekozen als de meest waarschijnlijke targets waren DV 3 0 2 3.

Het positieve doelwit DVU 3 0 2 5 was de eerste piek met de hoogste score. Twee gentargets zijn twee andere ly-gecodeerde lactaatpermeases. Het vierde gentarget bevindt zich niet in een stroomopwaartse regio, maar in de intergene regio tussen twee convergent getranscribeerde genen met behulp van de stroomopwaartse regio's van targets verkregen door DAP chip meme werd gebruikt om een bindingsplaatsmotief te voorspellen.

Het motief werd verder gevalideerd door substituties aan te brengen in de geconserveerde basen binnen het motief, waardoor de bindingsverschuiving werd geëlimineerd. Het gevalideerde motief werd gebruikt om andere genomen van sulfaatreducerende bacteriën te scannen; loci met orthologen van DVU 3 0 2 3 werden gekozen als mogelijke gen-targets wanneer het motief zich in stroomopwaartse regio's van open leesramen bevond, gebruikmakend van motiefsequenties voorspeld voor autologe rs. Er werd een consensusbinding-motief gegenereerd, dat sterk leek op dat van Divo Garris Hilton Burrow.

Na het bekijken van deze video moet u een goed inzicht hebben in hoe de Daptive-methode kan worden gebruikt om gentargets voor regulatoire eiwitten te bepalen. Deze methode kan worden toegepast om de bindingsgrootte van elk regulatoir eiwit te analyseren, mits het eiwit gezuiverd kan worden en de genoomsequentie bekend is.