Name: In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer een 3D-kweekmethode voor alvleesklierorganogenese van embryonale muizenprogenitorcellen. Deze techniek maakt expansie, differentiatie en zelforganisatie tot vertakte organoïden mogelijk voor in vivo-achtige studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door achtereenvolgens een NCCR Frontiers in Genetics pilot-award, de Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 en Grant 12-126875 van Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. De auteurs danken de Spagnoli lab voor het hosten van de video-opnamen.

Dit protocol heeft als doel om te groeien pancreas organoids afgeleid van muizen E10.5 gedissocieerde epitheliale cellen de alvleesklier. Het protocol vereist ethische goedkeuring voor dierproeven. 1. Dissectie van Dorsale Alvleesklierkanker Bud uit E10.5 muizenembryo&#39;s <ol><li> Sacrifice getimed-zwangere muizen op embryonale dag (E) 10.5, opent de buik met een schaar, verwijder de twee baarmoederhoorns en leg ze in een schotel van 10 cm Petri gevuld met koud fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) of Dulbecco gemodificeerd essentieel medium (DMEM) op ijs gehouden. De totale experiment van het offer naar cel zaaien gebeurt in 60-90 min naar cel schade te voorkomen. </li><li> Scheid de baarmoeder in afzonderlijke embryo segmenten met behulp van een klein schaartje. Transfer een embryo tot een 35 mm petrischaal met koude PBS en visualiseren onder een dissectie microscoop met verlichting van bovenaf. Met dissectie pincet verwijder de omliggende spieren, decidua en dooier sac en het embryo bloot. Plaats de embryo terug in koude DMEM medium. Embryo&#39;s kunnen gemakkelijk worden overgedragen met behulp van een 3 ml plastic overdracht pipet / druppelaar. Isoleer elk individu embryo soortgelijke wijze alvorens verder. </li><li> Plaats een embryo in een schone 35 mm petrischaal in PBS. <ol><li> Gebruik dunne tang (0,05 mm breed) aan de voorpoot te verwijderen. Steek voorzichtig de tang in de opening om het spijsverteringskanaal van het ruggenmerg (Figuur 1) los. Optioneel: Als u meer gemakkelijk zien de maag, verwijder het bovenlichaam van het embryo, tot aan het hart en de staart gebied onder de dooier stengel. </li><li> Zoek de maag, lever en darm. De tang isoleren het maagdarmkanaal van de maag naar de darmen en deze in koude DMEM op ijs (figuur 1). De dorsale pancreas knop wordt dorsaal, posterior naar de maag (figuur 1) bevestigd. </li><li> Isoleer elk individu maagdarmkanaal in een similar manier voordat u verder gaat. Wanneer de embryo&#39;s moeten genotyperen, verzamel de staart bij de dissectie en houdt elk individu maagdarmkanaal in een andere put in een 24-wells plaat met koud DMEM op ijs. </li></ol></li><li> Plaats een maagdarmkanaal in een schone 35 mm petrischaal in koud PBS. Nu gebruik verlichting van onderen in heldere veld te visualiseren en te ontleden de dorsale pancreas knop onder de dissectie microscoop. Deze voorwaarden zullen de visualisatie van volumes te optimaliseren. Met elektrolytisch geslepen wolfraam naalden of 20 G injectienaalden, isoleren de pancreas kiem met zo weinig mogelijk mesenchym in het epitheel (figuur 1). <ol><li> Breng de geïsoleerde kiem in een petrischaaltje met een koude dispase-oplossing (1,25 mg / ml) gedurende 2-3 minuten. Vanaf dit punt, kan de overdracht meeste gemakkelijk worden gedaan met vlam getrokken 50 pl glas haarvaten verbonden met een mond-gecontroleerde flexibele buis. Als alternatief, maar met meer risk van het verliezen van de knop, gebruik dan een 10 ul automatische pipet (Pipetman) met de juiste plastic tips. </li><li> Voer alvleesklier bud aspiratie en ejectie onder microscopische controle. Zet de alvleesklier kiem terug in PBS. Verder reinigen van de geïsoleerde alvleesklier kiem van het mesenchym met de naalden en behoedzame aspiratie met behulp van de glazen capillair (figuur 1). </li><li> Als de hele mesenchym wordt verwijderd, spoel de alvleesklier kiem in koude PBS; breng elke knop te koud DMEM in individuele putten (60-en mini-trays gevuld met 10 ul van koude DMEM). Het is belangrijk niet te vergeten de mesenchym in dispase verwijderen, die het weefsel zeer kleverig maakt. </li></ol></li></ol> 2. Plating en cultuur van Dispersed Cells <ol><li> Breng de ontleed epitheel van alle embryo&#39;s met een vlam getrokken glas capillair in kegelvormige putjes van 60-en mini-trays gevuld met 10 ul PBS voor het spoelen. <ol><li> Breng de kiem in 10 ul van trypsine 0,05% eennd laten incuberen bij 37 ° C gedurende 4 minuten. Inactivatie van het trypsine in door de knop in een well 10 pi DMEM + 10% foetaal kalfsserum (FCS). </li><li> Distantiëren de celsuspensie door aspiratie door een dunne capillaire getrokken met een pipet trekker. Het is belangrijk om luchtbellen te voorkomen in dit stadium tijdens en neer te pipetteren aan de cellen dissociëren. Pancreas organoids optimaal gaan van kleine groepen van 5-15 cellen en derhalve gedeeltelijke dissociatie aanbevolen (figuur 1). </li></ol></li><li> Verzamel de cellen van diverse embryo&#39;s in een eppendorfbuisje om verschillen door individuele verwerkingseenheden minimaliseren. Verdun de celsuspensie in gekoeld Matrigel bij een 1:03 verhouding. Aliquot dit mengsel aan de 96-well plaat, 8 ul / putje in een plaat of geoptimaliseerd voor afbeelden (zie hieronder). </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 5 min, waardoor de Matrigel dikker. Vul het putten met 70 ul van medium bij uitstek (organoïde of sfeer, zie Tables 1 en 2) en laat in een bevochtigde omgeving met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C. </li><li> Vervang het medium elke 4 e dag. Toezicht houden op de groeiende alvleesklier kolonies dagelijks en documenteren van het proces door beeldvorming. </li><li> Kleine moleculen of eiwitten van belang kan aan het medium in dit stadium worden toegevoegd voor interferentie experimenten, zoals eerder gemeld 28. </li></ol> Tabel 1: organoïde medium. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Stofnaam </td><td> Stock Concentratie </td><td> Concentratie in eindmedium </td><td> Volume op voorraad </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 gl </td></tr><tr><td> KnockOut Serum vervanging (supplement) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> 14.3 M </td&gt; <td> 0,1 mM </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Forbolmyristaatacetaat (PMA) </td><td> 16 uM </td><td> 16 nM </td><td> 5 pi </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK inhibitor) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50 ug / ml </td><td> 25 ng / ml </td><td> 2,5 pl </td></tr><tr><td> Recombinant Human R-spondin 1 </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> - Of - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Recombinant Mouse R-spondin 1 </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> Recombinant humaan FGF1 (aFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 25 ug / ml </td><td> 1.25 pi </td></tr><tr><td> Heparine (Liquemin) </td><td> 2500 U / ml </td><td> 2,5 U / ml </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> Recombinant Human FGF10 </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td> 5 pi </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25 pi </td></tr><tr><td> Totaal </td><td></td><td></td><td> 5000 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Sphere medium. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Stofnaam </td><td> Stock Concentratie </td><td> Concentratie in eindmedium </td><td> Volume op voorraad </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 gl </td></tr><tr><td> B27 x50 (supplement) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> Recombinant humaan FGF2 (bFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 64 ng / ml </td><td> 3.2 pl </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK inhibitor) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4.845,8 pi </td></tr><tr><td> Totaal </td><td></td><td></td><td> 5000 pi </td></tr></tbody></table> 3. Beeldvorming van de progressie van organoïde Development <ol><li> Afbeelding organoids dagelijks of door time lapse microscopie met behulp van een fluorescerende time-lapse microscoop. Voor time lapse imaging, gebruik een XY (Z) geautomatiseerde omgekeerde fluorescentiemicroscoop. </li><li> Borg kleine druppeltjes van 3 ui in 4-well platen of glas-bodemplaten gevuld met 2-5 ml medium. Beeld met een 10x lange afstand doel. Opmerking: Transgene muizen die fluorescerende tracers worden gebruikt. Film 1 toont bijvoorbeeld de eerste uitbreiding van organoids van Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + muizen 4. De nucleaire GFP kan de gebruiker cellen volgen als afzonderlijke objecten maar vergelijkbare principes kunnen worden toegepast op cellen volgen met membraan fluorescentie dergelijkeals mT / mG muizen 29. </li><li> Start time-lapse imaging 3 uur na het zaaien van de cellen om zich te concentreren afwijkingen te voorkomen en stel de software regelen van automatisering tot 1 foto / uur duren voor 3 of meer dagen bij handmatig gedefinieerde posities. Voor iedere plaats verkrijgen van een differentiële interferentie contrast beeld (DIC) en het GFP-signaal rapporteert fluorescente merker expressie. </li></ol> 4. Herstel van Organoids voor Histologie <ol><li> Plaats de 96-well plaat op ijs en verwijder het medium, te vervangen door ijskoud PBS. Dit depolymeriseert gedeeltelijk Matrigel. </li><li> Zuig elke afzonderlijke organoïde, de omringende Matrigel verwijderen met een 1.000 III tip om de architectuur niet verstoren. Breng elke organoïde om een ​​goed met ijskoude PBS. Houd de plaat op het ijs. Directe fixatie in Matrigel is mogelijk. </li><li> Bevestig de organoïde gedurende 15 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA), cryopreserve in sucrose en insluiten in gelatine. Verwerk elkorganoïde voor cryosectioning en histologie zoals eerder beschreven (Johansson et al., 2007). 4. </li></ol> Herstel van Organoids voor PCR en Biochemie 5. <ol><li> Plaats de 96-well plaat op ijs en verwijder het medium. Voeg 60 ul van RNAlater per goed in om te stabiliseren en te beschermen cellulaire RNA. </li><li> Verstoren de gel in elk putje mechanisch door het gedeeltelijk depolymeriseren het op ijs. Ofwel herstellen individuele organoids met behulp van een 1000 ui tip om de algemene architectuur niet verstoren of de gehele goed (met Matrigel) herstellen door het verstoren van de gel mechanisch met een 200 ul tip. Gebruik een 1000 pi tip om de inhoud goed te zetten in een RNAse vrij-niet-kleverige Eppendorf buis op ijs bewaard. </li><li> Was de putjes met 60 ul RNAlater en voeg de resterende inhoud aan dezelfde Eppendorf buis. </li><li> Draai de buizen gedurende 5 min bij 500-1000 x g bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, waardoor er slechts 20-30 ulvan RNAlater in de buis met de pellet. Voor biochemie monsters worden zo droog mogelijk. </li><li> Heeft monsters in RNAlater niet onmiddellijk te bevriezen; bewaren bij 4 ° CO / N (om RNAlater grondig doordringen in de weefsels). Het weefsel kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor lange termijn opslag en later worden verwerkt voor weefselverstoring en productie van kleine hoeveelheden RNA. </li></ol>

<ol><li>Pagliuca, F. W., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+functional+beta-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a functional beta-cell.</a> Development. 140, 2472-2483 (2013).</li>
<li>Percival, A. C., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li>
<li>Attali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+beta-cell+differentiation+by+the+pancreatic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme.</a> Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).</li>
<li>Johansson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+neurogenin3+activity+in+pancreas+progenitors+reveals+competence+windows+for+the+generation+of+different+endocrine+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types.</a> Dev Cell. 12, 457-465 (2007).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).</li>
<li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Dev Biol. 4, 242-255 (1962).</li>
<li>Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follistatin+regulates+the+relative+proportions+of+endocrine+versus+exocrine+tissue+during+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development.</a> Development. 125, 1017-1024 (1998).</li>
<li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , 3979(2012).</li>
<li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).</li>
<li>Hope, K., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+interrogation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal interrogation of stem cells.</a> Nat Methods. 8, 36-40 (2011).</li>
<li>Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+markers+of+fetal+pancreatic+epithelium+permit+prospective+isolation+of+islet+progenitor+cells+by+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Sugiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+pancreas+development+from+purified+progenitor+cells+reveals+genes+essential+for+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. , (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. , (2009).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15, 701-706 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
<li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Grootschalige productie van functionele beta-cellen in vitro nog ineffectief 1. In deze uitdagende context kan ontwikkelingsbiologie studies helpen ontcijferen exacte signalen die vereist zijn voor de differentiatie van functionele beta-cellen. Dit protocol maakt het onderhoud, groei en differentiatie van embryonale pancreatische voorlopercellen in vitro. Dit omvat de vorming van insuline producerende beta-cellen die geen co-expressie andere endocriene hormonen, hebben hoge niveaus van Pdx1,...

Orgelcultuur biedt een bruikbaar model dat de kloof tussen het complex, maar zeer relevante in-vivo-onderzoek en de handige maar bij benadering simulatie van cellijn modellen overbrugt. Bij de pancreas, is er geen cellijn volkomen gelijkwaardig pancreas voorlopercellen hoewel er getransformeerde cellijnen simuleren endocriene en exocriene cellen. De volwassen gehele alvleesklier kan niet worden gekweekt; endocriene geïsoleerde eilandjes kunnen worden gehandhaafd gedurende enkele weken zonder celproliferatie en weefselplakken kan in vitro worden gedurende enkele uren 5. Embryonale pancreas cultuur is op grote schaal gebruikt niet alleen om de ontwikkeling ervan te bestuderen, maar ook om epitheliale-mesenchymale interacties 4,6,7 onderzoeken, op de foto verwerkt 8 of chemisch bemoeien met hen 9. Twee orgelcultuur methoden worden voornamelijk gebruikt: de eerste bestaat uit het kweken van alvleesklier knoppen op fibronectine gecoate platen 2, dat is Convenient voor grafische doeleinden; de tweede optie is om de cultuur van de organen filters bij de lucht-water grensvlak 3,4 die het beste bewaart morfogenese. Hoewel nuttig, deze methoden leiden tot een zekere mate van afvlakking; de uitbreiding van voorlopercellen is zeer beperkt in vergelijking met de normale ontwikkeling en uitgangspopulatie complex omvattende alle typen pancreatische cellen en mesenchymale cellen. De mogelijkheid om de cultuur en uitbreiden verspreide primaire cellen is waardevol voor lineage relaties bestuderen en ontdekken de intrinsieke eigenschappen van geïsoleerde celtypen 10. Sugiyama et al.. 11 kon pancreas voorlopercellen en endocriene voorouders dat een aantal functionele tekens bewaard gedurende 3-5 dagen in cultuur op de feeder lagen behouden. Pancreatospheres, verwant aan neurospheres 12 en mammospheres 13, zijn uitgebreid van volwassen eilandjes en ductale cellen, hoewel de aard van de voorlopers / stamcellendat deze sferen te genereren is niet duidelijk. Bovendien, in tegenstelling fysiologische ontwikkeling, de pancreatospheres bevatte neuronen 14,15. Bollen werden onlangs ook uit embryonale pancreas voorlopercellen 16,17 en regenererende pancreata 18 met goede voorlopercellen expansie en de daaropvolgende differentiatie, maar niet om morfogenese recapituleren. 3D-modellen van verspreide en vaak gedefinieerd cellen die zichzelf organiseren in geminiaturiseerde organen onlangs bloeide en simuleren van de ontwikkeling of volwassene omzet van meerdere organen zoals de darm 19,20, de maag 21, lever 22, de prostaat 23 en de luchtpijp 24. In sommige gevallen zijn ontwikkelings morfogenese en differentiatie zijn samengevat in 3D van ES-cellen, zoals bij optische koppen 25, 26 darm of de hersenen 27. Hier hebben we desCribe een methode om gedissocieerde multipotente pancreas voorlopercellen uit te breiden in een 3D Matrigel steiger waar ze kunnen differentiëren en zichzelf te organiseren.

<table><tbody><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum replacement (supplement)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>Voorraad bewaard op 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td><td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>Voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>Voorraad bewaard op -20 &deg;C. Let op! Stabiliteit/bron is een frequente bron van problemen.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>Voorraad bewaard op -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human R-spondin 1</td><td>R&amp;D</td><td>4645-RS-025/CF</td><td>Voorraad bewaard op -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-spondin 1</td><td>R&amp;D</td><td>3474-RS-050</td><td>Voorraad bewaard op -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF1 (aFGF)</td><td>R&amp;D</td><td>232-FA-025</td><td>Voorraad bewaard op -80 &deg;C - niet opnemen om de productie van bètacellen te verhogen</td></tr><tr><td>Heparine (Liquemin)</td><td>Drossapharm</td><td></td><td>Voorraad bewaard op 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF10</td><td>R&amp;D</td><td>345-FG-025</td><td>Voorraad bewaard op -80 &deg;C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>B27 x50 (supplement)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF2 (bFGF)</td><td>R&amp;D</td><td>233-FB-025</td><td>Voorraad bewaard op -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Trypsin 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Voorraad bewaard op 4 &deg;C</td></tr><tr><td>RNAlater - RNA stabiliserend reagens</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4818-2MG</td><td>Werkconcentratie: 1,25 mg/ml. Voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>BSA voor reconstitutie</td><td>Milipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td><td>Voor reconstitutie van cytokinen&nbsp; - voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>Voorraad bewaard op -20 &deg;C</td></tr><tr><td>60-well MicroWell trays</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>95-well plates F bottom</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>Glas bottom plates</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Disposal glass micropipettes</td><td>Blaubrand</td><td>708745</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td>Cell&#174; beeldvormingsstation (gemotoriseerde omgekeerde Olympus IX81 stand) uitgerust met een Hamamatsu ORCA ER B7W camera en de Ludin Cube en Box. 
Leica DMI6000 B stand omgeven met een Ludin Cube en Box, uitgerust met een Leica DFC365 FX camera en de AF6000 Expert/Matrix software commando-interface.</td></tr><tr><td>Objectief</td><td></td><td></td><td>Olympus UPLAN FL NA 0.30 lucht 9.50 mm 10X lange afstand; 
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 lucht 11.0 mm 10X lange afstand</td></tr></tbody></table>

in vitro pancreas organogenese van dispersed muis embryonale progenitors

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

De alvleesklier is een essentieel orgaan dat glucosehomeostase reguleert en spijsverteringsenzymen afscheidt. Onderzoek naar embryogenese van de alvleesklier heeft geleid tot de ontwikkeling van protocollen om pancreascellen uit stamcellen te produceren 1. Het hele embryonale orgaan kan worden gekweekt in meerdere ontwikkelingsstadia 2-4. Deze kweekmethoden zijn nuttig gebleken voor het testen van medicijnen en om ontwikkelingsprocessen te beeldhouwen. De expansie van het orgaan is echter zeer beperkt en morfogenese wordt niet getrouw nagebootst omdat het orgaan afvlakt. 
We stellen driedimensionale (3D) kweekcondities voor die de efficiënte expansie van gedissocieerde muizen embryonale pancreasprogenitors mogelijk maken. Door de samenstelling van het kweekmedium te manipuleren, is het mogelijk om holle bollen te genereren, die voornamelijk bestaan uit pancreasprogenitors die zich in hun oorspronkelijke staat uitbreiden, of complexe organoïden die zich ontwikkelen tot meer volwassen uitbreidende progenitors en die differentiëren in endocriene, acinale en ductale cellen en die spontaan zelf organiseren om de embryonale pancreas te gelijken. 
We tonen hier dat het in vitro proces veel aspecten van de natuurlijke ontwikkeling van de pancreas naspeelt. Dit kweeksysteem is geschikt om te onderzoeken hoe cellen samenwerken om een orgaan te vormen door de initiële complexiteit terug te brengen tot een paar progenitors. Het is een model dat de 3D-architectuur van de pancreas reproduceert en dat daarom nuttig is om morfogenese te bestuderen, inclusief polarisatie van epitheliale structuren en vertakking. Het is ook geschikt om de reactie op mechanische signalen van de niche te evalueren, zoals stijfheid en de effecten op de tensegriteit van cellen.

E10.5 dorsale pancreas voorlopercellen los en gezaaid in 3D Matrigel recapituleren ontwikkeling van de pancreas. Voorouders kan heel eenvoudig worden gevolgd met fluorescerende verslaggevers. In ons geval gebruikten we een transgene muis die een nucleaire GFP-eiwit gecontroleerd door Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Film 1) in de afwezigheid van tamoxifen en dus zonder activering Neurog3 4 (figuur 2) uitdrukt. Met het organoïde me...

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Het algemene doel van deze procedure is het expanderen van geassocieerde multipotente pancreatische progenitorcellen in een 3D Matrigel-steiger, waar ze kunnen differentiëren en zichzelf kunnen organiseren. Dit wordt bereikt door eerst de pancreas te isoleren uit muisembryo's van embryonale dag 10.5. De tweede stap is het verwijderen van het mesenchym en het dissocieren van het epitheel tot enkelvoudige cellen en kleine klompjes.De laatste stap is om de cellen in matrigel te suspenderen en de gepolymeriseerde gel te incuberen voor expansie. Dit leidt uiteindelijk tot zelforganiserende vertakte pancreasorganoïden, vergelijkbaar met de embryonale pancreas van de muis, die live of aan het eindpunt via microscopie gevisualiseerd kunnen worden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het explant van de gehele pancreas, is dat men start vanuit een goed gedefinieerde en minder complexe celpopulatie.Pancreatische progenitorcellen worden beter behouden in 3D- dan in 2D-celculturen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele kritische vragen binnen het vakgebied, zoals cel-celinteracties of de interactie van cellen met de matrix. D

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een drie-dimensionale Monogene assay die het mogelijk maakt de pancreas-achtige voorouders om te differentiëren in de insuline-expressie kolonies is beschreven. Deze methode maakt gebruik van semi-vaste media met methylcellulose, Matrigel en groeifactoren, waarin de afzonderlijke progenitors prolifereren en...

Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

De huidige studie beschrijft een gerichte aanpak van differentiatie in het induceren van de alvleesklier differentiatie van humane embryonale stamcellen. Van grote betekenis is de bevinding dat endotheelcel co-cultuur bemiddelt rijping van menselijke embryonale stamcellen afkomstig van de pancreas voorlopercellen in insuline tot expressie brengen.

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

We beschrijven een werkwijze voor isolatie, cultuur en manipulatie van muis embryonale pancreas. Dit is een...

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

Een protocol te isoleren, cultuur en imago eilandje cel clusters (ICC), afkomstig van menselijke foetale pancreas cellen wordt beschreven. De methode beschrijft de stappen die nodig zijn om ICC te genereren uit weefsel, cultuur als monolagen of in suspensie als aggregaten, en voor markers van proliferatie en alvleesklier cel beslissingen over het lot.

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) cellen voor de generatie van de alvleesklier lineages op basis van de niet-kolonie type enkelgelaagde groei van afzonderlijke cellen los. Deze methode is geschikt voor het produceren van homogene hPSC-afgeleide cellen, genetische manipulatie en screening.

Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1+ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

Dit protocol presenteert een vergelijking tussen twee verschillende inductieprotocollen voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) naar pancreaslijnen in vitro:het integratieve protocol en het niet-integratieve protocol. Het integratieve protocol genereert meer insulineproducerende cellen (IPC's).

In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methode om de co-expressie van PDX1- en NKX6.1-transcriptiefactoren in pancreasvoorlopercellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in planaire monolagen te verhogen. Dit wordt bereikt door de verse matrix aan te vullen, de celdichtheid te manipuleren en de endodermale cellen te dissociëren.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Leer een 3D-kweekmethode voor alvleesklierorganogenese van embryonale muizenprogenitorcellen. Deze techniek maakt expansie, differentiatie en zelforganisatie tot vertakte organoïden mogelijk voor in vivo-achtige studies.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

Meer video's verkennen