Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in

Het algemene doel van deze procedure is om de visuele functie van kikkervisjes te testen door de hoeveelheid tijd vast te leggen die het dier doorbrengt op de helft van de testtank die zwart is gekleurd. Dit wordt bereikt door kikkervisjes eerst op te kweeken tot stadia 45 tot 50. De tweede stap is het opstellen van een tank die voor de helft zwart en voor de helft wit is, samen met een camera voor de gedragsanalyse.

Plaats vervolgens een tweede tank met een kikkervisje in de buitenste tank. Registreer voor elk kikkervisje het door visie gestuurde gedrag terwijl de achtergrond in de omgeving wordt gewijzigd. De laatste stap is het uitvoeren van een retinale exsudatie bij de kikkervisjes, om vervolgens de gedragsassay te herhalen.

Uiteindelijk worden de gegevens van deze eenvoudige, goedkope assay gebruikt om aan te tonen dat de kikkervisjes, bij tests van de fototopische visus, een voorkeur hebben om aan één zijde van het aquarium te zwemmen boven de andere. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van andere technieken, zoals de optokinetische respons of de tail-flip assay, is dat het een goedkope, eenvoudige methode is die gebruikmaakt van apparatuur die in de meeste laboratoria gemakkelijk beschikbaar is. Om de kikkervisjes voor te bereiden, verkrijgt men eerst bevruchte xenopus-embryo's en plaatst men deze in 60 millimeter Petri-schalen met 50 µg/mL Marks' modified Ringer's of MMR, verdund met een factor 10.

Plaats blastula- tot neurale-plaatstadium embryo's in gentamicine-antibioticum. Stadia twee tot 15 bij 18 °C in de Petrischalen. Zodra de embryo's een nieuw cup-favorstadium van ongeveer 27 tot 30 bereiken, worden ze overgezet naar 0,1 XMMR zonder antibiotica om de groei van darmbacteriën mogelijk te maken.

Wanneer de kikkervisjes rond stadium 45 het voedingsstadium bereiken, verplaatst u ze naar Petri-schalen van 100 millimeter met 0.1 XMMR. Voed ze de volgende dag met supernatant van brandnetelpoeder. Na één week in de Petri-schaal van 100 millimeter vult u een aquarium van een halve gallon met kikkervoorwater.

Verplaats de dieren naar het aquarium en zet het voedingsschema met het supernatant van brandnetelpoeder voort, maar ververs het water slechts twee tot drie keer per week. Wanneer de dieren in aquaria van een halve gallon verblijven, worden ze gehouden in een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker, waarbij de lichten om 6:00 uur aangaan. Plaats het aquarium van een halve gallon met de proefpersonen voorafgaand aan de test gedurende ten minste 12 uur overnacht op een wit oppervlak. De gedragsanalyse dient te worden uitgevoerd in een rustige ruimte met weinig verkeer en standaard fluorescentieverlichting.

Bereid twee in elkaar passende testtanks van een halve gallon voor op de buitenhoeken van wat de binnenste tank zal worden. Gebruik een Sharpie om de waterlijn vijf centimeter boven de bodem te markeren. Identificeer daarnaast eventuele inkepingen aan de binnenzijde van de binnenste tank.

Vul deze met een inerte verbinding om te voorkomen dat kikkervisjes erin blijven hangen. Richt de aandacht nu op het tweede buitenste aquarium. Voor de volgende stap zijn zwarte isolatietape en wit vloeipapier nodig.

Gebruik de tape om de buitenkant van één helft van het reservoir te bedekken en het vloeipapier om de buitenkant van de andere helft te bedekken, zoals hier wordt getoond. Zodra de reservoirs zijn voorbereid, stelt u een inoculatie-draaischijf op en plaatst u de geneste reservoirs hierop. Positioneer een statief en een webcam zodanig dat de camera het interieur van de reservoirs van bovenaf kan filmen.

Sluit de webcam aan op een computer met software voor video-opname en weergave. Zet de camera aan en bereid u voor om een nieuwe video-opname te maken. Drapeer vervolgens een lichtgewicht katoenen doek over de camera en de tanks.

Om externe prikkels voor de kikkervisjes te verminderen, gebruikt u een luminantiemeter en controleert u of de luminantie onder de doek tussen de 35 en 50 candles per square meter ligt. Start de gedragsassay door de binnenste testtank te pakken. Vul deze met kikkerwater tot de markering van vijf centimeter.

Gebruik een net om een dier vanuit de container van een halve gallon over te brengen naar de binnenste testtank bij de computer. Zorg ervoor dat de opnamesoftware is geopend en het testgebied vastlegt voor de dossiervorming. Noteer de naam van het dier, de datum en het tijdstip op een stuk papier.

Plaats dit onder de camera voor de opname. Wanneer dit is gebeurd, stelt u een timer in op twee minuten. Richt vervolgens het buitenreservoir op de draaischijf, zodat de zwarte zijde aan de rechterkant bevindt.

Plaats nu de testtank in de buitenste tank. Sluit in het opnamegebied het gordijn en gebruik het computerscherm om de oriëntatie van de buitenste tank te controleren. Controleer of de video wordt opgenomen en start de timer.

Wanneer de timer afgaat, laat u het afdekdoek op zijn plaats en verwijdert u de binnenste testtank. Draai vervolgens de buitenste tank 180 graden, zodat de zwarte zijde nu aan de linkerkant zit. Plaats de testtank terug in de buitenste tank en start de timer voor twee minuten.

Verwijder opnieuw de binnentank. Draai de buentank 180 graden en plaats de binnentank elke twee minuten opnieuw, voor een totaal van 10 keer. Stop de video-opname wanneer dit is voltooid.

Plaats de kikkervisje terug in de tank van een halve gallon. Bereid een microscoop voor om de retinol ex sodomy uit te voeren. Vul een Petri-schaal van 60 millimeter met 1%aros gesmolten in 0,1 XMMR en laat dit stollen.

Verwijder een klein rechthoekig stukje van de agar ter grootte van de kikkervisje. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, haalt u het proefdier op en plaatst u het in 0,02% Trica. Ga verder wanneer het dier niet meer reageert op een knijp in de staart met een pincet nummer drie.

Breng het dier vervolgens over naar de schaal. Plaats de Petrischaal vervolgens op de microscoop. Maak u klaar om het dier aan één zijde met een pincet te fixeren.

Gebruik aan de tegenovergestelde zijde een naald van 25 gauge om de huid achter de dorsale regio van het oog in een hoek van 45 graden door te prikken; reik voorzichtig met een pincet nummer vijf in het gat en knip de oogzenuw door, waarbij de aangrenzende ader wordt vermeden. Klap de zenuw opzij en trek de pincet na de ingreep terug. Laat het dier herstellen door het in een Petrischaal van 100 millimeter te plaatsen met 0.7 XMMR en 50 µg/mL.

Gentamicine gedurende 20 minuten. Breng de kikkervisje daarna over naar een herstelbak met kikkerwater. Plaats de bak op een wit oppervlak ter voorbereiding op de test.

Laat het dier een nacht rusten. Gebruik de volgende ochtend de gedragstest om de visuele functie te testen. Deze video toont representatieve gegevens voor het experiment.

Links staan de dieren vóór de operatie; rechts staan dezelfde dieren nadat de retinale axonen van beide ogen zijn doorgesneden. Dit wordt aangegeven door het schema in de onderste hoeken. Het water werd bewogen om aan te tonen dat er niets is toegevoegd om de dieren af te stoten van de zwarte zijde of aan te trekken naar de witte zijde.

De tadpoles vóór de operatie reageren in minder dan 30 seconden op de achtergrondkleur, terwijl de blinde tadpoles doelloos door het aquarium zwemmen. Deze grafiek toont het percentage van de tijd dat een enkel dier in de witte en zwarte regio's doorbracht onder drie condities. Eerst werd het dier waargenomen met de assay voordat er enige operatie plaatsvond.

Op twee opeenvolgende dagen nadat de rechter oogzenuw was doorgesneden, werd het gedrag gedurende twee testdagen geobserveerd. Tot slot volgden, nadat beide oogzenuwen waren doorgesneden, nog twee dagen van observatie met de assay. Het dier bracht meer dagen door aan de witte zijde van het aquarium wanneer ten minste één oogzenuw intact was.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u het gezichtsvermogen van kikkervisjes kunt testen met behulp van eenvoudige reagentia en apparatuur die in de meeste kikkerslaboratoria te vinden zijn. Veel succes met uw experimenten.