Name: Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer een eenvoudige gedragsassay om visuele functie te testen bij Xenopus laevis-kikkervisjes. Deze methode meet de tijd die dieren doorbrengen op de witte of zwarte zijde van een tank.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ), en EY019517 (ASV). Dit werk werd ondersteund door het onderzoek ter voorkoming van Blindheid onbeperkte subsidie ​​aan de Oogheelkunde afdeling en de Leeuwen van Central New York. We willen ook graag onze dierlijke technicus, Matthew Mellini, bedanken voor zijn uitstekende verzorging van de dieren en voor de intensivering in de hoofdrol in deze video.

Animal Care De Xenopus laevis kikkervisjes die in deze studie werden gekweekt, gehouden en behandeld volgens de procedures door Upstate Medical University IACUC en de Gids goedgekeurd voor de Zorg en gebruik van proefdieren. . 1 Pre-gedrag instellen: Kikkervisjes <ol><li> Verkrijgen bevruchte Xenopus embryo van een commercieel beschikbare bron of in vitro bevruchten eicellen, zoals eerder beschreven 6. </li><li> Plaats blastula om neurale plaat stadium embryo&#39;s bij 18 ˚ C in 60 mm platen met 0,1 x MMR [10 X Marc&#39;s Modified Ringer&#39;s (MMR) oplossing voorraad (10 mM MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, pH 7,5, geautoclaveerd en opgeslagen bij kamertemperatuur)] met 50 ug / ml gentamicine antibioticum. Wijzig 0,1 x MMR elke dag en verwijder alle dode embryo&#39;s. </li><li> Zodra het embryo bereiken Nieuwkoop en Faber stadium ~ 27-30 juli, schakelen the embryo&#39;s in 0,1 x MMR zonder antibioticum darm bacteriële groei mogelijk te maken. </li><li> Groeien de kikkervisjes tot ze de voeding stadium (fase 45) te bereiken en hen te verplaatsen naar 100 mm gerechten Petri gevuld met 0,1 x MMR. Voed ze brandnetel poeder supernatant om de andere dag voor een week, het veranderen van de 0,1 x MMR op de tussenliggende dag. </li><li> Na een week in de 100 mm petrischaal, verplaats dieren halve liter tanks gevuld met kikker water [0,5 g / L direct oceaan en 2 mM natriumfosfaat dibasisch (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Voed ze zoals in stap 2.4, maar verander alleen water 2-3 keer per week als het water troebel. Handhaving van de dieren in een 12 uur light/12 donker licht cyclus met de lichten aanzetten om 06:00. </li><li> Plaats de halve liter tank met de proefpersonen op een witte ondergrond, zoals een lab bankje underpad, ten minste 12 uur O / N, voorafgaand aan het testen. </li><li> Test kikkervisjes in stadium 45 tot 50 zoals beschreven in stap 3 hieronder. </li></ol> . 2 Pre-gedrag instellen: Equipment <ol><li> Vernietiging van een deel van het laboratorium voor het gedrag assay. Het moet in een rustige, weinig verkeer met standaard TL-verlichting. </li><li> Bereid het testen tanks voor de dieren. De geneste halve gallon testen tanks zijn samengesteld uit twee delen: een binnenste tank die water en kikkervisjes zal houden; en een buitenste tank met de visuele stimulus. <ol><li> Voor de binnentank, een kleine markering op de buitenhoeken met een sharpie, 5 cm van de bodem; dit is de waterlijn (figuur 1A, groene stippellijn). </li><li> Ook voor de binnentank, vul de Divets in de tank (op de hoeken en het midden) met een inerte stof, zoals Sylgard elastomeer. OPMERKING: De kikkervisjes zal blijven hangen in deze gebieden als ze niet ingevuld </li><li> Voor de buitentank dekken precies een helft van de buitenkant van een tank met zwarte elektrische tape en de andere helft met de witte tissuepapier Figuur 1B. </li></ol></li><li> Plaats de tanks op hetinenten draaitafel. </li><li> Stel de webcam / statief zodat het boven het testen tanks. Stel de camera visualisatie van het testgebied toe, zoals getoond in figuur 1C. </li><li> Sluit de webcam aan op een computer met QuickTime Player geïnstalleerd 5. Zet de camera aan. In QuickTime Player, onder File, selecteer &#39;Nieuw voor filmopname.&#39; Het gedrag test setup zal zichtbaar zijn op de computer meteen. </li><li> Draperen een lichtgewicht katoenen doek over de gehele setup om externe stimuli die kikkervisje gedrag van invloed kunnen verminderen, evenals, verminderen gereflecteerd licht op het oppervlak van het water. </li><li> Zorg ervoor dat de luminantie onder de doek maatregelen tussen 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Gedrag Assay <ol><li> Vul het binnenste testen tank om de 5 cm water merk in stap 1.2.1 met kikker water. </li><li> Met behulp van een kleine netto-, beweeg het dier in het binnenste testen tank. </li><li> Open QuickTime software op de computer en met behulp van de buitenste tank als een gids, zorg ervoor dat de camera in staat om te visualiseren en registreren de testafdeling. </li><li> Schrijf de naam dier, datum en tijd op een stuk papier en opnemen met de camera. </li><li> Plaats het proefvat in de buitenste tank met de zwarte kant van de tank naar rechts Figuur 2. </li><li> Start het opnemen van de film onmiddellijk na het regelen van de tank en de ingestelde timer gedurende 2 minuten. </li><li> Als de timer piept, verwijder de binnenste testtank, draait de buitenste tank 180 ° en plaats het binnenste proef tank in de buitenste tank. Start de timer. Let op: de zwarte kant moet nu aan de andere kant. </li><li> Herhaal stap 3.7, acht keer voor een totaal van tien studies. Gebruik figuur 2 als een gids, het controleren van elke proef. </li><li> Herhaal het gedrag assay twee verschillende dagen. </li></ol> 4. Netvlies axotomy <ol><li> Plaats dier in 0,02% tricaïne tot ze niet meer reagereneen staart knijpen met een # 3 tang. </li><li> Smelt 1% agarose in 0,1 x MMR en vervolgens toe te voegen aan een 60 mm petrischaal. Eenmaal afgekoeld, een kleine rechthoekige graszode in de agarose en voeg het kikkervisje de graszode met wat 0.02% tricaïne, zodat het dier gedeeltelijk is ondergedompeld in de vloeistof. </li><li> Pierce de huid op een hoek van 45 graden achter de dorsale regio van het oog met een 25 G naald, terwijl schoren het dier tegen forceps aan de andere kant. </li><li> Het verzorgen van de ader, die naast de oogzenuw ligt niet aan knip, zorgvuldig te bereiken in het gat met # 5 tang, knip de oogzenuw en draai het uit de weg. Als er ernstige bloeden vanwege ongeluk knippen de slagader, dan snel plaats het dier in 2% tricaïne te euthanaseren. LET OP: 2% tricaïne oplossing kan gevoelloosheid veroorzaken bij de mens. Deze oplossing moet worden behandeld met handschoenen. </li><li> Om het dier herstellen na operatie, plaatst dier 100 mm petrischaal met 0.7X MMR en 50 ug / ml gentamicine gedurende 20 minuten. Next, overdracht kikkervisje naar vuilwatertank met kikker water. Laat dier rust O / N. </li><li> De volgende ochtend, het testen van de visuele functie zoals hierboven beschreven (stappen 3,1-3,9). </li></ol> 5. Analyze Results <ol><li> Na de proeven worden afgewerkt, het meten van de hoeveelheid tijd die het kikkervisje blijft op de zwarte kant van de tank. <ol><li> Handmatig bekijk de video&#39;s met behulp van software die de tijd weergeeft en maakt veelvuldig pauzeren. Kijk naar de video display tijd. Noteer het begin van de twee min proces, dat is wanneer de binnentank succes genest binnen het buitenste reservoir en vierkante gezien de camera. </li><li> Met de positie van de ogen van de kikkervisje te bepalen welke kant van de tank de dieren zwemmen op. Definieer oversteken van een kant van de tank naar de andere wanneer beide ogen zwart / witte lijn hebben overschreden. </li></ol></li><li> Noteer het begin en einde van elk interval (in seconden) dat het dier besteedt aan de zwarte kant. Pauzeren en opnieuwwind de video om nauwkeurigheid te garanderen. Totaal de sec binnen elke proef. </li><li> Input deze nummers in de bijgevoegde Gedrag werkblad. Het werkblad zal de ratio van de tijd dat het dier besteed aan de witte kant door het aftrekken van de tijd besteed aan de zwarte kant van de tank van de totale 120 sec proef en delen door de totale tijd in seconden berekenen [(120 - totaal seconden besteed aan de zwarte kant) / 120 sec]. De gemiddelden werkblad deze ratio over alle 10 proeven. </li><li> Gebruik een student T-test, gepaarde, tweezijdige verdeling te bepalen of de proeven tussen dagen zijn significant (p ≤ 0,05). </li></ol>

<ol><li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li>
<li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li>
<li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
<li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+%28ACT%29+assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li>
<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij rapporteren hier een eenvoudige visie geleide gedrags test die gemakkelijk kan worden uitgevoerd in minder dan een week minimaal geschoold laboratoriumpersoneel. Terwijl andere testen vereisen gespecialiseerde apparatuur en expertise in het gedrag van dieren, deze test kan een snelle test om visuele functie te bepalen. Een andere gedrags assay Visual Avoidance test ontwikkeld om te bepalen hoe de tectum bijdraagt ​​aan visuele waarneming bij Xenopus 10. Deze test meet ruimtelijke afstemming en co...

Xenopus laevis zijn gebruikt als modelorganisme om de vorming oog te bestuderen. De ogen snel te ontwikkelen, groeien naar volwassenheid in minder dan een week voor het testen van genen of wegen die een effect hebben op de visuele ontwikkeling en functie hebben. Om visuele functie te testen, heeft de optokinetische en optomotor respons gebruikt in zebravis en Xenopus kikkervisjes, respectievelijk 1,2. Omdat de ogen van Xenopus kikkervisjes zijn relatief kleiner dan de zebravis, deze test vereist het gebruik van gespecialiseerde apparatuur en opgeleid personeel om de subtiele staart-flip en oog-beweging te detecteren in Xenopus. Een meer robuuste gedrag in Xenopus is de voorkeur voor zwemmen in een tank met een witte achtergrond, die hierin 3 wordt beschreven. Bij het plaatsen van een kikkervisje in een half zwart / half-witte tank, het pre-metamorfe kikkervisje snel zwemt naar de witte kant van de tank. Hiervoor gebruikten we deze assay om te bepalen of pluripotente cel-afgeleideogen waren functioneel 4. Hier melden wij een gedetailleerde versie van deze test, die kan worden gebruikt om de visuele functie van premetamorphic Xenopus kikkervisjes testen. Deze test is eenvoudiger dan de optomotor respons test, omdat het vereist slechts een gemonteerde digitale camcorder, digitale camera software en standaard uitrusting in de meeste Xenopus laboratoria. Bovendien, de geregistreerde respons vereist geen speciale training tally resultaten. Onze vertegenwoordiger resultaten tonen aan dat dezelfde groep van kikkervisjes, dubbele retinale axotomy hebben ondergaan, zwemmen willekeurig rond de tank. We hebben ook het gedrag test resultaten van een representatieve kikkervisje, toont hoe een oog kan worden getest visuele responsie. Een werkblad opgenomen zodat getallen tijdens de test verkregen kan worden ingebracht en geanalyseerd. Dit werkblad kan gebruikt worden om te bepalen of de geteste kikkervisjes hebben een visuele reactie.

<table><tbody><tr><td>1/2 Gallon Flex-Tank with Cover</td><td>eNasco</td><td>SB19271M</td><td>Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"</td></tr><tr><td>Zwarte elektrische tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wit tissuepapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grote inoculatie draaischijf</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>Size: Dia 114,3 x&nbsp; H 76,2 mm (4 1/2&nbsp; x&nbsp; 3")</td></tr><tr><td>Durasorb onderlaken</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>Size: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>Standaard statief</td><td></td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>iSight camera of webcam</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>Goed voor grotere kikkervisjes maar kleine zijn moeilijk te zien</td></tr><tr><td>Draagbare computer</td><td>Apple/PC</td><td>Various</td><td>We gebruikten een 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo met MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV handycam camcorder</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>Aangesloten via firewire op de computer met een 6-geleider en 4-geleider alpha FireWire 400&nbsp;</td></tr><tr><td>Handycam station</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>Dit kan worden gebruikt voor het aansluiten van firewire op camera</td></tr><tr><td>QuickTime Player software</td><td>Quicktime</td><td>Version 10.1</td><td></td></tr><tr><td>26 G Naald (5/8" lengte)</td><td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beschikbare items</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinesulfaat [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>Opgeslagen bij RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 siliconen elastomeer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Stock oplossing = 100 g/L opgeslagen bij RT</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>Stock oplossing = 0,4 M opgeslagen bij RT</td></tr><tr><td>In vitro bevruchte embryo's</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 embryo's/eenheid</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige behavioral assay for testing visuele functie in<em&gt; xenopus laevis</em

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Meting van de visuele functie in de kikkervisjes van de kikker, Xenopus laevis, laat screenen op blindheid in levende dieren. Optokinetische reactie een-visie gebaseerde, reflexieve gedrag is waargenomen bij alle geteste vertebraten. Tadpole ogen zijn klein, zodat de staart flip respons werd gebruikt als alternatieve maatregel, die een vakman om de subtiele reactie opnemen vereist. We ontwikkelden een alternatief gedrag assay gebaseerd op het feit dat kikkervisjes liever zwemmen op de witte zijde van een tank wanneer geplaatst in een tank met zowel zwarte als witte zijkant. De hier gepresenteerde test is een goedkope, eenvoudige alternatief dat een reactie die gemakkelijk gemeten creëert. De opstelling bestaat uit een statief, webcam en geneste testen tanks, direct beschikbaar in de meeste Xenopus laboratoria. Dit artikel bevat een film die het gedrag van kikkervisjes, voor en na verbreken van de oogzenuw. Om de functie van een oog te testen hebben we ook vertegenwoordigers omvattenwoordiger resultaten van een kikkervisje waarbij elk oog onderging netvlies axotomy op opeenvolgende dagen. Toekomstige studies zouden een geautomatiseerde versie van deze test te ontwikkelen voor het testen van de visie van veel kikkervisjes in een keer.

Eerdere rapporten is gebleken dat premetamorphic Xenopus kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank en noemde deze test, de achtergrondkleur voorkeur Assay 3 We hebben deze test veranderd om de visuele functie van beide ogen van kikkervisjes in te testen minder dan een week. Zo kunnen hun ogen worden verzameld voor histologisch onderzoek. We zien hier hoe de reactie door visuele signalen. In Film 1, de kikkervisjes in de linke...

Xenopus laevis kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank. Dit gedrag wordt gestuurd door hun visie. Op basis van dit probleem presenteren we een eenvoudige test om de visuele functie kikkervisjes testen.

Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Het algemene doel van deze procedure is om de visuele functie van kikkervisjes te testen door de hoeveelheid tijd vast te leggen die het dier doorbrengt op de helft van de testtank die zwart is gekleurd. Dit wordt bereikt door kikkervisjes eerst op te kweeken tot stadia 45 tot 50. De tweede stap is het opstellen van een tank die voor de helft zwart en voor de helft wit is, samen met een camera voor de gedragsanalyse.Plaats vervolgens een tweede tank met een kikkervisje in de buitenste tank. Registreer voor elk kikkervisje het door visie gestuurde gedrag terwijl de achtergrond in de omgeving wordt gewijzigd. De laatste stap is het uitvoeren van een retinale exsudatie bij de kikkervisjes, om vervolgens de gedragsassay te herhalen.Uiteindelijk worden de gegevens van deze eenvoudige, goedkope assay gebruikt om aan te tonen dat de kikkervisjes, bij tests van de fototopische visus, een voorkeur hebben om aan één zijde van het aquarium te zwemmen boven de andere. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van andere technieken, zoals de optokinetische respons of de tail-flip assay, is dat het een goedkope, eenvoudige methode is die gebruikmaakt van apparatuur die in de meeste laboratoria gemakkelijk beschikbaar is. Om de kikkervisjes voor te bereiden, verkrijgt men eerst bevruchte xenopus-embryo's en plaatst men deze in 60 millimeter Petri-schalen met 50 µg/mL Marks' modified Ringer's of MMR, verdund met een factor 10.Plaats blastula- tot neurale-plaatstadium embryo's in gentamicine-antibioticum. Stadia twee tot 15 bij 18 °C in de Petrischalen. Zodra de embryo's een nieuw cup-favorstadium van ongeveer 27 tot 30 bereiken, worden ze overgezet naar 0,1 XMMR zonder antibiotica om de groei van darmbacteriën mogelijk te maken.Wanneer de kikkervisjes rond stadium 45 het voedingsstadium bereiken, verplaatst u ze naar Petri-schalen van 100 millimeter met 0.1 XMMR. Voed ze de volgende dag met supernatant van brandnetelpoeder. Na één week in de Petri-schaal van 100 millimeter vult u een aquarium van een halve gallon met kikkervoorwater.Verplaats de dieren naar het aquarium en zet het voedingsschema met het supernatant van brandnetelpoeder voort, maar ververs het water slechts twee tot drie keer per week. Wanneer de dieren in aquaria van een halve gallon verblijven, worden ze gehouden in een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker, waarbij de lichten om 6:00 uur aangaan. Plaats het aquarium van een halve gallon met de proefpersonen voorafgaand aan de test gedurende ten minste 12 uur overnacht op een wit oppervlak. De gedragsanalyse dient te worden uitgevoerd in een rustige ruimte met weinig verkeer en standaard fluorescentieverlichting.Bereid twee in elkaar passende testtanks van een halve gallon voor op de buitenhoeken van wat de binnenste tank zal worden. Gebruik een Sharpie om de waterlijn vijf centimeter boven de bodem te markeren. Identificeer daarnaast eventuele inkepingen aan de binnenzijde van de binnenste tank.Vul deze met een inerte verbinding om te voorkomen dat kikkervisjes erin blijven hangen. Richt de aandacht nu op het tweede buitenste aquarium. Voor de volgende stap zijn zwarte isolatietape en wit vloeipapier nodig.Gebruik de tape om de buitenkant van één helft van het reservoir te bedekken en het vloeipapier om de buitenkant van de andere helft te bedekken, zoals hier wordt getoond. Zodra de reservoirs zijn voorbereid, stelt u een inoculatie-draaischijf op en plaatst u de geneste reservoirs hierop. Positioneer een statief en een webcam zodanig dat de camera het interieur van de reservoirs van bovenaf kan filmen.Sluit de webcam aan op een computer met software voor video-opname en weergave. Zet de camera aan en bereid u voor om een nieuwe video-opname te maken. Drapeer vervolgens een lichtgewicht katoenen doek over de camera en de tanks.Om externe prikkels voor de kikkervisjes te verminderen, gebruikt u een luminantiemeter en controleert u of de luminantie onder de doek tussen de 35 en 50 candles per square meter ligt. Start de gedragsassay door de binnenste testtank te pakken. Vul deze met kikkerwater tot de markering van vijf centimeter.Gebruik een net om een dier vanuit de container van een halve gallon over te brengen naar de binnenste testtank bij de computer. Zorg ervoor dat de opnamesoftware is geopend en het testgebied vastlegt voor de dossiervorming. Noteer de naam van het dier, de datum en het tijdstip op een stuk papier.Plaats dit onder de camera voor de opname. Wanneer dit is gebeurd, stelt u een timer in op twee minuten. Richt vervolgens het buitenreservoir op de draaischijf, zodat de zwarte zijde aan de rechterkant bevindt.Plaats nu de testtank in de buitenste tank. Sluit in het opnamegebied het gordijn en gebruik het computerscherm om de oriëntatie van de buitenste tank te controleren. Controleer of de video wordt opgenomen en start de timer.Wanneer de timer afgaat, laat u het afdekdoek op zijn plaats en verwijdert u de binnenste testtank. Draai vervolgens de buitenste tank 180 graden, zodat de zwarte zijde nu aan de linkerkant zit. Plaats de testtank terug in de buitenste tank en start de timer voor twee minuten.Verwijder opnieuw de binnentank. Draai de buentank 180 graden en plaats de binnentank elke twee minuten opnieuw, voor een totaal van 10 keer. Stop de video-opname wanneer dit is voltooid.Plaats de kikkervisje terug in de tank van een halve gallon. Bereid een microscoop voor om de retinol ex sodomy uit te voeren. Vul een Petri-schaal van 60 millimeter met 1%aros gesmolten in 0,1 XMMR en laat dit stollen.Verwijder een klein rechthoekig stukje van de agar ter grootte van de kikkervisje. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, haalt u het proefdier op en plaatst u het in 0,02% Trica. Ga verder wanneer het dier niet meer reageert op een knijp in de staart met een pincet nummer drie.Breng het dier vervolgens over naar de schaal. Plaats de Petrischaal vervolgens op de microscoop. Maak u klaar om het dier aan één zijde met een pincet te fixeren.Gebruik aan de tegenovergestelde zijde een naald van 25 gauge om de huid achter de dorsale regio van het oog in een hoek van 45 graden door te prikken; reik voorzichtig met een pincet nummer vijf in het gat en knip de oogzenuw door, waarbij de aangrenzende ader wordt vermeden. Klap de zenuw opzij en trek de pincet na de ingreep terug. Laat het dier herstellen door het in een Petrischaal van 100 millimeter te plaatsen met 0.7 XMMR en 50 µg/mL.Gentamicine gedurende 20 minuten. Breng de kikkervisje daarna over naar een herstelbak met kikkerwater. Plaats de bak op een wit oppervlak ter voorbereiding op de test.Laat het dier een nacht rusten. Gebruik de volgende ochtend de gedragstest om de visuele functie te testen. Deze video toont representatieve gegevens voor het experiment.Links staan de dieren vóór de operatie; rechts staan dezelfde dieren nadat de retinale axonen van beide ogen zijn doorgesneden. Dit wordt aangegeven door het schema in de onderste hoeken. Het water werd bewogen om aan te tonen dat er niets is toegevoegd om de dieren af te stoten van de zwarte zijde of aan te trekken naar de witte zijde.De tadpoles vóór de operatie reageren in minder dan 30 seconden op de achtergrondkleur, terwijl de blinde tadpoles doelloos door het aquarium zwemmen. Deze grafiek toont het percentage van de tijd dat een enkel dier in de witte en zwarte regio's doorbracht onder drie condities. Eerst werd het dier waargenomen met de assay voordat er enige operatie plaatsvond.Op twee opeenvolgende dagen nadat de rechter oogzenuw was doorgesneden, werd het gedrag gedurende twee testdagen geobserveerd. Tot slot volgden, nadat beide oogzenuwen waren doorgesneden, nog twee dagen van observatie met de assay. Het dier bracht meer dagen door aan de witte zijde van het aquarium wanneer ten minste één oogzenuw intact was.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u het gezichtsvermogen van kikkervisjes kunt testen met behulp van eenvoudige reagentia en apparatuur die in de meeste kikkerslaboratoria te vinden zijn. Veel succes met uw experimenten.

a-simple-behavioral-assay-for-testing-visual-function-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het testen van visuele gevoeligheid bij hagedissen met behulp van een operante conditionering paradigma dat het afspelen van video van de random-dot kinematograms en computer-gegenereerde ongewervelde dieren in dienst heeft.

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

We ontwikkelden de Visual-Motor Reactie op het motorvermogen van larvale zebravis kwantificeren in reactie op licht stappen en verlaagt. We hebben ook onderzocht zebravis visie mutanten, waaronder de no optokinetische reactie (NRC) mutanten, waarvan gedacht werd dat volledig blind wanneer het wordt getest door een andere visie assay, de optokinetische reflex.

Een Behavioral Assay aan responsiviteit van zebravis Maatregel om veranderingen in lichtintensiteit

De VisioTracker is een geautomatiseerd systeem voor de kwantitatieve analyse van de visuele prestaties van larvale en kleine volwassen vissen op basis van de registratie van oogbewegingen. Het beschikt over volledige controle over visuele stimulus eigenschappen en real-time analyse, waardoor high-throughput onderzoek op gebieden zoals visuele systeem ontwikkeling en functie, farmacologie, neurale circuit studies en sensomotorische integratie.

VisioTracker, een innovatieve geautomatiseerde benadering van oculomotorische Analyse

Deze video beschrijft de optokinetische responstest bij zebravissen. De video meet de reflexieve oogbewegingen op basis van de visuele bewegende stimulus en bepaalt de gezichtsscherpte bij zebravissen.

Optokinetic Response Assay: een methode om gezichtsscherpte bij zebravissen te meten

De video beschrijft de vermijding en thigmotaxis-test van zebravislarven. De video onderzoekt het gedrag van zebravislarven als reactie op visuele aversieve stimulus.

Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: een methode met hoge doorvoer om larvaal gedrag te onderzoeken als reactie op aversieve visuele stimulus

Zebravis hebben een waardevol instrument voor vele onderzoeksgebieden geweest. Hier laten we een methode om een ​​visuele respons opwekken en berekent een functionele gezichtsscherpte in het volwassen zebravissen.

Optokinetische Response als een kwantitatieve maat van de gezichtsscherpte in zebravis

We presenteren een methode voor de elektroretinografische (ERG) analyse van zebravislarven met behulp van micromanipulatie en elektroretinografietechnieken. Dit is een eenvoudige en duidelijke methode voor het testen van de visuele functie van zebravislarven in vivo.

Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven

Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel in vivo. We beschrijven methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven bij fokken normaal of na blessure.

Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes

Om de muis visie te onderzoeken, hebben we een dreigende test uitgevoerd. Muizen werden geplaatst in een grote vierkante Arena met een monitor op het plafond. De dreigende visuele stimulus riep constant het bevriezen of vlucht reacties in de muizen op.

Met behulp van dreigende visuele prikkels om de muis visie te evalueren

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Neurale degeneratie in zowel ogen als hersenen als gevolg van diabetes kan worden waargenomen door gedragstests die worden uitgevoerd op knaagdieren. Het Y-doolhof, een maat voor ruimtelijke cognitie, en de optomotorische respons, een maat voor visuele functie, geven beide inzicht in mogelijke diagnoses en behandelingen.

Gedragsbeoordeling van visuele functie via optomotorische respons en cognitieve functie via Y-maze bij diabetische ratten

Leer een eenvoudige gedragsassay om visuele functie te testen bij Xenopus laevis-kikkervisjes. Deze methode meet de tijd die dieren doorbrengen op de witte of zwarte zijde van een tank.

Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in

Meer video's verkennen