Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel
September 6th, 2014
Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.
Het algemene doel van deze procedure is om de zeldzame herprogrammerings intermediaire producten te isoleren uit culturen van herprogrammeerde muis embryonale fibroblasten. Dit wordt bereikt door eerst muis embryonale fibroblasten af te leiden van E 13.5 embryo's van een herprogrammeerbare muisstam. In de tweede stap worden de muis embryonale fibroblasten met lage passage gezaaid in geïnduceerd pluripotent stam- of IPS-celmedium, aangevuld met doxycycline om het herprogrammeringsproces te initiëren.
Vervolgens worden de cellen op geselecteerde tijdstippen tijdens de herprogrammering geoogst en gelabeld met antilichamen tegen specifieke celoppervlaktemarkers. Uiteindelijk kunnen de zeldzame herprogrammerings intermediaire producten worden geïsoleerd door middel van facten voor verdere experimentele analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat mechanistische studies kunnen worden uitgevoerd op de zeldzame herprogrammerings intermediaire producten in de afwezigheid van cellen die refractair zijn voor het herprogrammeringsproces, die de meerderheid van de populatie vormen. Om muis embryonale fibroblasten, of mes, te genereren, begint men met het overbrengen van een embryonale dag 13,5 baarmoederhoorn in een 10 centimeter weefselkweekschaal met 10 milliliter steriele PBS.
Gebruik vervolgens gesteriliseerde chirurgische schaar om de hoorn in afzonderlijke stukken te snijden, elk met één embryo. Vervolgens, onder een dissectiemicroscoop in een weefselkweekkap, gebruikt u gesteriliseerde pincetten om voorzichtig de baarmoederomhulling en de extra embryonale membraan rond elk embryo te verwijderen en elk ontbloot embryo over te brengen in individuele 10 centimeter schalen met 10 milliliter vers PBS. Ga vervolgens door met het verwijderen van het hoofd, ledematen, staart en inwendige organen van elk embryo met behulp van pincetten.
Bevriest de koppen in afzonderlijke 1,5 milliliter buisjes voor genotypering indien nodig. Breng elke romp over in nieuwe individuele 10 centimeter platen en gebruik twee chirurgische messen om elk embryo gedurende twee minuten te versnipperen. Digest de weefselstukken in 200 microliter trypsine EDTA gedurende drie tot vijf minuten op kamertemperatuur, gevolgd door een extra twee minuten versnipperen.
Deactiveer vervolgens de trypsine met twee milliliter meth media en breng de cellensuspensie over naar een 15 milliliter buisje met behulp van een 1000 microliter pipette. Dissocieer verder het weefsel mechanisch met voorzichtig pipetteren en breng vervolgens de celsuspensie over naar een gelatine gecoate 10 centimeter schaal. Voeg een extra 10 milliliter meth media toe aan de cultuur.
Na 24 tot 48 uur zou de schaal dicht bedekt moeten zijn met MEF's om de MEF's te herprogrammeren. Bevriest eerst een laagpassage bevroren meth cultuur in een 37 graden Celsius waterbad en brengt vervolgens de inhoud over in een buisje met 10 milliliter voorverwarmd meth medium. Na het centrifugeren van de cellen, suspendeert u de pellet in 12 milliliter vers meth medium en brengt u de celsuspensie over in een gelatine gecoate T 75 kweekvat. Na een herstelperiode van 24 tot 48 uur, wast u de MEF's met PBS en los u de cellen vervolgens op met drie milliliter trypsine EDTA gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Stop vervolgens de enzymatische spijsvertering met vijf milliliter meth media en dissocieert u de cellen verder door voorzichtig te mengen met een 10 milliliter pipette. Programmeer vervolgens de mets door de cellen te zaaien op nieuwe gelatine gecoate T 75 kolven bij 6,7 keer 10 tot de derde cellen per vierkante centimeter in 12 milliliter IPSC-medium dat twee microgram per milliliter doxycycline bevat voor de eerste zes dagen. Vervang het medium om de dag met vers doxycycline-gesupplementeerd IPSE-medium en verzamel de herprogrammerings intermediaire producten op de vereiste tijdstippen door trypsine EDTA detachering zoals zojuist is gedemonstreerd voor elke geoogste intermediaire suspensie.
Was de cellen in PBS. Plaats vervolgens de pellets in fax media voor antilichaamlabeling om volledig herprogrammeerde IPSC-culturen te vestigen.
Laat de cellen groeien in doxycycline-vrij IPSC-medium gedurende vier tot zeven dagen om de herprogrammeerde cellen te labelen. Label de geoogste intermediaire producten met de juiste antilichamen van belang. Na 10 minuten, tik voorzichtig op de buisjes om de cellen op te schorsen en plaats vervolgens de buisjes gedurende een extra 10 minuten op ijs.
Na de tweede incubatie, was de cellen in 10 milliliter koud PBS per buisje. Aspibeer vervolgens voorzichtig het supernatant en suspendeer de pellets in een geschikt volume labelmedium, aangevuld met strippin P maat zeven op ijs. Na 20 minuten, was de cellen in nog eens 10 van koud PBS en suspendeer de cellen in labelmedium, aangevuld met propidiumjodide.
Filter eventuele celklompjes uit door de suspensie door een 70 micrometer zeef te laten lopen en breng vervolgens de cellen over naar de bijbehorende faxbuisjes op ijs. Voor de compensatiecontroles. Plaats een cryobuisje van IPS-cellen, die op bestraalde mes worden gehouden, in 800 microliter labelbuffer.
Zet 200 microliter cellen opzij voor de ongelabelde controle. Verdeel vervolgens de resterende celsuspensie over drie 15 milliliter buisjes voor de enkelkleurige controles en label de monsters zoals zojuist is gedemonstreerd om de intermediaire producten te analyseren door middel van flowcytometrie. Begin met het instellen van een poort in de voorwaartse bij zijscatterplot om debris uit te sluiten.
Gebruik vervolgens de voorwaartse scatterhoogte versus de voorwaartse scattergebied om de aggregaten uit te sluiten en de PI-kanaal versus de voorwaartse scatter. Om op de PI-negatieve levende cellen te richten. Gebruik de ongelabelde cellen om de spanningen voor de Pacific blue FITC en PSI zeven kanalen aan te passen.
Idealiter positioneert u de celpopulatie aan de onderkant van het respectieve kanaal. Stel vervolgens de poorten in met de ongelabelde controlecellen om de herprogrammeringsculturen te subfractioneren in dag drie, zes en negen. Populaties van SSEA een negatieve TH 1.2 positieve cellen SSEA een negatieve TH 1.2 negatieve cellen en de herprogrammerings intermediaire producten SSEA een positieve TH 1.2 negatieve cellen.
Subdiviseer vervolgens de dag negen SSEA een positieve TH 1.2 negatieve fractie
Overzicht
Deze studie beschrijft een procedure voor het isoleren van zeldzame reprogrammerings tussenproducten uit muis embryonale fibroblasten (MEFs) tijdens hun omzetting in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Het proces omvat het gebruik van specifieke transcriptiefactoren en antilichaamlabeling om de identificatie en isolatie van deze tussenproducten te vergemakkelijken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamcellen biologie
- Celreprogrammering
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kunnen worden gegenereerd uit somatische cellen.
- Muis embryonale fibroblasten (MEFs) dienen als model voor het bestuderen van reprogrammering.
- Transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4 en c-Myc zijn cruciaal voor reprogrammering.
- Isolatie van reprogrammerings tussenproducten maakt mechanistische studies mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om zeldzame reprogrammerings tussenproducten uit MEFs te isoleren.
- Om deze tussenproducten te analyseren voor een beter begrip van het reprogrammeringsproces.
- Om de efficiëntie van het genereren van iPSCs te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Afleiding van MEFs uit E 13.5 embryo's.
- Zaaien van MEFs in iPSC media aangevuld met doxycycline.
- Oogsten van cellen op specifieke tijdstippen en labelen met antilichamen.
- Isolatie van tussenproducten via flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van reprogrammerings tussenproducten met behulp van specifieke markers.
- Identificatie van verschillende populaties cellen in verschillende reprogrammeringsstadia.
- Demonstratie van de mogelijkheid om mechanistische studies uit te voeren op geïsoleerde tussenproducten.
- Verbeterd begrip van de reprogrammeringsdynamica in MEFs.
Conclusies
- De methode maakt de effectieve isolatie van reprogrammerings tussenproducten mogelijk.
- De verkregen inzichten kunnen de efficiëntie van iPSC-generatie verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen deze tussenproducten gebruiken voor diepere mechanistische inzichten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Purification of iPS cell intermediates using cell surface markers enables mechanistic de-risking of reprogramming workflows, addressing a key bottleneck in stem cell-based discovery. This approach enhances predictive confidence in early-stage cell fate decisions and supports robust target validation for regenerative medicine and disease modeling portfolios. Isolating rare intermediates allows for precise interrogation of reprogramming dynamics, informing risk-adjusted advancement in cell therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic studies on reprogramming intermediates free from refractory cell populations.
- Supports functional validation of pluripotency-associated markers during cell fate transitions.
- Facilitates pathway clarification by tracking marker expression changes over time.
- Improves predictive confidence in selecting reprogramming factors and conditions.
Screening & Assay Development
- Provides validated cell populations for downstream phenotypic screening and assay development.
- Standardizes isolation of defined intermediates, enhancing reproducibility across experiments.
- Generates quantitative outputs via flow cytometry for robust assay readouts.
- Enables scalable preparation of intermediates for compound evaluation or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns reprogramming intermediates with disease-relevant cell states for translational modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies on defined cell populations.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models by isolating homogeneous cell states.
Pipeline & Workflow Integration
This cell surface marker-based purification method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging mechanistic studies with translational applications.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on reprogramming efficiency and marker dynamics.
- Screening: Delivers reproducible, marker-defined cell populations for assay readiness and quantitative analysis.
- Analytics: Provides flow cytometry-based measurements to compare reprogramming stages and conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro intermediates with in vivo disease or developmental states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for isolating rare cell populations across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell reprogramming studies.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and improves reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling robust target validation and pathway analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic and modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and cell surface marker selection.
- Demands access to high-quality antibodies and analytical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and marker panels.
- May require adaptation for different cell types or reprogramming systems.
- Dependent on availability of isogenic, well-characterized starting cell populations.
