Name: Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer hoe je zeldzame herprogrammeringsintermediaten isoleert uit muizembryonale fibroblasten tijdens de omzetting naar iPS-cellen. Deze methode maakt mechanistische studies mogelijk zonder interferentie van niet-herprogrammerende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag de financiële steun van de Monash Larkins Program evenals uit een NHMRC CDF en een NHMRC projectsubsidie ​​erkennen. Verder willen we Sue Mei Lim bedanken voor haar constructieve suggesties, Edwina McGlinn voor haar steun en de Monash Flowcore team (met name Adam Dinsdale) voor hun hulp bij het produceren van de video.

1 Instrument instellingen / Bereiding van het reagens / Genotyping <ol><li> Bereid iPS celmedium: Supplement 500 ml Knockout DMEM medium met 75 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml L-glutamine, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 500 ul β-mercaptoethanol, 5 x 10 5 stuks Leukemie remmende factor ( LIF). Verwijzen wij u naar Materialen Lijst voor product en informatie over de aanschaf van gebruikte reagentia in het kader van dit manuscript. </li><li> Bereid MEF medium: Supplement 500 ml DMEM medium met 50 ml FBS, 5 ml L-glutamine, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 5 ml natrium pyruvaat, 500 ul β-Mercaptoethanol. </li><li> Bereid invriesmedium: voor 10 ml, combineer 9 ml FBS met 1 ml DMSO. </li><li> Bereid gelatine beklede schotels Opslaan 3-5 ml 0,1% varkensgelatine oplossing voor een T75 kolf geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 min en zuig vlak voor gebruik. </li><li> Bereid FACS labeling medium: voor 10 ml, combineren 9,9 ml PBS met 0,1 ml FBS. </li><li> Voereneen genotypering PCR voor de Rosa26 m2rtTA locus: Voer reacties met Taq DNA polymerase volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een aangepaste MgCl2-concentratie van 3,5 mM en de volgende 3 primers: oIMR8052: 5 &#39;GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3&#39;, oIMR8545: 5&#39;AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 &#39;, oIMR8546: 5&#39; GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 &#39;. Cycling omstandigheden: 94 ° C gedurende 3 min; 35 cycli van (94 ° C gedurende 30 seconden, 65 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 1 min); 72 ° C gedurende 2 min; houden op 12 ° C. Verwachte product grootte: 650 bp voor wild-type allel en 340 bp voor het mutante allel. </li><li> Voer een genotypering PCR voor de collageen-StemCa / OKSM locus: Voer reacties met Taq DNA polymerase volgens de instructies. Gebruik een gemodificeerde MgCl2-concentratie van 2,5 mM en de volgende primers 3: col / FRT-B: 5 &#39;CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3&#39;, col / frtA1: 5 &#39;GCACAGCATTGCGGACATGC 3&#39;, col / frtC1: 5 &#39;GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 &#39;. Cycling omstandigheden: 95 ° C gedurende 1 min: 2 cycli van (94 ° C gedurende 30 seconden, 70 ° C gedurende 45 seconden), 6 cycli (94 ° C gedurende 30 seconden, 68 ° C gedurende 45 seconden) en 30 cycli van (94 ° C gedurende 20 seconden, 60 ° C gedurende 1 min); 72 ° C gedurende 5 min; houden op 12 ° C. Verwachte product grootte: 331 bp voor wild-type allel en 551 bp voor het mutante allel. </li><li> Voer alle centrifugatiestappen bij 400 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. </li></ol> 2 Generatie van muis embryonale fibroblasten <ol><li> Voer een getimede paring tussen een dier van de OKSM stam met een lid van het andere geslacht van de m2rtTA stam. Harvest embryo&#39;s op embryonale dag 13,5 bij het ruimen van de moeder en het verwijderen van de baarmoeder hoorn. Voorafgaand aan verwijdering van de baarmoeder hoorn, spuit de buikstreek met een 80% ethanoloplossing, microbiële contaminatie te voorkomen. </li><li> Breng de baarmoeder hoorn een 10 cm weefselkweek schotel met 10 ml steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik gesteriliseerd chirurgische kwaliteit schaar om de uterushoorn in stukken met een embryo (zie figuur 3A, B). </li><li> Gebruik een dissectie microscoop (ideaal gelegen op een weefselkweek kap) en gesteriliseerde tang om voorzichtig te verwijderen van de baarmoeder envelop en de extra-embryonale vliezen rond elk embryo. Breng elk embryo een afzonderlijk 10 cm schaal met 10 ml PBS. </li><li> Ga door verwijderen van de embryo hoofd, ledematen, staart en inwendige organen (hart, lever, darm etc.) met de tang (zie figuur 3C). Breng het hoofd van de embryo&#39;s in een 1,5 ml buis en vries beneden zodat het kan worden gebruikt voor genotypering indien nodig. </li><li> Transfer romp van de embryo&#39;s in een lege 10cm plaat en maken gebruik van twee chirurgische mesjes voor het embryo blad voor de mond gedurende 2 minuten. Voeg 200 ul trypsine / EDTA oplossing bovenop het gehakte embryo en incubeer gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur. Verder hakken eens 2 minuten, voeg 2 ml MEF media in<html> activeren trypsine, en vervolgens over te dragen in een 15 ml buis. </li><li> Gebruik een pipet 1.000 III verder mechanisch dissociëren het weefsel door voorzichtig pipetteren. Over te dragen aan een gelatine gecoate 10 cm schotel en voeg een extra 10 ml van MEF media. Opmerking: Zowel normoxische en hypoxische incubators kan gebruikt worden voor cultuur, zie discussie voor meer informatie. </li><li> Na 24-48 uur de plaat dicht moet worden bedekt met MEFs. </li><li> Alternatief kunnen de cellen dan worden verder vermeerderd of beneden bevroren. Voor het invriezen van cellen, verwijder de cultuur media, spoel de schaal met 10 ml PBS om sporen van media en overlay verwijderen met 3 ml trypsine / EDTA-oplossing. Incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C, inactiveren trypsine digestie door het toevoegen van 5 ml van MEF media en overbrengen in een 15 ml centrifugebuis. Spin down en resuspendeer de pellet in 3 ml bevriezing media. Transfer naar 3 cryovials en neer te bevriezen in een cel bevriezing container. </li></ol> 3 herprogrammeren van MEF ove_content &quot;&gt; NB: Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gebruik normoxische weefselkweek incubators voor herprogrammering Het kan gunstig zijn om afleiden en vergroten MEFs onder hypoxische omstandigheden (5% zuurstof, zie bespreking voor meer gegevens. ). <ol><li> Snel ontdooien lage passage cryovial (P0-P1, 2-3 miljoen cellen) in een waterbad (37 ° C) en breng het in een buis met 10 ml voorverwarmde MEF media. Pellet cellen, resuspendeer in 12 ml verse MEF media, over in een gelatine gecoate T75 cultuur vat, en laat de cellen om te herstellen voor 24-48 uur voordat u verder gaat. Opmerking: MEF kan ook direct na afleiding worden gebruikt. </li><li> Na verwijdering van kweekmedia, wassen MEFs met PBS en cellularize door bedekken met een trypsine / EDTA-oplossing (3 ml gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C). Quench trypsine door toevoeging van 5 ml van MEF media en cellen verder dissociëren door voorzichtig mengen met een pipet 10 ml. Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer. </li><li> Voor reprogramming experimenten zaad MEFs op gelatine beklede T75 kolven bij dichtheden van 6,7 x 10 3 cellen / cm 2 (~ 0.5 miljoen cellen per kolf) in iPSC media die 2 ug / ml doxycycline. Zie tabel 1 betrekking seeding aanbevelingen circa 2 miljoen herprogrammering tussenproducten voor elk tijdstip te verkrijgen. Opmerking: herprogrammeren begint met de toevoeging van doxycycline (2 ug / ml) aangevuld medium </li><li> Voor de eerste 6 dagen vervangen media elke dag vers doxycycline iPSC aangevuld medium (12 ml medium per T75 fles). Voorbij dit punt media verlengen dagelijks als er hoge celaantallen. Het dubbele van het volume van de cultuur als media veranderingen slechts om de andere dag kan worden uitgevoerd. </li><li> Oogst herprogrammering tussenproducten op de vereiste tijdstippen (suggestie: Dagen 3, 6, 9, 12) door media, spoelen met geschikt volume PBS (10 ml voor een T75 kolf) en bedekken met trypsine-EDTA-oplossing (3 ml van een T75 fles). Incubategedurende 3-5 minuten bij 37 ° C en doven door het toevoegen van 5 ml iPSC media gevolgd door voorzichtig pipetteren. </li><li> Telling celsuspensie met een hemocytometer (zie hierboven), pellet door centrifugeren, zuig de supernatant en resuspendeer cellen in 10 ml PBS om alle sporen van trypsine te verwijderen. Pellet cellen opnieuw, aspireren supernatant en ga verder met stap 4.1 van de herprogrammering tussenproducten isoleren. Opmerking: Cellen ondergaan herprogrammering kan gecryopreserveerd en ontdooid FACS isolatie in een later stadium. </li><li> Om volledig geherprogrammeerd iPS culturen te vestigen, groeien cellen in-DOX gratis iPSC media voor een verdere 4-7 dagen. Opmerking: herprogrammeren succesvol kweken wordt een groot aantal kolonies op dag 12 bevatten (zie figuur 4). Gedurende deze tijd zal afwijkende iPS cellen die moeten nog OKSM uitdrukking verdwijnen. </li><li> Als alternatief voor de resterende volledig geherprogrammeerd iPS culturen uitdragen: aanvankelijk, zaad bestraalde MEF bij een dichtheid van 15 x 10 3 cellen / cm 2 </sinschrijven&gt; in 12 ml van iPSC media op een gelatine gecoate T75 kolf op een dag of 6 uur voorafgaand aan de experimenten. </li><li> Vervolgens cellularize iPS celculturen door het verwijderen van media, spoelen de T75 kolf met 10 ml PBS, bedekken met 3 ml trypsine-EDTA-oplossing en incuberen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C. Quench trypsine door toevoeging van 5 ml iPSC media gevolgd door voorzichtig mengen, overbrengen naar een 15 ml conische buis, draai af en vervolgens geresuspendeerd in 10 ml iPS media. </li><li> Breng 500 pi van de celsuspensie op de bestraalde MEF (T75 fles) en laat de kweken groeien gedurende 4-5 dagen. Opmerking: Gevestigde iPS culturen kunnen gecryoconserveerd of worden gebruikt voor experimenten. Klonale cellijnen kunnen worden verkregen door het uitkiezen iPSC individuele kolonies onder een stereomicroscoop 22. </li><li> Cryo behouden samenvloeiende iPSC culturen, zoals beschreven in 2.8 voor MEF. </li></ol> 4 Antibody Labeling <ol><li> Resuspendeer celpellets van herprogrammering culturen, zoals bereid in paragraaf 3, inFACS labeling medium aangevuld met antilichamen (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotine 1: 400 en anti-EpCAM Fitc 1: 400). Gebruik 200 ul aangevuld etikettering mix per 5.000.000 cellen en incubeer op ijs. </li><li> Na 10 min tik zachtjes de buis om de cellen te resuspenderen en incubeer gedurende een extra 10 minuten op ijs. Voeg 10 ml koud PBS per buis en spin down. </li><li> Voor elke buis te worden gemerkt bereiden 200 ui labeling medium aangevuld met 1 ul streptavidine-PeCy7 (1: 200) per 5.000.000 cellen. Wanneer cellen gepelleteerd voorzichtig zuig het supernatant en resuspendeer in een geschikt volume van labeling medium aangevuld met Streptavidine-PeCy7. </li><li> Houd cellen op ijs gedurende 10 minuten, tikt u op om mengen, incubeer gedurende nog eens 10 minuten op ijs, voeg 10 ml koud PBS per buis, spin down en zuig supernatant. </li><li> Resuspendeer celpellets in labeling media gesupplementeerd met propidium jodide (PI) (2 ug / ml) bij ongeveer 1 x 10 7 cellen / ml. Verwijder celklonten door het passeren van de suspensie door een 70 pm zeef. Transfer cellen om een ​​geschikte FACS buis en bewaar ze op ijs. </li><li> Maak afzonderlijke monsters met afzonderlijke antilichamen (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 en anti-EpCAM). OPMERKING: Deze zijn nodig om de kleur compensatie in de drie kanalen gebruikt in de analyses uit te voeren. Bovendien zijn ongelabelde cellen nodig om spanningen en poorten voor het sorteren. Idealiter iPS cellen worden gebruikt voor compensatie: voorraden van 0,5-1 x 10 6 iPS cellen gehandhaafd op bestraalde MEF worden opgeslagen in cryovials in vloeibare stikstof. De aanwezigheid van MEFs is essentieel om een ​​signaal in de Thy-1.2 kanaal te komen. </li><li> Ontdooi een cryovial van iPS cellen zoals beschreven voor MEF (hoofdstuk 3). Na centrifugatie wordt resuspendeer cellen in 800 gl labeling buffer en 200 ul van dit monster gereserveerd als ongelabelde controle. </li><li> Gebruik de overblijvende cellen als compensatie controles. Verdeel cellen tussen drie buizen van 15 ml en voeg antilichamenals volgt: Pacific Blue compensatieregeling: voeg 0,5 pl van de anti-Thy-1.2 Pacific Blue antilichaam. FITC compensatie tube: voeg 0,5 pl van de anti-EpCAM antilichaam FITC. Pe-Cy7 compensatieregeling: 0.5 ul van de SSEA-1 anti-biotine antilichaam. </li><li> Houd cel-antilichaam monsters op ijs gedurende 10 minuten, meng door te tikken en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. </li><li> Spoelmonsters met 10 ml koud PBS om ongebonden antilichaam te verwijderen, draaien cellen af ​​en zuig de supernatant. Resuspendeer celpellets in 200 ui FACS labeling media. </li><li> Voor anti-SSEA-1-biotine gelabelde monsters, voeg een Streptavidine-PeCy7 conjugaat (1 gl per 200 gl cellen). Label cellen zoals beschreven voor primaire antilichaam (SSEA-1-biotine). </li><li> Haal alle monsters waaronder de ongelabelde controle door een 70 urn zeef en voeg PI (2 ug / ml). Transfer cellen FACS buizen en blijf op ijs totdat vereist. </li></ol> 5 FACS Isolatie van Intermediates OPMERKING:Cellen worden gesorteerd met behulp van een Fluorescence Activated Cell Sorter met 405 nm, 488 nm en 560 nm excitatie lasers en 100 urn nozzle. <ol><li> Stel spanningen voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing waardoor de celpopulatie goed zichtbaar. Teken een hek rondom cellen zoals in figuur 5A om vuil sluiten. Opmerking: het bedoelde gebruik van spanningen op de cel sorter kan complex zijn en vereist een ervaren operator FACS. </li><li> Gebruik voorwaartse verstrooiing (FSC) hoogte versus FSC gebied om aggregaten (figuur 5B) uit te sluiten. </li><li> Visualiseer de PI-kanaal versus FSC tot poort in op de PI negatieve levende cellen (figuur 5C). </li><li> Gebruik de ongelabelde cellen aan de spanningen voor de fluorescerende kanalen PB FITC / GFP, Pe-Cy7 passen. Idealiter plaats de celpopulatie aan het ondereinde van het desbetreffende kanaal. </li><li> Stel poorten met het ongelabelde controle cellen, zoals weergegeven in figuur 6A, B om sub fractie de herprogrammering cultgelen in dag 3, 6 en 9 populaties: SSEA-1 / Thy-1.2 + cellen; SSEA-1 / Thy-1.2-cellen; en de herprogrammering tussenproducten SSEA-1 + / Thy-1.2-cellen. </li><li> Verder op te splitsen van de Dag 9 SSEA-1 + / Thy-1.2-fractie met behulp van de Pe-Cy7 versus Fitc vlek; trekken hekken rond de SSE-a1 + / EpCAM + cellen en de SSEA-1 + / Epcam- cellen. Stel poorten met de ongelabelde controle cellen zoals getoond in figuur 6C, D. </li><li> Prefill geschikte collectie buizen met iPS cel media (1-2 ml) voor het sorteren van de gewenste subpopulaties (zie Figuur 7 voor representatieve FACS profielen voor MEF, Dag 3 / Dag 6 / Dag 9 / Dag 12 culturen en iPS cellen). </li><li> Voeren FACS sortering volgens produceert protocol. </li><li> Na FACS isolatie indienen cellen moleculaire profilering (RNA / eiwit-extractie, chromatine immunoprecipitatie DNA methyloom analyse etc.). Alternatief kunnen de verschillende celfracties gekweekt. </li></ol>

<ol><li>Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pluripotential+embryonic+stem+cells+from+murine+primordial+germ+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture.</a> Cell. 70, 841-847 (1992).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reprogrammable+mouse+strain+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 7, 53-55 (2010).</li>
<li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+and+drug+screening%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+model+of+Hutchinson+Gilford+Progeria+reveals+vascular+smooth+muscle+and+mesenchymal+stem+cell+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects.</a> Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).</li>
<li>Samavarchi-Tehrani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+reveals+a+BMP-driven+mesenchymal-to-epithelial+transition+in+the+initiation+of+somatic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).</li>
<li>Celià-Terrassa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+can+suppress+major+attributes+of+human+epithelial+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849(2012).</li>
<li>Liao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+cluster+302%E2%80%93367+enhances+somatic+cell+reprogramming+by+accelerating+a+mesenchymal-to-epithelial+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MicroRNA cluster 302–367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).</li>
<li>Cieślik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+coordination+of+signaling+pathways+during+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetic.%2C+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition.</a> Epigenetic., & Chromatin. 6, 1-22 (2013).</li>
<li>Golipour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+late+transition+in+somatic+cell+reprogramming+requires+regulators+distinct+from+the+pluripotency+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network.</a> Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+molecular+cornerstones+during+fibroblast+to+iPS+cell+reprogramming+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse.</a> Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+mouse+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+roadmap+of+reprogramming+somatic+cells+into+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells.</a> Cell. 151, 1617-1632 (2012).</li>
<li>Wright, A. J., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+marker+antigens+in+the+characterization+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+coordinated+proteome+dynamics+during+reprogramming+of+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency.</a> Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+molecular+cornerstones+during+fibroblast+to+iPS+cell+reprogramming+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse.</a> Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).</li>
<li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reprogrammable+mouse+strain+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 7, 53-55 (2009).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li>
<li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, 1145-1148 (2009).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om met succes te herprogrammeren MEF in iPS cellen en herprogrammering tussenproducten zuiveren bij hoge hoeveelheid is het essentieel om bewust te zijn van de factoren die een invloed hebben op de algehele efficiëntie hebben. Vooral de partij FBS gebruikt iPS media aanvulling kan een nadelig effect hebben. In het algemeen positieve ervaringen waren met Embryonale stamcellen (ES) cellen gekwalificeerde FBS maar batch testen van sera van verschillende leveranciers kan een goedkoper alternatief te identificeren. Een andere factor is dat de gevolgen voor herprogrammering efficiëntie is het genotype van MEF 15,20. Hoewel MEF afgeleid van heterozygote muizen (Het) voor zowel de OKSM en m2rtTA locus kan herprogrammeren, homozygousity aan een of beide loci resulteert in hogere rendementen herprogrammering. Inderdaad, MEF afkomstig van nakomelingen van OKSM en m2rtTA kruisen tonen een stijging van de herprogrammering efficiëntie in de volgende volgorde (OKSM / m2rtTA): het / het &lt;homo / het &lt;Het / homo &lt;homo /homo (let op dat de cijfers in tabel 1 zijn voor haar / het dier). In het zeldzame geval van een mannelijke homo / homo dier wordt vastgesteld, kan een harem paring met meerdere m2rtTA vrouwtjes worden opgezet. Alle nakomelingen van deze kruisingen worden Het / homo voor de OKSM / m2rtTA loci, respectievelijk. Bovendien is de snelle genotypering worpen aanbevolen als grotere nesten worden verkregen bij gebruik van jongere muizen gefokt (6-15 weken oud). Bovendien is het gebruik van lage passage MEF voor herprogrammering benadrukt 23. Als MEF werden afgeleid en uitgebreid in een normoxisch weefselcultuurincubator raden we alleen gebruik maken van deze cellen tot passage 2 Echter, als de experimentator heeft toegang tot een laag zuurstofgehalte incubator (5% zuurstof) voor de afleiding en de uitbreiding van MEF, passage nummers liefst 3 nog steeds goede resultaten 23 opleveren. Indien de onderzoeker ondervindt problemen met herprogrammering,<html> zoals uiteengezet, de meest waarschijnlijke verklaringen hoge passage nummers bij de dox Bovendien onjuiste genotype van de muizen en het gebruik van FBS dat is niet bevorderlijk voor iPS celgeneratie. In zeldzame gevallen waargenomen dat MEFs niet konden herprogrammeren zelfs onder ideale omstandigheden. In deze gevallen spontaan de novo deletie binnen open leesraam de m2rtTA werd geïdentificeerd als de onderliggende reden. Deze methode is met succes aangepast aan SSEA-1 + tussenproducten via magnetische celisolatie (MACS) extract. Er is een duidelijk voordeel in tijd met MACS echter de zuiverheid SSEA-1 + celpopulaties &#39;wordt verlaagd tot 80-90%, in plaats van meer dan 95%, die afhankelijk van het type experiment de cellen bestemd kunnen opleveren Een probleem. Aldus werd een optie is om MACS gebruiken verrijken SSEA-1 + cellen gevolgd door FACS voor zuiverheid en / of breuk te verhogen in SSEA-1 + / + EpCAM en SSEA-1 + / Epcam- cellen. &quot;&gt; Terwijl de iPS cellen die door de geschetste protocol en muizenmodel is aangetoond dat pluripotent zijn en effectief bij aan alle weefsels van chimere dieren 15,20, een verlaagd vermogen om embryo volledig uit deze iPS cellen via tetraploïde complementatie produceren geweest 24 aangetoond. Aberrant methylatie patronen op Dlk-DIØ3 gencluster geïdentificeerd als de oorzaak 24. echter toevoeging van ascorbinezuur in een concentratie van 50 ug / ml aan de media tijdens herprogrammering tetraploïde complementatie bevoegde iPS cellen 24 produceren. Houd er rekening mee dat een alternatief herprogrammeerbare muismodel ontwikkeld om de herprogrammering factoren op een andere stoichiometric uiten kan tetraploïde bevoegde iPS cellen te produceren, zelfs in de afwezigheid van ascorbinezuur behandeling 25. Echter, in onze handen cellen van deze stam herprogrammeren tegen aanzienlijk lagere frequentie in vergelijking de hierin gebruikte muis modusl. De in dit manuscript beschreven methodologie laat de scheiding van herprogrammering tussenproducten van de vuurvaste grootste deel van de bevolking en moet worden gezien als waardevol instrument om te ontleden en te begrijpen van de herprogrammering proces, het verwijderen van de vorige beperkingen van het hebben van een unfractioned bevolking gebruikt voor profiling (bijvoorbeeld, hoge signaalruis van de vuurvaste cellen). De antilichaam combinatie hierin beschreven maakt isolatie van tussenproducten van muizencellen met hoge zuiverheid, maar het is mogelijk dat aanvullende celoppervlak markers worden ontdekt in de toekomst waarmee tussenproducten verkregen bij nog hogere zuiverheid. Let SSEA-1 expressie is geen kenmerk van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en daarom dit protocol kan niet worden gebruikt herprogrammering cellen van menselijke oorsprong. Concluderend kan herprogrammering tussenproducten eenmaal geïsoleerd met de beschreven werkwijze worden toegepast voor moleculaire analyses waaronder expressie profiling, chromatine immunoprecipitatie methyloom analyse en eiwit assays.

Embryonale stamcellen (ES) cellen zijn afgeleid van de binnenste celmassa van de blastocyst embryo&#39;s 1. Onder de juiste kweekomstandigheden ze zichzelf te vernieuwen en blijven pluripotent. In 2006 Yamanaka en collega&#39;s toonden aan dat volwassen cellen in zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen kunnen worden geherprogrammeerd door geforceerde expressie van de transcriptiefactoren oktober-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) 2. iPS cellen, zoals embryonale stamcellen, kunnen aanleiding geven tot alle celtypes van het lichaam te geven, maar zij niet onder de ethische discussie rondom het genereren van ES-cellen 3. Bovendien iPS cellen dragen de belofte van gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde en houd enorm potentieel voor toepassingen zoals de ziekte van modellering en in vitro drug screening 4,5. Om voor het herprogrammeren van de technologie om dit potentieel te vervullen, de fundamentele mechanisme van nucleaire herprogrammering moet volledig worden begrepen. Echter, de inspanningen om de herprogrammering pat ontledenHWAY werden gehinderd door het feit dat slechts een zeer klein aantal cellen te herprogrammeren (0,1-1%). Succesvol herprogrammering fibroblasten gemeld een afzonderlijke evenementen: een mesenchymale aan epitheliale transitie 6-10 en, in de laatste fase van herprogrammering, activering van het endogene kern pluripotentie netwerk 11-14 ondergaan. Wij en anderen 12,13,15-17 onlangs werd een lijst van celoppervlak markers dat zorgt voor de scheiding van zeldzame tussenproducten van de vuurvaste massa bevolking. Herprogrammering muis embryonale fibroblasten (MEF) ondergaan veranderingen in de expressie van Thy-1.2, Ssea1 en EpCAM (onder andere) in de 2 weken durende herprogrammeringsproces 15. Vroeg tijdens het herprogrammeren van een subset van MEF neerwaarts reguleren van de expressie van fibroblast identity marker (Thy-1.2) en start de uiting van de-pluripotency bijbehorende marker SSEA-1 12. Tijdens de laatste fase van de herprogrammering Ssea1-positieve cellen Reactivaten endogene pluripotency genen zoals Oct-4 10-13,15. Deze laatste overgang wordt aangegeven op het celoppervlak door detecteerbare expressie van EpCAM (zie figuur 1) of in een later stadium PECAM 15. Onlangs, O&#39;Malley et al. Beschreven het gebruik van CD44 en iCAM1 alternatief of aanvulling op Thy-1.2 en SSEA-1 voor de identificatie van herprogrammering tussenproducten. We hebben eerder FACS geëxtraheerd herprogrammering tussenproducten van dag 0, dag 3, dag 6, dag 9 en dag 12 herprogrammering culturen en van gevestigde iPS cellijnen basis van deze celoppervlak markers 15,18. Om de hierna beschreven herprogrammering systeem voorwaarden we zien bij de enkele cel niveau dat hoewel de populaties rustige homogeen, er een zekere mate van heterogeniteit in de geïdentificeerde tussenliggende populaties. Opgemerkt wordt dat slechts een subset van cellen in deze populaties kunnen doorstromen naar de respectieve volgende stage van het herprogrammeringsproces en leiden tot iPS cel kolonies op verschillende efficiënties, die uitgebreid vooraf 15,19 hebben gekenmerkt. Bovendien zal de herprogrammering efficiëntie van deze populaties ook afhankelijk van de re-plating en kweekomstandigheden. Om experimentele reproduceerbaarheid verhogen we een herprogrammeerbare muizenstam die is ontworpen om een transcriptionele transactivator (m2rtTA) onder controle van de Rosa26 locus en een polycistronisch OKSM cassette onder controle van een doxycycline reagerende promotor 20,21 expressie. Met behulp van dit muismodel omzeilt de ongewenste neveneffecten van de traditionele virale methoden van iPS cel generatie, dat wil zeggen, een heterogene populatie start met cel naar cel variabiliteit in het aantal en de locatie van integratie plaatsen van virale inserts. Twee transgene muis stammen (OKSM, m2rtTA), verkrijgbaar als homozygote oprichter dieren bij het Jackson Laboratory, moeten worden overgestoken om de reprogra vestigenmmable muismodel (zie figuur 2). In dit manuscript beschrijven we in detail hoe MEF ontlenen, het genereren van iPS cellen, en het isoleren van de herprogrammering tussenproducten in verschillende stadia van het conversieproces door FACS.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue&nbsp;</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>48-0902-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin&nbsp;</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>13-8813&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cy 7&nbsp;</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>25-4317-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc&nbsp;</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>48-5791-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11360-070&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11140-050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS)&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>10439024</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>25200-056&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>35050-070&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>21985-023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide solution (PI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4864-10ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine from porcine skin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G1890&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin hyclate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>33429-100MG-R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor (LIF)&nbsp;</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>ESG1107&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11960-044&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline)&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>10829-018&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Irradiated MEFs&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>S1520-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>75-cm2 Tissue culture flasks&nbsp;</td><td>Corning/BD Bioscience&nbsp;</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>15-ml centrifuge tubes&nbsp;</td><td>Corning/BD Bioscience&nbsp;</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50-ml centrifuge tubes&nbsp;</td><td>Corning/BD Bioscience&nbsp;</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Disposable surgical blades&nbsp;</td><td>Clifford Hallam</td><td>SM0501</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials&nbsp;</td><td>Corning/BD Bioscience&nbsp;</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m Cell strainer&nbsp;</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>10342-020&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

celoppervlaktemerker mediated zuivering van ips cell intermediates van een herprogrammeerbare muismodel

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mature cellen kunnen opnieuw worden geprogrammeerd naar een pluripotente toestand. Deze zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) kunnen zich ontwikkelen tot alle celtypen in het lichaam en hebben daarom een enorm potentieel voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Traditioneel worden iPS-cellen gegenereerd door virale introductie van transcriptiefactoren Oct-4, Klf-4, Sox-2 en c-Myc (OKSM) in fibroblasten. Reprogrammering is echter een inefficiënt proces waarbij slechts 0,1-1% van de cellen terugkeert naar een pluripotente toestand, waardoor het moeilijk is om het reprogrammeringsmechanisme te bestuderen. Een bewezen methodologie die het mogelijk heeft gemaakt om het reprogrammeringsproces te bestuderen, is om de zeldzame intermediaire producten van de reactie te scheiden van de refractaire bulkpopulatie. In het geval van muis-embryonale fibroblasten (MEF's) hebben wij en anderen eerder aangetoond dat reprogrammeringscellen een duidelijke reeks veranderingen ondergaan in het expressieprofiel van celoppervlaktemarkers die kunnen worden gebruikt voor de scheiding van deze cellen. Tijdens de vroege stadia van OKSM-expressie verliezen succesvol reprogrammeringscellen de fibroblastidentiteitmarker Thy-1.2 en reguleren ze de pluripotentie-geassocieerde marker Ssea-1 op. De laatste overgang van een subset van Ssea-1-positieve cellen naar de pluripotente toestand wordt gemarkeerd door de expressie van Epcam tijdens de late stadia van reprogrammering. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om reprogrammeringsintermediairen te isoleren uit culturen van reprogrammerings-MEF's. Om de experimentele reproduceerbaarheid te verhogen, gebruiken we een herprogrammeerbare muisstam die is gemodificeerd om een transcriptioneel transactivator (m2rtTA) onder controle van de Rosa26-locus en OKSM onder controle van een doxycycline-responsief promotor uit te drukken. Cellen geïsoleerd uit deze muizen zijn isogene en drukken OKSM homogeen uit na toevoeging van doxycycline. We beschrijven in detail de oprichting van de herprogrammeerbare muizen, de afstamming van MEF's en de daaropvolgende isolatie van intermediairen tijdens reprogrammering naar iPS-cellen via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS).

Na dissectie, disaggregatie en plating van een E13.5 muis embryo wordt een 10 cm schaal wordt naar confluentie bereiken in ongeveer 1 tot 2 dagen. In dit stadium is het normaal dat de cultuur om wat aanhangende stukjes weefsel die niet goed zijn cellularized bevatten. Deze verdwijnt na passage. Bij doxycycline inductie, het herprogrammeren van MEF ondergaan verschillende morfologische veranderingen. Rond dag 6 dienen de snelle kolonie-achtige vlekken beginnen te ontstaan ​​(Figuur 4C). Deze zullen blijven groeien in omvang bij nader cultuur (zie figuur 4D, E). Een goede herprogrammering experiment moet leiden&gt; 500 kolonies per T75 die aanvankelijk werd geënt met 5 x 10 5 cellen (Figuur 4E). Opgericht iPS culturen bezitten karakteristieke koepelvormige kolonies en moet meestal verstoken van gedifferentieerde cellen (Figuur 4F) zijn. Af en toe extra passage van iPS cultures kan worden verplicht om ongedifferentieerde / gedeeltelijk geherprogrammeerd cellen te verwijderen; Een confluente fles cellen kunnen worden gesplitst in een verhouding van 01:10 op een feeder-laag van bestraalde MEFs. Zoals hierboven vermeld, zijn morfologische en moleculaire veranderingen tijdens herprogrammering weerspiegeld door veranderingen in de FACS profielen Thy-1.2, SSEA-1 en uiteindelijk EpCAM (zie figuur 7A-F). Zoals eerder 12,15 gemeld, terwijl MEF zijn overwegend positief voor Thy-1.2 en negatief voor de andere markers, Dag 3 culturen al kijken duidelijk anders. Een groot deel van de cellen begonnen met neerwaarts reguleren van de expressie van Thy-1.2 en een zeer klein deel van deze Thy-1.2 negatieve cellen positief voor SSEA-1, het werkelijke herprogrammering tussenproduct voor dit tijdstip wordt. Het aantal herprogrammering tussenproducten die kunnen worden geëxtraheerd uit Dag 3 culturen zeer onvoorspelbaar als het percentage van SSEA-1 + / Thy-1.2-meestal in een bereik tussen 1-10% van viable cellen. Op dag 6 en 9 een verhoogd percentage van SSEA-1 +-cellen, gewoonlijk ruim boven 10%, kan worden gedetecteerd. Rond dag 12 een subset van SSEA-1 positieve cellen kan worden vastgesteld dat positief label voor EpCAM. Dag 12 culturen, zoals Dag 3 culturen vertegenwoordigt een knelpunt bij de zuivering van tussenproducten, als het percentage SSEA-1.2 + / EpCAM + cellen is variabel en meestal vallen in het bereik van slechts 2-4% van alle levende cellen. Het verwachte aantal herprogrammering tussenproducten weergegeven in tabel 1 geldt slechts als een ruwe benadering. Opgericht bonafide iPS cellijnen zal sterk positief zijn voor SSEA-1 en EpCAM. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur marker 1 Surface veranderingen tijdens de herprogrammering pad: Neerregeling van fibroblast identity marker Thy-1.2 wordt gevolgd door een up-regulatie vanSSEA-1. De overgang van een subset van SSEA-1-positieve cellen in de richting van een pluripotente toestand wordt aangegeven door overname van EpCAM- rond dag 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2 Schematische weergave van de herprogrammeerbare muismodel. M2rtTA expressie onder controle van de alomtegenwoordige actieve Rosa26 locus in aanwezigheid van doxycycline (DOX) de m2rtTA eiwit bindt aan een tetracycline afhankelijke promoter (tetOP) en collageen 1A1 (COL1A1) locus resulteert in de expressie van de vier-factor cassette. Twee bicistronische cassettes zijn verbonden door een interne ribosoom intreedlocatie (IRES). Open leesramen voor Oct-4 / Klf-4 en Sox-2 / c-Myc zijn fu<html> sed door zelf-splitsende F2A en E2A- sequenties, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 Embryo dissectie: (A) Transfer baarmoedertak in een 10 cm schaal gevuld met 10 ml PBS en (B) in stukken met een embryo. (C) met behulp van een tang te bevrijden van de embryo&#39;s van extra embryonaal weefsel en verwijder het hoofd, de ledematen, de staart en de inwendige organen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> les / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figuur 4 morfologische veranderingen gedurende de herprogrammering. Kolonie-achtige vlekken zichtbaar worden in de culturen die vanaf dag 6. Bonafide iPSCs worden gekenmerkt door een overkoepelde gevormde morfologie. (A) Dag 0 / MEF, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12, (F) iPS celcultuur. Schaalbalk:. 200 pm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig5highres.jpg" width="500" /> Figuur 5 Basic FACS setup. (A) Uitsluiten puin met Side versus voorwaartse verstrooiing Area vlek. (B)Aggregaten van niet-puin te sluiten door gating op enkele cel populatie met Forward Scatter omgeving versus Forward Scatter High vlek. (C) Uitsluiten dode cellen van enkele cel populatie door gating op PI laag evenementen met PI kanaal versus Forward Scatter Area vlek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig6highres.jpg" width="500" /> Figuur 6 Gating. (A, B) De ongelabelde controlecellen ingesteld poorten voor Thy-1.2 + / SSEA-1-cellen, Thy-1.2-/ SSEA-1-cellen en Thy-1.2-/ SSEA-1 + cellen. (C) Gebruik de ongelabelde regelcellen om poorten voor EpCAM- positieve en EpCAM- negatieve cellen. (D) SSEA-1 + / Thy-1.2-cellen kunnen worden gescheidenin een EpCAM positieve en in een EpCAM negatieve bevolking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig7highres.jpg" width="500" /> Figuur 7 Thy-1.2 versus SSEA-1 FACS vlekken in verschillende stadia van de herprogrammering proces. (A) Dag 0 / MEF, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12, (F) iPS celcultuur. Tabel 1 Aanbevolen zaaien dichtheid, fles nummer en de verwachte uitkomst voor P1 MEF van een embryo heterozygoot voor OKSM en m2rtTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig7large.jpg" target="_blank">Klik h</a>ere aan een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Dag </td><td> Aantal T75 kolven gezaaid op dag 0 </td><td> Totaal aantal Ssea1 + cellen na FACS </td><td> Totaal aantal Ssea1 + / EpCAM + cellen na FACS </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 8 </td><td> 2 miljoen </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 2 miljoen </td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 2 miljoen </td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 10 </td><td> 10 miljoen </td><td> 2 miljoen </td></tr></tbody></table>

Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.

Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van de zeldzame herprogrammerings-intermediaten uit culturen van herprogrammeerbare embryonale muis-fibroblasten. Dit wordt bereikt door eerst embryonale muis-fibroblasten af te leiden van E 13.5 embryo's van een herprogrammeerbare muizenstam. In de tweede stap worden de embryonale muis-fibroblasten met een laag passagegetal uitgezaaid in media voor geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPS-cellen), aangevuld met doxycycline om het herprogrammeringsproces te initiëren.Vervolgens worden de cellen geoogst op geselecteerde tijdstippen tijdens de herprogrammering en gelabeld met antilichamen tegen specifieke markers op het celoppervlak. Uiteindelijk kunnen de zeldzame herprogrammeringsintermediairen worden geïsoleerd via FACS voor verdere experimentele analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat mechanistische studies kunnen worden uitgevoerd op de zeldzame herprogrammeringsintermediairen zonder de aanwezigheid van cellen die resistent zijn tegen het herprogrammeringsproces, welke het grootste deel van de populatie vormen. Om muizen embryonale fibroblasten of mesenchymale cellen te genereren, begint u met het overbrengen van een baarmoederhoorn van een embryo van dag 13.5 naar een weefselkweekschaal van 10 centimeter die 10 milliliter steriele PBS bevat.Gebruik vervolgens gesteriliseerde scharen van chirurgische kwaliteit om de hoorn in individuele stukken te knippen, waarbij elk stuk één embryo bevat. Gebruik daarna, onder een dissectiemicroscoop in een weefselkweekkast, gesteriliseerde pincetten om voorzichtig de baarmoederwand en het extra-embryonaal membraan rondom elk embryo te verwijderen en breng elk ontbloot embryo over naar individuele schaaltjes van 10 centimeter met 10 milliliter verse PBS. Vervolg daarna door de kop, ledematen, staart en interne organen van elk embryo met een pincet te verwijderen.Bevries de koppen in individuele 1,5 milliliter buisjes voor genotypering indien nodig. Breng elke romp over naar nieuwe individuele 10 centimeter platen en gebruik twee chirurgische mesjes om elk embryo gedurende twee minuten fijn te malen. Verteer de weefselstukjes in 200 microliters trypsin EDTA gedurende drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door nog twee minuten fijnmalen.Inactiveer vervolgens het trypsine met twee milliliter meth-medium en breng de cellsuspensie over naar een buis van 15 milliliter met behulp van een 1000 µL pipette. Dissocieer het weefsel verder mechanisch door voorzichtig te pipetteren en breng de celoplossing vervolgens over naar een met gelatine gecoate schaal van 10 centimeter. Voeg nog eens 10 milliliter meth-medium toe aan de cultuur.Na 24 tot 48 uur moet de plaat dicht bezet zijn met MEF's. Om de MEF's te herprogrammeren, wordt eerst een bevroren MEF-cultuur met een laag passage aantal ontdooid in een waterbad van 37 °C, waarna de inhoud wordt overgebracht naar een buis met 10 mL voorverwarmd MEF-medium. Na het centrifugeren van de cellen wordt de pellet geresuspendeerd in 12 mL vers MEF-medium en wordt de celsuspensie overgebracht naar een met gelatine gecoate T75-kweekfles. Na een herstelperiode van 24 tot 48 uur worden de MEF's gewassen met PBS en vervolgens gedetacheerd met drie mL trypsine-EDTA gedurende drie tot vijf minuten bij 37 °C.Stop vervolgens de enzymatische digestie met vijf milliliter meth-medium enst dissocieer de cellen verder door voorzichtig te mengen met een 10 milliliter pipet. Reprogrammeer daarna de mets door de cellen uit te zaaien op nieuwe, met gelatine gecoate T 75-flessen bij 6,7 × 10³ cellen per vierkante centimeter in 12 milliliter iPSC-medium dat twee microgram per milliliter doxycycline bevat gedurende de eerste zes dagen. Vervang het medium om de dag door vers met doxycycline aangevuld iPSC-medium en oogst de reprogrammeringsintermediairen op de vereiste tijdstippen door detachement met trypsine-EDTA, zoals zojuist gedemonstreerd voor elke geoogste intermediair-suspensie.Was de cellen in PBS. Resuspendeer vervolgens. Suspendeer de pellets in fax-medium voor antilichaamlabeling om volledig gereprogrammeerde iPSC-culturen te verkrijgen.Kweek de cellen nog vier tot zeven dagen in doxycycline-vrij IPSC-medium om de gereprogrammeerde cellen te labelen. Label de geoogste intermediairen met de geschikte antilichamen van belang. Tik na 10 minuten voorzichtig tegen de buisjes om de cellen te resuspenderen en plaats de buisjes vervolgens nog 10 minuten op ijs.Was na de tweede incubatie de cellen in 10 milliliters koud PBS per buis. Aspireer vervolgens voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellets in een passend volume labelingsmedium aangevuld met strippin P maat zeven op ijs. Was na 20 minuten de cellen in opnieuw 10 milliliters koud PBS en resuspendeer de celpellets in labelingsmedium aangevuld met propidiumjodide.Filter alle celklompen uit door de suspensie door een 70 micrometer zeef te gieten en breng de cellen vervolgens over naar de bijbehorende fax-buisjes op ijs. Voor de compensatiecontroles: resuspendeer een cryovial met IPS-cellen, onderhouden op bestraalde mes, in 800 microliters labelingsbuffer.Zet 200 µL cellen apart voor de ongelabelde controle. Verdeel vervolgens de resterende celsuspensie over drie buisjes van 15 mL voor de enkelkleurcontroles en label de monsters zoals zojuist gedemonstreerd om de intermediairen via flowcytometrie te analyseren. Begin met het instellen van een gate in de forward- en side-scatterplot om debris uit te sluiten.Gebruik vervolgens de forward scatter height tegenover de forward scatter area om aggregaten uit te sluiten, en het PI-kanaal tegenover de forward scatter. Gate hierbij op de PI-negatieve levende cellen. Gebruik de niet-gelabelde cellen om de voltages voor de Pacific blue, FITC en PSI seven-kanalen aan te passen.Positioneer de celpopulatie idealiter aan het lage uiteinde van het betreffende kanaal. Stel vervolgens de gates in met de ongelabelde controlecellen om de herprogrammeringsculturen te onderverdelen in dag drie, zes en negen. Populaties van SSEA one negatieve TH 1.2 positieve cellen, SSEA one negatieve TH 1.2 negatieve cellen en de herprogrammeringsintermediairen SSEA one positieve TH 1.2 negatieve cellen.Verder onderverdeel vervolgens de SSEA 1-positieve TH 1.2-negatieve fractie van dag negen met de SSEA 1 versus EPAM-plot. Trek met behulp van de ongelabelde controle gates rond de EPAM-positieve cellen en de EPAM-negatieve cellen, zoals hier getoond. Verzamel tenslotte de cellen in 1 tot 2 mL iPS-celmedium.Na inductie met doxycycline ondergaan herprogrammeringsmyten rond dag zes duidelijke morfologische veranderingen. Er beginnen vroege kolonie-achtige plekken te verschijnen die in grootte blijven toenemen bij verdere cultuur. Een succesvol herprogrammeringsexperiment resulteert in meer dan 500 kolonies per T 75, oorspronkelijk gezaaid met 5 × 10⁵ cellen, en gevestigde iPS-culturen vertonen karakteristieke koepelvormige kolonies en zijn grotendeels vrij van gedifferentieerde cellen.Morfologische en moleculaire veranderingen tijdens herprogrammering worden weerspiegeld in veranderingen in de expressie op het celoppervlak van thigh 1.2, SSEA one en uiteindelijk epca. Hoewel MES overwegend positief zijn voor thigh 1.2 en negatief voor de andere markers, is een groot percentage cellen tegen dag drie begonnen met het downreguleren van de expressie van thigh 1.2, en is een zeer kleine subset SSEA one-positief geworden. De eigenlijke herprogrammeringsintermediate voor dit tijdstip op dag zes en negen, een verhoogd percentage SSEA one-positieve cellen, gewoonlijk ruim boven de 10%, kan rond dag 12 worden gedetecteerd.Er kan een subset van SSEA-1-positieve cellen worden gedetecteerd die ook positief zijn voor epca. Gevestigde, bonafide iPS-celculturen zullen sterk positief zijn.Voor SSEA one en EPCA is het bij het uitvoeren van deze procedure belangrijk om er rekening mee te houden dat u alleen MAP-cellen met een laag passagegetal gebruikt die vooraf correct zijn geg genotypeerd.

cell-surface-marker-mediated-purification-ips-cell-intermediates-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Een methode om de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) via retrovirus-gemedieerde ectopische expressie van OCT4 genereren, wordt SOX2, KLF4 en MYC beschreven. Een praktische manier om de menselijke IPSC kolonies op basis van GFP expressie te identificeren wordt ook besproken.

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Dit protocol omvat gedetailleerde procedures voor de isolatie van urine-afgeleide cellen van patiënten met spierdystrofie; hun efficiënte en snelle herprogrammering door Sendai-virus transductie.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen

Het protocol in dit onderzoek beschrijft werkwijzen voor de real-time monitoring herprogrammering progressie via de kinetische meting van positieve en negatieve pluripotente stamcel markers gebruikt flowcytometrie analyse. Het protocol bevat ook de imaging-gebaseerde beoordeling van de morfologie, en merker of reporter expressie tijdens iPSC generatie.

Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Leer hoe je zeldzame herprogrammeringsintermediaten isoleert uit muizembryonale fibroblasten tijdens de omzetting naar iPS-cellen. Deze methode maakt mechanistische studies mogelijk zonder interferentie van niet-herprogrammerende cellen.

Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

Meer video's verkennen