Protocol voor Biofilm Streamer Vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers
20 augustus 2014
Protocollen voor de studie van biofilmvorming in een microfluïdisch apparaat dat poreuze media nabootst, worden besproken. Het microfluïdische apparaat bestaat uit een array van micro-pillaren en de biofilmvorming door Pseudomonas fluorescens in dit apparaat wordt onderzocht.
Het algemene doel van deze procedure is om de vorming van bacteriële streamers in een microfluïdisch apparaat met micro pijlers te demonstreren. Dit wordt bereikt door eerst de microfluïdische chip te fabriceren. De tweede stap van de procedure is om de geteste bacteriën te kweken, in dit geval pseudomonas fluorescentie.
De laatste stappen zijn om de experimentele opstelling samen te stellen, de bacteriën in de microfluïdische chip te injecteren en gegevens te verzamelen. Uiteindelijk kunnen resultaten de tijdelijke evolutie van streamers tonen via flu fluorescentie microscopie beelden. Visuele demonstratie van dit metaal is cruciaal omdat de verschillende stappen moeilijk te leren zijn.
Vanwege de interdisciplinaire aard van het experiment, vereist deze procedure siliciumwafels met diepe reactieve ionen etsing. De fotoresist op de wafels moet worden afgewassen. Begin met het stil houden van de master mal.
Voeg twee of drie druppels trichloroethyleen toe aan een flesje en plaats deze in een droogkast samen met het malontwerp omhoog ernaast. Na twee of drie uur zal de mal worden gesiliciseerd. Tijdens de silicisering, bereid de PDMS mix sigaar 1 8 4 siliconen basis met een verhardingsmiddel in een verhouding van 10 tot 1 voor.
Ontgast vervolgens de PDMS onder vacuüm gedurende ongeveer twee uur. Breng nu een gesiliciseerd wafer over naar een houder en giet de PDMS erover, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan. Laat de PDMS twee uur op de wafer uitharden bij 80 graden Celsius.
Dit fabriceert een A-P-D-M-S stempel van de gedimensioneerde silicium mal. Wanneer het uitharden voltooid is, verwijdert u de PDMS stempel met behulp van een snijder. Snijd vervolgens de stempel in een microfluïdische chip met de snijder.
Nu, gebruik een snijboor om gaten te boren op de inlaat- en uitlaatposities op de stempel. De volgende stap is om de stempel aan glas te hechten. Breng een 24 millimeter dekglas en de PDMS stempel gedurende 30 seconden bloot aan zuurstofplasma.
Na de belichting, bevestigt u het dekglas aan de onderkant van de PDMS stempel en er zal een binding worden gevormd. Plaats de constructie in een oven van 70 graden Celsius gedurende 10 minuten. Om het proces voor dit protocol te voltooien, bereid LB platen gemaakt met ultrapuur water en gedoseerd met 50 microgram per milliliter tetracycline toegevoegd bij 50 tot 55 graden Celsius.
Bij het gieten van de platen, kunnen luchtbellen worden verwijderd door ze te ontvlammen. De afgekoelde en gestolde platen moeten worden gedateerd en worden bewaard bij vier graden Celsius in een aluminiumfolie wikkel. Bereid ook LB bouillon gemaakt met ultrapuur water en gedoseerd met 50 microgram per milliliter tetracycline.
Bewaar de bouillon bij vier graden Celsius en wikkel ook in folie. Kweek nu voorraden van pseudomonas fluorescentie opgeslagen bij min 80 graden Celsius op de LB platen, streek de platen in een zigzag patroon en incubeer ze een nacht bij 30 graden Celsius in het donker. De volgende dag, pluk een kolonie van de plaat en inoculeer een flesje met vers bereide S een overnacht geïncubeerd bij 30 graden Celsius met 150 RPM schudden.
Meet de optische dichtheid van de cultuur na de incubatie. Maak vervolgens de S twee oplossing. Voeg vijf milliliter LB toe aan een plastic buis en voeg vervolgens voldoende S een oplossing toe voor een OD bij 600 nanometer van 0,1, wat typisch is voor een biofilm experiment.
Stel eerst het experiment op met behulp van pincetten. Verbind plastic buizen met een binnendiameter van 0,20 inch aan de inlaten en uitlaten van de voorbereide chip. De buizen moeten flexibel en voldoende lang zijn. Hier zijn ze ongeveer 20 inch.
Vul vervolgens spuiten met de S twee oplossing. Bevestig 30 gauge stompe naalden en verwijder luchtbellen. Het voorkomen van luchtbellen in de kanaal is een cruciale stap, vooral vanwege de duur van het experiment.
Luchtbellen kunnen de zachte structuren die door de bacteriën worden gevormd, beschadigen. Verbind vervolgens de spuiten met de inlaatbuizen en verbind de uitlaatbuizen met afvalcontainers. Plaats nu de spuiten in een spuitpomp en stel de pomp in op de gewenste stroomsnelheid, zoals acht microliter per uur op een microscoop uitgerust met een celkamer ingesteld op de incubatietemperatuur.
Gebruik een 40 x objectief om de microfluïdische chip te bekijken. Start nu de pomp. Wanneer de bacteriën in de kamer worden geïntroduceerd, wordt ook de biofilmvorming geïnitieerd.
De biofilm zal zich uren, dagen vormen en volwassen worden, neem foto's om de voortgang te volgen. Met behulp van SEMA werd een gefabriceerde microfluïdische chip geïmager. De vork-achtige ingang is gemaakt om de drukkop over het apparaat te gelijken.
Er kan ook worden gezien dat de pilaarwanden bijna verticaal zijn. Om biofilmvorming te onderzoeken, werd fluorescentie in het apparaat geïnjecteerd bij acht microliter per uur. Biofilmvorming begon na enkele minuten van infusie van de verdunde bacteriecultuur.
Echter, na een paar uur werd het verschijnen van filamenteuze structuren waargenomen die zich tussen micro pijlers uitstrekten in de buurt van het middengedeelte. De gestippelde ellips bepaalt een zich vormende streamer. Streamers werden ook gevormd en gebonden aan het ene uiteinde aan het poolgebied van een van de micro pijlers. Streamers werden ook gezien langs de diagonaal tussen twee micro pijlers.
De dikte van de streamers nam toe met de tijd als gevolg van celdeling, evenals incorporatie van planktonische bacteriën. Ze verspreidden zich ook met de tijd en streamers die een groot volume in het apparaat bezetten, leidden tot de vorming van volwassen biofilm, die het apparaat kon verstoppen. Een mechanische simulatie van de stroming door het apparaat toont aan dat streamers zich aanvankelijk langs vloeistof stroomlijnen oriënteren.
Bovendien, in de beginfase, ontstaan streamers op locaties met de hoogste stroomsnelheid. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe biofilm streamers zich vormen en evolueren in een microfluïdisch milieu. Vergeet niet dat het werken met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt protocollen voor het bestuderen van biofilmvorming met behulp van een microfluïdisch apparaat dat is ontworpen om poreuze media na te bootsen. De focus ligt op het onderzoek naar de vorming van biofilmen door Pseudomonas fluorescens binnen dit apparaat.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microfluïdica
- Biofilmvorming
- Bacterieel gedrag
Achtergrond
- Microfluïdische apparaten kunnen complexe omgevingen nabootsen.
- Pseudomonas fluorescens is een modelorganisme voor biofilmstudies.
- Het begrijpen van biofilmvorming is cruciaal voor diverse toepassingen.
- Het visualiseren van bacteriële streamers verbetert het begrip van biofilmdynamiek.
Doel van de studie
- Om de vorming van bacteriële streamers in een microfluïdische opstelling aan te tonen.
- Om het gedrag van Pseudomonas fluorescens in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken.
- Om een visuele weergave van de biofilmontwikkeling te bieden.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een microfluïdische chip met micropilaren.
- Kweken van Pseudomonas fluorescens voor experimenten.
- Opzetten van de experimentele opstelling voor biofilm-observatie.
- Injecteren van bacteriën in het microfluïdische apparaat en het verzamelen van gegevens.
Belangrijkste resultaten
- De tijdsontwikkeling van bacteriële streamers werd succesvol vastgelegd.
- Fluorescentiemicroscopie leverde duidelijke beelden op van biofilmvorming.
- De resultaten demonstreerden de dynamiek van de biofilmontwikkeling.
- Visuele hulpmiddelen verbeterden het begrip van het experimentele proces.
Conclusies
- Het microfluïdische apparaat bootst effectief poreuze media na voor biofilmstudies.
- Pseudomonas fluorescens dient als een waardevol model voor biofilmonderzoek.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor het begrijpen van complexe procedures.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt het mogelijk om bacteriële biofilm-streamers te bestuderen in een microfluïdische omgeving die poreuze media nabootst, wat een gecontroleerd systeem biedt om microbiële adhesie- en kolonisatiedynamiek te onderzoeken die relevant zijn voor industriële vervuiling en milieuprocessen. Door de vorming van filamenteuze biofilmen onder stroming te visualiseren, kunnen onderzoekers de mechanismen van biofilmontwikkeling in vroege stadia beoordelen, wat bijdraagt aan anti-foulingstrategieën en de optimalisatie van bioprocessen. De aanpak ondersteunt mechanistische risicoreductie bij de doelwitvalidatie voor antimicrobiële interventies of interventies die biofilms afbreken, door kwantitatieve, reproduceerbare observaties van de initiatie en rijping van streamers te leveren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar bacteriële adhesie en de productie van extracellulaire matrix onder gecontroleerde stroomcondities mogelijk om targets te valideren die betrokken zijn bij de initiatie van biofilms.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar microfluïdisch platform voor het screenen van genetische of chemische modulatoren van streamer-vorming in Pseudomonas fluorescens.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, tijdsondersteunende fluorescentiemicroscopie-uitlezingen van de dikte en dekking van streamers voor dosis-responsanalyse.
- Operationele waarde: Standaardiseert de omstandigheden voor biofilmvorming door nauwkeurige controle van de stroomsnelheid en chipgeometrie, wat de reproduceerbaarheid van de assay bij screeningcampagnes verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de evaluatie van biofilm-verstorende verbindingen in een ziekte-relevant systeem dat microbiële kolonisatie in industriële of ecologische niches nabootst.
- Operationele waarde: Maakt preklinische continuïteit mogelijk door microfluïdische observaties te koppelen aan macroscopische biofilmresultaten, zoals verstopping van apparatuur en flowobstructie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwithypothesen tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor programma's die gericht zijn op anti-infectieuze of anti-fouling middelen waarbij biofilmvorming een kritiek knelpunt is.
- Discovery Biology: Faciliteert mechanische risicoreductie door te visualiseren hoe genetische of chemische perturbaties de initiatie en verlenging van streamers tussen micropijlers beïnvloeden.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve imaging-outputs die vergelijking van biofilmvorming onder verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Analytics: Maakt meting van streamlitdikte, oriëntatie en oppervlaktebedekking over tijd mogelijk om de effectiviteit van verbindingen te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt microfluïdische observaties met preklinische relevantie door de ontwikkeling van biofilms te modelleren in gestructureerde omgevingen die analoog zijn aan medische of industriële oppervlakken.
- Hergebruik in de onderneming: Vestigt een modulair microfluïdisch platform dat aanpasbaar is aan andere bacteriële stammen of stromingscondities voor brede R&D-toepassingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit bij biofilmvorming door het effect van stroming en oppervlaktetopologie op de ontwikkeling van streamers te isoleren.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en schaalbaarheid via fabricage met soft-lithografie en gecontroleerde protocollen voor bacteriële inoculatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen in antimicrobiële programma's door vroegtijdige voorspellende zekerheid te bieden over de effectiviteit van biofilmremming.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten op basis van hun vermogen om streamer-gemedieerde biofilmrijping en systeemvervuiling te voorkomen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microfluïdische fabricage, steriele bacteriële hantering en fluorescentiemicroscopie.
- Is afhankelijk van toegang tot cleanroom-apparatuur voor PDMS-gieten en zuurstofplasmabonding.
- Vereist standaardisatie van stroomsnelheden, bacterieel inoculum en incubatietijd over verschillende gebruikers en locaties.
- Aanpassing aan andere bacteriële soorten kan optimalisatie van kweekcondities en oppervlaktecompatibiliteit vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten mogelijke verstopping van kanalen in gevorderde biofilmstadia, waardoor timing van het eindpunt voor beeldvorming noodzakelijk is.
