Name: Protocol voor Biofilm Streamer Vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer de vorming van bacteriële streamers bestuderen in een microfluïdische chip met micro-pijlers. Dit protocol toont biofilmontwikkeling met Pseudomonas fluorescens en fluorescentiemicroscopie voor gedetailleerde visualisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Professor Howard Ceri van het Biological Sciences Department van de University of Calgary bedanken voor het verstrekken van bacteriestammen. A. Kumar erkent de steun van NSERC. T. Thundat erkent financiële steun van het Canada Excellence Research Chair (CERC) programma. De auteurs willen ook de hulp van mevrouw Zahra Nikakhtari erkennen voor de hulp bij de videografisch opnames.

Voer de testprotocollen hier in de hieronder beschreven volgorde. Microfabricage protocollen voor het creëren van microfluïdische platform worden besproken in Stap 1 Stap 2 wordt de bacteriecultuur protocol (figuur 2), en Stap 3 betreft de montage van de experimentele opstelling (figuur 3). Ten slotte wordt de werkelijke experimentele stap beschreven in stap 4. 1 Chip Fabrication Procedure OPMERKING: De juiste veiligheidsprocedures moeten worden gevolgd voor de hieronder beschreven processen. Raadpleeg de institutionele veiligheidsfunctionaris voor details. <ol><li> Het ontwerp van de masker met een geschikte software (bijvoorbeeld L-Edit). Het kanaal ontwerp bestaat uit een hoofdgebouw micro-kanaal van de breedte 625 micrometer. Het centrale gebied van het kanaal bevat een array van micro-posten 50 micrometer diameter, afstand 25 urn elkaar (zie brief Files). </li><li> Print dit ontwerp op glas (5 &quot;x 5&quot; sodakalkglas), Die een dikte van 0,09 &quot;heeft en bekleed met ongeveer 70 nm dikke laag chroom (Cr), maskerprocedures om een ​​fotomasker te bereiden. Gebruik AZ400K ontwikkelaar voor 1 min. Vervolgens etsen de Cr-laag met Cr etsmiddel voor ongeveer 1 min Gebruik aceton te strippen de resist en maak hem schoon met koud piranha-oplossing. (H 2 SO 4 en H 2 O 2 in een verhouding van 3: 1). </li><li> Fotolithografie <ol><li> Reinig een standaard 4 &quot;silicium wafer chemisch met piranha-oplossing gedurende 20 minuten. </li><li> Spoel de wafer met DI-water en droog het. </li><li> Verwarm de wafer op een hete plaat (200 ° C gedurende 15 min). </li><li> De vacht van de silicium wafer met fotolak. Hier, de positieve fotoresist AZ4620 werd spin-gecoat op een silicium wafer bij 2000 rpm gedurende 25 sec tot 12,5 urn dikke laag te verkrijgen. </li><li> Verwijder het oplosmiddel door zacht bakken van de wafer op een hete plaat door drijvende de wafer gedurende 90 seconden op stikstofstroom bij 100 ° C. Dan houd het in vacuüm bij thij dezelfde temperatuur gedurende 60 sec. </li><li> Plaats de wafer in een donkere doos voor 24 uur voor uitdroging. </li><li> Maak de wafer aan UV-licht om het ontworpen patroon overbrengen naar de fotoresist. </li><li> Dompel de wafer in fotolak ontwikkelaar oplossing (AZ400K) voor 240 sec. Spoel daarna de wafer met isopropyl alcohol en drogen door in een stroom stikstofgas. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (inductief gekoppeld plasma - Deep Reactive Ion ets) Proces <ol><li> Solliciteer DRIE etsen. Kies de gewenste etsdiepte volgens einddiepte vereist voor toestel (50 urn in dit onderzoek). Fotoresist werkt als een maskerende laag tijdens dit proces. </li><li> Verwijder de resterende fotolak met aceton en het reinigen van de wafer. </li></ol></li><li> PDMS (polydimethylsiloxaan) Gieten <ol><li> Gebruik trichloromethylsilane (TCMS) voor silaniseren het silicium meester mal. Giet 2 of 3 druppels trichloromethylsilane in een flacon en plaats het in een exsiccator naast desilicium meester schimmel. Laat 2-3 uur voor het silaneren proces te voltooien. </li><li> In een afzonderlijke houder, meng de Sylgard 184 siliconenbasis met verharder gewichtsverhouding van 10: 1 tot PDMS bereiden. Ontgas de PDMS door het aan voorwaarden (ongeveer 2 uur) stofzuigen. </li><li> Zet het silicium meester schimmel in een houder. Vervolgens giet de PDMS op silicium meester mal de PDMS stempel te vormen. Zorg ervoor dat belletjes vormen niet in het PDMS tijdens dit proces. </li><li> Genezen van de PDMS gedurende 2 uur bij 80 ° C. </li><li> Verwijder de PDMS stempel van de meester mal. Snij vervolgens de PDMS stempel in afzonderlijke microchips. Gebruik ten slotte een snij-kern om gaten te boren voor de inlaat (s) en de aansluiting (en). </li></ol></li><li> Verlijmen van PDMS aan Glass <ol><li> Expose de cover slip en PDMS stempel zuurstof plasma gedurende 30 sec. Bond PDMS stempel op de cover slip. </li><li> Om een ​​goede afdichting tussen de PDMS stempel en dekglas bereiken, hybridiseren de inrichting door deze in oven bij 70 ° C gedurende 10 minuten. </li&gt; </ol></li></ol> 2 Bacteriële Cultuur OPMERKING: Proper bioveiligheid protocollen moeten worden gevolgd voor Steps 2-4. Raadpleeg de institutionele veiligheidsfunctionaris voor details. <ol><li> Bereid LB agarplaten <ol><li> Voeg 20 g Luria-Bertani (LB) agar (Miller) poeders en 500 ml ultrazuiver water in een 1 L kolf. Roer tot het poeder op te lossen. </li><li> Steriliseren in autoclaaf bij 15 psi, 121 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Laat de kolf op een bankje of in een waterbad in de bioveiligheid kap afkoelen tot 50-55 ° C. </li><li> Voeg het antibioticum Tetracycline tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml te bereiken. Meng goed door werveling. </li><li> Giet het mengsel in platen. Vul elke plaat tot 1/2 - 2/3 vol. </li><li> Flame luchtbellen kort om ze pop als ze vormen. Verhard luchtbellen moeilijk bacteriekweek via spreiden. </li><li> Laat de platen overnacht afkoelen bij kamertemperatuur. </li><li> Wanneer ze zijn cool,zet borden terug in hun mouw, sluit de zak, label (antibiotica en datum), en bewaar bij 4 ° C. OPMERKING: Bedek de voorraad van de platen met aluminiumfolie, zo licht deactiveert veel antibiotica. </li></ol></li><li> LB Broth Voorbereiding <ol><li> Voeg 20 g Luria-Bertani (LB) bouillon (Miller) poeders en 1 L van ultrapuur water in een kolf. Roer tot het poeder op te lossen. </li><li> Steriliseren in autoclaaf bij 15 psi, 121 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Laat fles op een bankje of in een waterbad in de bioveiligheid kap afkoelen tot 50-55 ° C. </li><li> Voeg het antibioticum tetracycline tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml te bereiken. Meng goed door werveling. </li><li> Wanneer ze afgekoeld zijn, plaatst u de gelabelde fles bij 4 ° C. OPMERKING: Bedek de fles met aluminiumfolie, zo licht deactiveert veel antibiotica. </li></ol></li><li> Cultuur Bacteriën op een LB Agar Plate (Dit protocol maakt gebruik van Pseudomonas fluorescens) <ol><li> Neem de bacteriële voorraad uit de diepvries (-80 °; C) en plaats het op het ijs. </li><li> Plaats de -80 ° C bacteriële voorraad en een LB-agar plaat in een bioveiligheid kap. </li><li> Streak de bacteriestam op een LB-agar plaat in een zigzag patroon. Bedek de agar plaat en incubeer bij 30 ° C &#39;s nachts. Tenslotte worden opgeslagen plaat in de koelkast bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereid de Bacteriële Solution (S1) <ol><li> Giet 50 ml LB-bouillon-medium naar een kolf geautoclaveerd. Voer deze bewerking in een bioveiligheid kap. </li><li> Transfer een enkele bacteriële kolonie van de LB-agar plaat aan de kolf. Deze operatie moet ook worden uitgevoerd in een bioveiligheid kap. </li><li> Plaats de kolf in een shaker incubator bij 30 ° C en 150 rpm gedurende voldoende tijd (4 uur). </li></ol></li><li> Bereid de Verdun Bacteriële Solution (S2) <ol><li> Giet 5 ml LB-bouillon media in een steriele plastic buis. </li><li> Verdun S1 door mengen met LB-bouillon media. Vervolgens geschud oplossing. Verdun de oplossing te komen van de gewenste optischeal dichtheid (OD gemeten bij 600 nm = 0,1). OPMERKING: Biofilm experimenten doorgaans OD-waarden in deze omgeving in dienst. </li></ol></li></ol> 3 Bereid de opstelling van de proef <ol><li> Met een pincet verbinding flexibele kunststofbuizen (0,20 &quot;ID) in de inlaat (s) en uitlaat (s) van de microchip. De inlaten en uitlaten zijn vooraf geboord in de PDMS deel van de microchip (stap 1.5.5). In dit onderzoek , de microchip bestaat uit twee inhammen en een stopcontact. </li><li> Vul de spuit (en) met bacteriële oplossing (S2-oplossing) en verwijder alle luchtbellen in de spuit (en). </li><li> Sluit de spuit tip (s) (30 G 0.5 &quot;stompe naald) in de inlaat buis (s). Sluit vervolgens afvoerbuis (s) op de verpakking te verspillen. </li></ol> 4 Voer het Experiment <ol><li> Sluit de spuit (en) aan de spuit tip (s). </li><li> Plaats en fix spuit (en) op de injectiepomp. Plaats dan de microchip onder een optische microscoop met objectieven van desired vergroting (bijvoorbeeld 40X). Bedek de microchip met een levende cel kamer inrichting een constante temperatuur omgeving voor bacteriegroei (30 ° C voor P. fluorescens) handhaven. </li><li> Stel de pomp naar de gewenste stroomsnelheid niveau (bijvoorbeeld 10 ul / uur) en initiëren fluïdum pompen. </li><li> Zodra bacteriën worden aangebracht in de kamer, is de vorming van biofilm ook begonnen. Biofilmvorming en rijping zich meestal over een periode van enkele uren of zelfs dagen. Observeren en foto&#39;s maken van biofilm groei door de microscoop. </li></ol>

<ol><li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+together+now%3A+Integrating+biofilm+research+across+disciplines%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li>
<li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).</li>
<li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li>
<li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li>
<li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li>
<li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li>
<li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contam+Hydrol%22%5BJournal%5D)">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li>
<li>Neethirajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeethirajan%2C+S+%22Encylopedia+of+Nanotechnology%22">Encylopedia of Nanotechnology</a>. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).</li>
<li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li>
<li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1312.6056%22%5BJournal%5D)">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li>
<li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media%3A+energy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben laten zien een eenvoudige microfluïdische apparaat dat poreuze media nabootst voor het bestuderen van biofilm ontwikkeling in complexe habitats. Er zijn verschillende belangrijke stappen die de uitkomst van de experimenten bepalen. Zij omvatten geometrie apparaat. Terwijl de paal geometrie kan variëren, voldoende porie-ruimte voor streamers te vormen noodzakelijk. Bovendien Valiei et al. 1 hebben aangetoond dat streamer vorming treedt alleen in bepaalde Luchtdebiet. Bij een flow lager dan e...

Onlangs toonden we aan bacteriële biofilmvorming dynamiek in een microfluïdische apparaat dat poreuze media 1 nabootst. Bacteriële biofilms zijn in wezen kolonies van oppervlakte geaggregeerd bacteriën die worden omhuld door extracellulaire polymere stoffen (EPS) 2-4. Deze dunne films bacteriën kan vormen in bijna elke denkbare niche variërend van gladde oppervlakken de veel complexere habitat poreuze media. Valiei et al. 1 gebruikte een microfluïdische inrichting met een reeks micro-pijlers te simuleren een poreuze media structuur en bestudeerd biofilmvorming in deze inrichting als functie van de stroomsnelheid. Zij vonden dat in een bepaalde flow regime, draadvormige biofilms bekend als streamers begon te ontstaan ​​tussen de verschillende pijlers. Wimpels kan worden vastgebonden op een of beide uiteinden aan vaste oppervlakken, maar de rest van de structuur wordt gesuspendeerd in vloeistof. Streamer vorming begint meestal na een eerste laag van biofilm heeft gevormd en het formaation kan de evolutie van biofilm langdurige dicteren dergelijke complexe habitats. Onlangs hebben een aantal onderzoekers de dynamiek van de streamer vorming onderzocht. Yazdi e.a.. 5 bleek dat de streamers in wervelende stromen afkomstig van een oscillerende luchtbel kan vormen. In een ander experiment, Rusconi e.a.. 6 onderzochten het effect van het kanaal kromming en geometrie kanaal op de vorming van streamers. Zij vonden dat de streamers in gebogen secties microkanalen kunnen vormen en streamer morfologie heeft betrekking op motiliteit. Recent onderzoek heeft aangetoond dat streamers brede vertakkingen in verschillende natuurlijke en kunstmatige scenario&#39;s kunnen hebben als ze kunnen fungeren als voorlopers van de vorming van volwassen structuren in poreuze interfaces, leiden tot een snelle en katastrofisch biofilm proliferatie in een biomedische systemen, en ook aanzienlijke flow veroorzaken structuur interactions, etc 1,7-9. Biofilm streamers vormen i vaakn complexe habitats zoals poreuze media. Inzicht biofilmgroei in poreuze media omgeving is verschillende ecologische en industriële processen relevante zoals biologische afvalwaterzuivering 10, onderhouden goed boring integriteit in situaties zoals CO2 afvang 11 en verstopping van poriën in de bodem 12. Waarnemen biofilmvorming in dergelijke complexe habitats vaak moeilijk als gevolg van de ondoorzichtigheid van poreuze media. In dergelijke situaties kan microfluidics gebaseerd poreuze media platforms blijken uiterst voordelig als zij toestaan ​​dat real-time en in situ monitoring. Een ander voordeel van microfluïdische is de mogelijkheid om meerdere bioreactoren bouwen op een bio-microfluidic platform en tegelijkertijd zorgen voor online monitoring en / of opname van sensoren. De flexibiliteit meerdere laboratoriumexperimenten uitvoeren in een apparaat en het vermogen om significante relevante gegevens te verzamelen voor nauwkeurige statistische analyse is een belangrijke bijwoordantage van microfluïdische systemen 13,14. In de context van de bovenstaande discussie, zou begrijpen streamer vorming dynamiek in een poreuze media milieu gunstig verscheidene toepassingen. In deze studie hebben we de ontwikkeling van het protocol voor het onderzoek streamer vorming in een apparaat dat bootst poreuze media. Fabricage van de microfluïdische platform nodige maatregelen voor celcultuur en experimenten beschreven. In onze experimenten werd de wildtype bacteriële stam van Pseudomonas fluorescens P. toegepast. fluorescens, nature in de bodem, speelt een belangrijke rol bij het ​​handhaven bodemecologie 15. De bacteriestam werkzaam waren genetisch gemanipuleerd groen fluorescent eiwit (GFP) constitutief.

<table><tbody><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>suspensie 40 g in 1 L gezuiverd water</td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>suspensie 20 g in 1 L gezuiverd water</td></tr><tr><td>Bioveiligheidskast</td><td>Microzone Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>steriele 100 mm x 15 mm polystyreen petrischaal</td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 incubator shaker serie</td></tr><tr><td>50 ml gesteriliseerde centrifugeerbuis</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polypropyleen RNase-/DNase-vrij</td></tr><tr><td>Tetracycline vrije basis</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &#956;g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silicon</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Elastomeer basis en uithardingsmiddel</td></tr><tr><td>Positieve fotoresistor (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststof buis</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol voor biofilm streamer vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Verschillende bacteriële species bezitten het vermogen om te hechten aan oppervlakken en koloniseren ze in de vorm van dunne films genaamd biofilms. Biofilms die groeien in poreuze media zijn voor verschillende industriële en ecologische processen, zoals de behandeling van afvalwater en CO2 vastlegging relevant. We gebruikten Pseudomonas fluorescens, een Gram-negatieve aërobe bacterie, om biofilmvorming in een microfluïdische apparaat dat werkt poreuze media onderzoeken. De microfluïdische inrichting bestaat uit een array van micro-posten, die zijn vervaardigd met behulp van zachte lithografie. Vervolgens biofilmvorming in deze apparaten met stroom werd onderzocht en we tonen de vorming van biofilms draadvormige bekend als streamers in ons apparaat. De gedetailleerde protocollen voor de fabricage en assemblage van microfluïdische apparaat worden hier voorzien, samen met de bacteriecultuur protocollen. Gedetailleerde procedures voor experimenten met de microfluïdische apparaat worden ook gepresenteerd samen met de representatieveresultaten.

Met behulp van bovenstaande microfabricage protocol werd een PDMS microfluïdische gebaseerd is geconstrueerd. Figuur 1 toont de scanning elektronenmicroscoop (SEM) beelden van de PDMS apparaat. Figuur 1a toont de ingangssectie van de inrichting. Een vork-achtige ingang wordt gecreëerd om de druk het hoofd te egaliseren over het apparaat. Verdere SEM beeldvorming toonde ook aan dat de pilaar muren bijna verticale (Figuur 1b). De gekweekte bacteriële oplossing (fi...

Protocollen voor de studie van biofilmvorming in een microfluïdisch apparaat dat poreuze media nabootst, worden besproken. Het microfluïdische apparaat bestaat uit een array van micro-pillaren en de biofilmvorming door Pseudomonas fluorescens in dit apparaat wordt onderzocht.

Protocol voor Biofilm Streamer Vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Het algemene doel van deze procedure is om de vorming van bacteriële streamers aan te tonen in een microfluïdisch apparaat met micropilaars. Dit wordt bereikt door eerst de microfluïdische chip te fabriceren. De tweede stap van de procedure is het kweken van de geteste bacteriën, in dit geval Pseudomonas fluorescence.De laatste stappen zijn het samenstellen van de experimentele opstelling, het injecteren van de bacteriën in de microfluïdische chip en het verzamelen van gegevens. Uiteindelijk kunnen de resultaten de tijdsontwikkeling van streamers laten zien via fluorescentiemicroscopiebeelden. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de verschillende stappen moeilijk aan te leren zijn.Vanwege het interdisciplinaire karakter van het experiment vereist deze procedure siliciumwafers met deep reactive ion etching. De fotolak op de wafers moet worden afgewassen. Begin met het stilzetten van de mastermold.Voeg twee of drie druppels trichlooretheen toe aan een flacon en plaats deze samen met de matrijs, met de opening naar boven gericht, in een exsiccator. Na twee of drie uur zal de matrijs gesiliconiseerd zijn. Bereid tijdens de siliconisatie het PDMS-mengsel voor door siliconebasis Sylgard 184 te mengen met een uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1.Ontgas vervolgens de PDMS onder vacuüm gedurende ongeveer twee uur. Plaats nu een gesilozeerde wafer in een houder en giet de PDMS eroverheen, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan. Laat de PDMS twee uur lang uitharden op de wafer bij 80 °C.Hiermee wordt een A-P-D-M-S stempel gefabriceerd vanuit de op maat gemaakte siliciumvorm. Wanneer het uitharden is voltooid, wordt de PDMS-stempel met behulp van een cutter verwijderd. Snijd vervolgens de stempel met de cutter in een microfluïdische chip.Boor nu met een kernboor gaten op de posities van de inlaat en uitlaat van de stempel. De volgende stap is om de stempel aan glas te hechten. Stel een dekglas van 24 millimeter en de PDMS-stempel 30 seconden lang bloot aan zuurstofplasma.Bevestig na de belichting het dekglas aan de onderzijde van de PDMS-stempel zodat er een binding ontstaat. Plaats het geheel gedurende 10 minuten in een oven op 70 °C. Om het proces voor dit protocol te voltooien, bereid LB-platen die zijn gemaakt met ultrapuur water en zijn gedoseerd met 50 µg/mL tetracycline, toegevoegd bij 50 tot 55 °C.Bij het gieten van de platen kunnen bellen worden verwijderd door ze kort te vlammen. De afgekoelde en gestolde platen moeten worden voorzien van een datum en bij vier graden Celsius worden bewaard in een wikkel van aluminiumfolie. Zorg daarnaast dat er LB-bouillon is klaargezet, gemaakt met ultrapuur water en gedoseerd met 50 micrograms per milliliter tetracycline.Bewaar het medium bij 4 °C en wikkel het in aluminiumfolie. Zaai vervolgens cultuurstams van Pseudomonas fluorescence, bewaard bij -80 °C, uit op LB-platen; strijk de platen uit in een zigzagpatroon en incubeer ze een nacht bij 30 °C in het donker. Selecteer de volgende dag een kolonie van de plaat en inoculeer een kolf met vers bereid S1-medium; incubeer dit een nacht bij 30 °C bij 150 RPM schudden.Meet de optische dichtheid van de cultuur na de incubatie. Maak vervolgens de S twee-oplossing. Voeg vijf milliliter LB toe aan een plastic buisje en voeg daarna voldoende van de S één-oplossing toe voor een OD bij 600 nanometer van 0,1, wat gebruikelijk is voor een biofilmexperiment.Stel eerst de experimentele opstelling in met behulp van pincetten. Verbind plastic buisjes met een binnendiameter van 0,20 inches met de in- en uitlaten van de voorbereide chip. De buisjes moeten flexibel en voldoende lang zijn. In dit geval zijn ze ongeveer 20 inches.Vul vervolgens de spuiten met de S two-oplossing. Bevestig stompe naalden van 30 gauge en verwijder eventuele luchtbellen. Het voorkomen dat luchtbellen in het kanaal terechtkomen is een kritieke stap, vooral vanwege de duur van het experiment.Bubbels kunnen de zachte structuren die door de bacteriën zijn gevormd, beschadigen. Sluit vervolgens de spuiten aan op de inlaatbuizen en de uitlaatbuizen op afvalbakken. Plaats de spuiten nu in een spuitenpomp en stel de pomp in op de gewenste stroomsnelheid, zoals 8 µL per uur, op een microscoop die is uitgerust met een celkamer die is ingesteld op de incubatietemperatuur.Gebruik eventueel een 40 x objectief om de microfluïdische chip te bekijken. Start nu de pomp. Wanneer de bacteriën in de kamer worden geïntroduceerd, begint ook de vorming van de biofilm.De biofilm zal gedurende uren of dagen vormen en rijpen; neem afbeeldingen om de voortgang ervan te volgen. Er is gebruikgemaakt van een via SEMA gefabriceerde microfluïdische chip voor beeldvorming. De vorkvormige ingang is gecreëerd om de drukval over het apparaat te egaliseren.Er is ook te zien dat de wanden van de pilaren bijna verticaal zijn. Om de biofilmvorming te onderzoeken, werd fluorescentie in het apparaat geïnjecteerd met een snelheid van 8 µL per uur. De biofilmvorming begon na enkele minuten infusie van de verdunde bacteriële cultuur.Na enkele uren werd echter in de buurt van het middengedeelte de verschijning van filamenteuze structuren waargenomen die zich uitstrekten tussen de micropilaars. De gestreepte ellips bakent een vormende streamer af; streamers werden gevormd die aan één uiteinde vastzaten aan het poolgebied van een van de micropilaars. Streamers waren ook zichtbaar langs de diagonaal tussen twee micropilaars.De dikte van de streamers nam in de loop van de tijd toe door celdeling, evenals door de incorporatie van planktonische bacteriën. Ze prolifereerden ook na verloop van tijd, waarbij de streamers een groot volume in het apparaat innamen, wat leidde tot de vorming van een volgroeide biofilm die het apparaat kon verstoppen. Een mechanische simulatie van de stroming door het apparaat laat zien dat de streamers zich aanvankelijk oriënteren langs de stroomlijnen van de vloeistof.Bovendien ontstaan streamers in de beginfase op locaties met de hoogste stroomsnelheid. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe biofilmstreamers zich vormen en ontwikkelen in een microfluïdische omgeving. Vergeet niet dat werken met bacteriën uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals biosafety-protocollen.

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de fabricage van microfluïdische apparaten die cel te vangen en cultuur kunnen inschakelen. In deze benadering patroon microstructuren, zoals groeven in microfluïdische kanalen worden gebruikt om lage shear stress regio's waarbinnen de cel kan dock te creëren.

Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch co-cultuur model voor gelijktijdige en gelokaliseerde cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Dit model kan gebruikt worden voor het onderzoeken van de rol van verschillende oplosbare moleculaire signalen op pathogenese en het scherm van de effectiviteit van de vermeende probiotische bacteriestammen.

Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties

Source: Kurz, D. L., et al. Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates the use of a microfluidic device to study biofilm formation. A bacterial suspension is introduced into the microchannel, followed by incubation to allow biofilm development. Flow is then resumed, and pressure monitoring along with imaging is used to detect biofilm formation and pore blockage over time.

A Microfluidic Device for Real-Time Imaging and Pressure Tracking During Biofilm Formation

Een procedure voor het maken en weergeven van capillaire bruggen in spleet-poriegeometrie wordt gepresenteerd. De creatie van capillaire bruggen is afhankelijk van de vorming van pilaren om een directionele fysische en chemische heterogeniteit te bieden om de vloeistof vast te pinnen.  Capillaire bruggen worden gevormd en gemanipuleerd met behulp van microstages en gevisualiseerd met behulp van een CCD-camera.

Fabricage en visualisatie van capillaire bruggen in spleetporiëngeometrie

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Dit protocol beschrijft het gebruik van een aanpasbaar geautomatiseerde microfluidic apparaat te visualiseren van biofilm vorming in Candida albicans , onder fysiologische omstandigheden van de gastheer.

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Baanbrekende krommen (BBC's) zijn efficiënte instrumenten om het transport van bacteriën in poreuze media te bestuderen. Hier introduceren we tools op basis van vloeibare apparaten in combinatie met microscopie en flow cytometrische tellingen om BTC's te verkrijgen.

Het combineren van fluidic devices met microscopie en flow cytometrie om microbiële transporten te bestuderen in poreuze media over ruimtelijke schalen

We presenteren een technologie die capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch platform gebruikt om microgrote objecten die in een vloeistof zijn gesuspendeerd, zoals bacteriën en colloïden, te modelleren in voorgeschreven arrays op een polydimethylsiloxaansubstraat.

Patroonvorming van micro-organismen en microdeeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage

Het huidige protocol beschrijft een microfluïdisch platform om de ontwikkeling van biofilms in quasi-2D poreuze media te bestuderen door microscopiebeeldvorming met hoge resolutie te combineren met gelijktijdige drukverschilmetingen. Het platform kwantificeert de invloed van poriegrootte en vloeistofstroomsnelheden in poreuze media op bioclogging.

Een microfluïdisch platform om bioclogging in poreuze media te bestuderen

Leer de vorming van bacteriële streamers bestuderen in een microfluïdische chip met micro-pijlers. Dit protocol toont biofilmontwikkeling met Pseudomonas fluorescens en fluorescentiemicroscopie voor gedetailleerde visualisatie.

Protocol voor Biofilm Streamer Vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers

Meer video's verkennen