Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is het induceren van een zeer efficiënte differentiatie van dopaminerge neuronen in vitro. Dit wordt bereikt door eerst een adhesiecultuur van enkelvoudige menselijke pluripotente stamcellen voor te bereiden.

In de tweede stap wordt het celkweekmedium vervangen door neuron-inductiemedium om floorplate-progenitoren te induceren. Vervolgens worden de dopaminerge neuronen gekweekt in rijpingsmedium. Ten slotte worden de dopaminerge neuron-progenitoren in single-cell cultuur gekweekt op met poly-L-ornithine en fibronectine gecoate platen, in rijpingsmedium gedurende 30 dagen.

Uiteindelijk kan immunofluorescentiemicroscopie worden gebruikt om de expressie van belangrijke markers voor dopaminerge neuronen te beoordelen. Deze techniek biedt een groter voordeel ten opzichte van het bestaande protocol voor neurosferen op neurozuur. Het kan een meer homogene populatie van dubbele neuronen genereren met een hogere efficiëntie.

Zuig vier dagen na passage het medium uit de celculturen af. Los de cellen los met één milliliter Accutane per well en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 °C. Voeg tijdens de incubatie één milliliter gelatine toe aan elke well van een zes-wells plaat, en plaats deze plaat samen met vers geprepareerde matri gel-gecoate platen in de incubator.

Wanneer de cellen semi-zwevend zijn geworden, pipetteer ze dan enkele keren op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te maken. Trek de cellen vervolgens over naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer ze gedurende drie minuten. Bij 258 Gs en kamertemperatuur wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in de juiste hoeveelheid kweekmedium voor humane pluripotente stamcellen, aangevuld met serum, waarna thivivin wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van twee millimolars.

Incubeer vervolgens de cellen in de met gelatine gecoate platen in een verhouding van één-op-één bij 37 °C gedurende 30 minuten. Om de meth-feeders te verwijderen, worden de cellen vervolgens overgebracht naar een nieuwe buis van 15 ml. Verdun ze in medium voor humane pluripotente stamcellen, aangevuld met serum, en tel ze na het opnieuw centrifugeren van de cellen; resuspendeer de cellen in MT.SRone-medium met thias Ivan tot een concentratie van 180.000 cellen per ml.

Aspireer vervolgens de matrigel uit de gecoate platen en verdeel twee milliliters cellen per well. 48 uur. Na het heruitplaten van de cellen in de matrigel-platen.

Zuig het medium uit elke put en was de cellen eenmaal met PBS. Voeg vervolgens twee milliliters KSR-differentiatiemedium toe aan de cellen, aangevuld met SB 4 31, 50 42 en L DN 1 9 3 1 8 9, waarbij het medium dagelijks wordt ververst van D 0 tot D 20 zoals beschreven in de tabel. Zuig op dag 20 het differentiatiemedium af en detach de cellen met één milliliter acutus per put bij 37 °C gedurende vijf minuten. Warm tijdens de incubatie de poly-L-ornine laminine fibronectine platen op in de incubator.

Resuspendeer na de reanimatie de losgekomen cellen tot een enkelcel-suspensie en verdun de cellen in neurobasaal medium. Centrifugeer na het tellen de cellen en resuspendeer het pellet in B 27 differentiatiemedium bij een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Aspireer vervolgens het fibronectine uit de poly-L-ornithine-laminine-fibronectine-platen.

Was ze twee keer met PBS en breng 400 microliters cellen over naar elk putje. Vervang ten slotte het medium na de eerste 24 uur, en daarna om de dag tot aan het eindpunt van het experiment om eventuele niet-gehechte dode cellen te verwijderen. Zoals geïllustreerd in deze afbeeldingen, zullen opnieuw geplaatste enkelvoudige menselijke pluripotente stamcelculturen uitbreiden als clusters tijdens de eerste 48 uur van differentiatie, waarbij een confluentie van ongeveer 70% wordt bereikt.

Na differentiatie bereiken de cellen binnen drie tot vier dagen volledige confluentie. Tegen dag 20 hechten de gedifferentieerde cellen zich aan en groeien ze als kleine klontjes. Gedurende de volgende vijf dagen verschijnen er binnen de klontjes veel intensievere en morfologisch intacte axonen en neurieten, die enkele verbindingen tussen de klontjes vormen.

Na 11 dagen differentiatie kunnen de humane pluripotente stamcellen efficiënt worden omgezet in floor plate-precursors. Zoals in deze afbeeldingen wordt aangetoond, brengen bijna alle cellen de floor plate-precursor celmarkers nestin en fox A2 tot expressie en meer dan 90% van de cellen brengen Corin, OTX2 en LMX1A tot expressie. Na verdere differentiatie specialiseren de floor plate-precursorcellen zich tot dopaminerge neuronen die TUJ1 en TH tot expressie brengen. Deze dopaminerge neuronen hebben een A9-identiteit, aangezien ze Girk2 tot expressie brengen en negatief zijn voor calbindine. Immunokleuringsexperimenten tonen daarnaast aan dat er geen GFAP-astrocyten en zeer weinig GABAerge neuronen aanwezig zijn, wat aangeeft dat de differentiatie exclusief specifiek is voor de dopaminerge neuronale lijn.

Tijdens het testen van deze procedure is het belangrijk om consistentie te behouden in de dagelijkse celkweek en ervoor te zorgen dat het medium vers is bereid met de juiste ingrediënten.