Een Immunofluorescent methode voor de karakterisering van Barrett's slokdarm Cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van medicamenteuze behandeling op celstructuur en eiwitlokalisatie in BE-cellen te beoordelen. Dit wordt bereikt door de BE-cellen die op de glazen deksels zijn gekweekt, te incuberen met een gekozen medicijn onder standaard celkweekcondities. Als tweede stap worden de behandelde be-cellen geïncubeerd met een fixeermiddel, dat de eiwitstructuur en -lokalisatie behoudt.

Vervolgens worden de gefixeerde be-cellen sequentieel geïncubeerd met primaire en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen om veranderingen in het geselecteerde doeleiwit te visualiseren via fluorescentiemicroscopie. De resultaten tonen hoe de medicamenteuze behandeling van be-cellen de eiwitlokalisatie en celstructuur verandert op basis van de visualisatie van immunofluorescente kleuring. Hoewel deze methode inzicht kan geven in Barrett's slokdarm, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, waaronder kanker en normale cellen. Begin deze procedure door de 18 millimeter deksels in een glazen petrischaal te plaatsen en ze te autoclaveren.

Breng vervolgens de autoclaafdeksels over naar een 12-wells tissuecultuurschaal met behulp van een steriele glazen pipet die is bevestigd aan een vacuümbuis. Was daarna de deksels met steriele PBS en media. Vervolgens trypsineer.

Tel de geïmmortaliseerde cellen met een geautomatiseerde celteller of een hemo cytometer en verdun vervolgens de cellen in kweekmedium tot een concentratie van 20.000 tot 40.000 cellen per milliliter. Plaats vervolgens één milliliter cellen in elke well met een deksel. Voor een totaal aantal cellen van 20.000 tot 40.000 cellen per well, gebruik een steriele pipettip om de deksel voorzichtig naar de bodem van de well te duwen om ervoor te zorgen dat de cellen zich aan de deksel hechten.

Om de BE-cellen te behandelen, verdun het geselecteerde medicijn in 37 graden Celsius Media tot de gewenste concentratie, meng goed door de buis herhaaldelijk om te draaien of door een vortexmixer te gebruiken. Begin met de behandeling 24 uur na de eerste plaatsing van de BE-cellen om celhechting op de deksel mogelijk te maken. Markeer nu vooraf de met geneesmiddel behandelde en voertuig behandelde monsters met een labpen om onderscheid te maken tussen vergelijking en controle. Behandel een extra deksel van be-cellen met 0,1% voertuig verdund in het kweekmedium.

Plaats de cellen vervolgens in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 98% luchtvochtigheid. Nu, na de gewenste incubatietijd van de medicamenteuze behandeling, aspireer het medium en was de deksels snel met een XPBS bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens de PBS en voeg één milliliter PBS met 4%PFA toe aan elke well en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Aspireer vervolgens de 4%P-F-A-P-B-S Was de deksels drie keer vijf minuten per keer met PBS bij kamertemperatuur. Bewaar de deksels gedurende één week in PBS en 0,1%PFA bij vier graden Celsius indien gewenst. Om de gefixeerde PFA-cellen doorlaatbaar te maken, zodat het antilichaam toegang heeft tot de intracellulaire doelen, incubeer de cellen met 50 millimolair ammoniumchloride verdund in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Was ze vervolgens eenmaal gedurende vijf minuten met PBS op kamertemperatuur. Dit zal de achtergrond verminderen om niet-specifieke binding van antilichamen aan de cellulaire eiwitten te voorkomen. Incubeer de BE-cellen gedurende 30 minuten in 100 tot 300 microliter PBS met 0,1%troponine en 0,5%BSA.

Bereid vervolgens een vierkante bioassayschaal voor door de bodem van de kamer te bedekken met natte papieren handdoeken en een laag parfum bovenop te plaatsen. Markeer het parfum met een labpen om de deksels te identificeren. Breng de deksels voorzichtig over op het param met de cellen naar boven met behulp van een pincet en een spuitnaald.

Verdun nu het primaire antilichaam in PBS dat zowel 0,5%BSA als 0,1%saponine bevat, de blokkeeroplossing voorzichtig uitdabbelen. Voeg met behulp van laboratoriumweefsel 100 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe en incubeer de be-cellen gedurende een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag.

Was de slides drie keer met PBS met 0,5%BSA en 0,1%troponine gedurende vijf minuten per keer bij kamertemperatuur. Verdun vervolgens het secundaire antilichaam geconjugeerd met een fluorescerend label in PBS met 0,5%BSA en 0,1%ponent. Voeg 100 microliter verdund antilichaam toe aan elke deksel en incubeer de cellen gedurende twee uur bij kamertemperatuur Na twee uur.

Was de deksels drie keer vijf minuten per keer in PBS met 0,5%BSA en 0,1%troponine. Verwijder de wasbuffer en voeg 100 tot 300 microliter PBS toe aan de deksels. Til de deksel voorzichtig op met behulp van een pincet en dabbel de PBS af met behulp van laboratoriumweefsel of papieren handdoek.

Voeg vervolgens 15 microliter van een geschikt Antifa montagemedium met DPI toe aan de deksel. Plaats de omgekeerde deksel op een glazen microscoopslide met de cellen naar beneden. Plaats vervolgens de slides in een slidemap en bewaar ze uit de zonlicht bij kamertemperatuur om het Antifa-medium te laten uitharden.

Zodra het Antifa-medium is uitgehard, kunnen de slides worden bewaard bij vier graden Celsius of min 20 graden Celsius tot microscopische visualisatie. In deze stap verwijdert u de opslagslides uit min 20 graden Celsius of vier graden Celsius en laat u ze opwarmen tot kamertemperatuur. Zet de microscoop en de kwikbooglamp aan.

Plaats een microscoopslide met de deksel naar de objectief op het microscoopplatform. Selecteer vervolgens de DAPI-filter en open de sluiter. Focus het objectief terwijl u door de oogstukken kijkt totdat het beeld verschijnt.

Aangezien alle cellen zijn gekleurd met dpi, zouden de kernen gemakkelijk moeten worden waargenomen. Verzamel beelden met behulp van geschikte beeldverwerkingssoftware in deze figuur waarin deksels met CPC