Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

Het algemene doel van het volgende experiment is om het herstel van virussen uit water te optimaliseren met behulp van een kleinschalige techniek die oorspronkelijk is ontworpen om virusconcentraties te optimaliseren. Een glascellulosefilter bleek het beste elektropositieve filter te zijn om adenovirus uit water te concentreren. Voor de secundaire elutie bleek een secundaire concentratietechniek met celite het meest effectief voor het elueren van adenovirus van de filteroppervlakken. De resulterende techniek herstelt de meeste adenovirus uit kraanwater, gebaseerd op de hoogste percentages herstel die zijn waargenomen tussen alle geteste filter- en elutiecombinaties.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals grootschalige volumeverconcentratie, is dat er kleinere monstervolumes worden gebruikt, waardoor een groot aantal concentratievariabelen snel en eenvoudig kan worden geëvalueerd.

Zorg bij de voorbereiding van dit protocol dat alle benodigde oplossingen klaarliggen, inclusief de door een 0,22 micron filter gezuiverde virale oplossing met 10 tot 100.000 MPN per milliliter.

Begin met het afmeten van een liter steriel kraanwater. Breng dit over in een bekerglas van twee liter met een magnetische roerstaf. Voeg tijdens het roeren van het water 0,7 gram natriumthiosulfaat toe en laat dit volledig oplossen. Stel vervolgens de pH in op een waarde tussen 7 en 7,5 door druppelsgewijs één molaire zure of basische stamoplossingen toe te voegen. Spik daarna het water met het virus. Voeg een volle milliliter van de bereide virusoplossing toe. Dek de kolf af met een steriele folie en laat het virus 10 minuten lang mengen in het water.

Bereid ondertussen het Millipore-filter voor. Haal het eerst uit de verpakking en zorg ervoor dat het stevig aansluit tussen de bovenste kom en het onderste zeefje. Controleer vervolgens of het kurkmateriaal van het filter nauw aansluit op de rand van een zijarmkolf van één liter. Verwijder nu de bovenste kom van het filter en plaats met een pincet een elektropositieve filterdisc van 47 millimeter precies op het filterzeefje. Bevestig daarna de kom opnieuw en zet deze vast met een draai tegen de klok in.

Meet 100 milliliters van het gespikte kraanwater af met een steriele maatcilinder. Draag het water vervolgens over naar de voorbereide filterbehuizing op de fles van twee liter. De elektropositieve schijf in het filter kan bestaan uit geplooid glas-cellulose of nano-alumina glasvezel. Er kan een zacht vacuüm worden gebruikt om het resterende water door het filter te leiden.

Plaats de filterhouder nu op een zijarmkolf van 250 milliliter. Meet 100 milliliter rundvleesextract af en giet dit langzaam op het filter. Laat het extract langzaam passeren en gebruik een zacht vacuüm om het residu door te trekken.

Ga vervolgens verder met een van de twee opties voor secundaire concentratie.

Om het virus te concentreren met celite, brengt u de inhoud van de 250 milliliter kolf, waarin het virus zich bevindt, over naar een roerplaat. Creëer met een roerstaf een kleine vortex. Voeg vervolgens 0,1 gram celite-poeder toe aan 100 milliliters rundextract. Laat de celite dispergeren en bereid u voor om de pH van de oplossingen aan te passen. Verlaag de pH tot 4,0 door druppelgewijs 0,1 molar zoutzuur toe te voegen.

Laat de oplossing vervolgens 10 minuten mengen. Bevestig tijdens het mengen uw prefilter van 47 milliliter op een kolf van twee liter. Giet nu 100 milliliters van het mengsel van rundvleesextract-celite door het prefilter. Er kan een licht vacuüm worden gebruikt om het proces te voltooien.

Plaats vervolgens een metalen buisklem op het uiteinde van de tuit van de filterbehuizing. Bevestig een steriele polypropylene opvangbuis van 15 milliliter aan de klem en monteer vervolgens het filter opnieuw op de kolf.

Elueer nu het virus uit de Celite-deeltjes in vijf milliliter 1X PBS bij pH 9. Laat het grootste deel van de PBS door zwaartekracht in de 15 milliliter buis druppelen en trek het resterende deel door met een licht vacuüm. Om het virus te concentreren middels organische flocculatie, brengt u de inhoud van de 250 milliliter kolf met het virus over naar een roerplaat. Creëer met een roerstaf een kleine vortex. Stel de pH van de oplossing in op 3,5 door druppelsgewijze toevoegingen van één molaire zoutzuur. Laat het mengsel vervolgens een half uur roeren. Breng de oplossing daarna over naar een steriele 250 milliliter conische centrifugebuis. Centrifugeer de oplossing bij 2.500 g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Let na het centrifugeren op dat u het pellet niet verstoort bij het hanteren van de buizen. Decanteer voorzichtig het supernatant en resuspendeer het pellet in vijf milliliter PBS pH 9. Zorg ervoor dat het pellet volledig is opgelost. Centrifugeer de resuspensie vervolgens bij 4.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel nu het supernatant dat het geconcentreerde virus bevat. Het pellet kan worden weggegooid.

Bij het optimaliseren van dit protocol werden drie typen celiet vergeleken. Grovere celiet leidde tot lagere herstelpercentages voor zowel ADV 40 als ADV 41.

De elutie van het filter werd getest bij een pH tussen 7,5 en 12 om te bepalen welke waarde het meest effectief zou zijn voor het verzamelen van ADV-deeltjes uit de filters. De hoogste terugwinning werd behaald met een glas-cellulosefilter in combinatie met rundvleesextract bij pH 10 en met celite. Het resultaat was hetzelfde voor ADV 40 en ADV 41.

Het rundvleesextract bij pH 10 bleek superieur aan organische flocculatie.

De geoptimaliseerde methode werd vergeleken met een toevoeging van 25% trypsine en met het aanvullen van het rundvleesextract met 0,1% natriumpolyfosfaat. Geen van beide behandelingen verbeterde het herstel van ADV significant.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 45 minuten worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd.