Name: Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Leer een geoptimaliseerde methode voor virale concentratie uit kleine watermonsters met een glascellulosefilter en secundaire concentratie voor adenovirus. Deze techniek verbetert de terugwinningssnelheid voor milieumonitoring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Nicholas J. Ashbolt en Dr. G. Shay Fout bedanken voor hun beoordeling van het manuscript.

1. Voorbereiding van glaswerk en behuizingen Filter <ol style="margin-left: 40px;"><li> Tenzij anders vermeld, steriliseren alle glaswerk, filterhuizen en oplossingen bij 121 ° C gedurende 15 min. Om de steriliteit te verzekeren, hebben betrekking op alle openingen of blootgestelde oppervlakken met ofwel aluminiumfolie of-tape vastgemaakt papier voorafgaand aan sterilisatie. </li><li> Assembleren filtratieinrichting door het aanbrengen van filterhuis (47 mm diameter) aan 1 L zijarm erlenmeyer. Verzamel filters nodig: 47 mm diameter elektropositief / elektronegatief disc filters. </li><li> Bereid 1 liter 1,5% vleesextract (flocculanten, produceert vlokken deeltjes bij pH van de oplossing wordt verlaagd tot 3,5 of non-flocculatie, die niet bij pH 3,5 heeft aggregaat), met 0,05 M glycine, door oplossen van 15 g vleesextract in 1 liter gedeïoniseerd water en toevoegen van 3,75 g glycine. OPMERKING: Niet-uitvlokkend rundvlees extracten zal de toevoeging van celliet voorafgaand aan tertiaire concentratie vereisen. </li><li> Voeg elutie additief natrium Polyphosphate rundvlees extract in een concentratie van 0,1%. </li><li> Voeg 1 M zoutzuur, druppelsgewijs, te mengen rundvlees extract, pH oplossing om de gewenste pH. Autoclaaf vleesextract gedurende 15-30 min bij 121 ° C. </li><li> Meet 0,1 g fijne, middelgrote of grote deeltje celliet (voor gebruik met niet-flocculanten rundvlees alleen extract). </li><li> Bereid vacuum / zuig door het aanbrengen van compatibele slang aan Erlenmeyer zijarm kolf en om het vacuüm uitlaat. </li></ol> 2. Voorbereiding van Solutions en Virus Stock <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bereid 1 L 1 M HCl. </li><li> Bereid 1 L 1 M NaOH. </li><li> Bereid 1x PBS-oplossing (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K 2 PO 4 en 4,3 mM NaH 2PO 4). <ol><li> Stel de pH van 1x PBS tot 9,0 met 1 M NaOH. </li></ol></li><li> Bereiden en verdun voorraad virus tot 10 4 -10 5 meest waarschijnlijke aantal (MPN) ml -1 door het mengen van 1 ml van de virus met 9 ml PBS (pH7), zoals eerder beschreven 8,13. Bewaren bij -80 ° C in 1 ml porties. <ol><li> Steriliseren virus voorraad door spuit filtering (0,22 pm poriegrootte) om mogelijke verontreinigingen te verwijderen. </li></ol></li><li> Gedechloreerd Tap Water <ol><li> Maatregel 1 L steriel leidingwater met een steriele maatcilinder en giet het in een 2 L beker die magnetische roerstaaf. </li><li> Voeg 0,7 g natriumthiosulfaat en meng tot granules lossen. Stel de pH van het leidingwater om 7-7,5 indien nodig met behulp van 1 M HCl of 1 M NaOH-oplossing. </li><li> Dooi virus spike (1 ml) en voeg gehele volume van spike tot 1 L van gedechloreerd steriel leidingwater. Meng gedurende 10 min. </li><li> Bereid een methode leeg (gedechloreerd leidingwater zonder adenovirus) met elk experiment en proces op dezelfde wijze als het verrijkte monster. </li></ol></li></ol> 3. Bereiding van Millipore filterinrichting <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verwijder steriele deksel over het filterhuis. Verzekereneen goede fit tussen filterhuis bovenste kom en onderste filter scherm om monster lekken tijdens filtratie te voorkomen. </li><li> Verwijder steriele afdekking van 1 L erlenmeyer. Zorg ervoor dat de kurk van de filter unit past precies in de bovenste opening van de Erlenmeyer, het creëren van een goede afdichting. </li><li> Verwijder de bovenste kom van filtereenheid uit lagere filter scherm, en plaats 47 mm elektropositief filter schijf vierkant op het scherm met een steriel pincet. Bevestig filterhuis kom naar onderkant scherm en sluit het door het draaien tegen de klok in. </li></ol> 4. Tap Water Filtration (Primary Concentratie) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Meet 100 ml van het virus spiked kraanwater met steriele maatcilinder. </li><li> Giet 100 ml van het virus spiked kraanwater in filterhuis die ofwel een 47 mm geplooid glas / cellulose filter of een nano-alumina / glasvezel schijf filter. </li><li> Laat het water langzaam passeren filter. Pas lichte vacuüm om de resterende resten te verwijderen of leidingwater uit filter oppervlak. </li><li> Bij gebruik van trypsine behandeling, voeg 5 ml van 0,25% trypsine aan Oppervlaktefilter en incubeer gedurende 5 min. </li><li> Was trypsine uit filter oppervlak met behulp van 50 ml steriel gedeïoniseerd water. </li></ol> 5. Virus elutie uit Filter <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verwijder filter behuizing van 2 L Erlenmeyer, en de plaats op 250 ml side-arm kolf. </li><li> Meet 100 ml van rundvlees extract met behulp maatcilinder. Giet langzaam 100 ml van rundvlees extract in filterhuis. </li><li> Laat vleesextract te gieten door het filter, vastleggen vleesextract in een klein (250 ml) Erlenmeyer kolf. Toepassing vacuüm te trekken door middel van resterende rundvlees uittreksel uit filter. </li></ol> 6. Celite Secundaire Concentratie <ol style="margin-left: 40px;"><li> Transfer kolven met de uitgewassen virussen aan een roer plaat. Voeg steriele magnetische roerstaaf en plaats op roerplaat, mengen tot lichte vortex creëren. </li><li> Voeg 0,1 g celitepoeder tot 100 ml van rundvlees extract en laat celliet te verspreiden. Plaats steriele pH-sonde in rundvlees extract. </li><li> Voeg druppelsgewijs 1 M HCl tot vleesextract om pH 4,0 te bereiken. Laat roerend gedurende 10 min. </li><li> Plaats 47 mm voorfilter op filterbehuizing (zoals eerder beschreven) met een 2 L Erlenmeyer kolf. </li><li> Pour vleesextract / celite mengsel van 100 ml gedurende voorfilter. Laat rundvlees extract door te gieten. Oefen lichte vacuüm te trekken door middel van resterende rundvlees uittreksel uit filter. </li><li> Plaats metalen buis clip aan het einde van het filterhuis uitloop. Bevestig steriele 15 ml polypropyleen collectie buis metalen buis clip. Plaats filterhuis terug in erlenmeyer. </li><li> Voeg 5 ml 1x PBS, pH 9,0 over celite verzameld op de pre-filter. </li><li> Laat PBS te druppelen door middel van pre-filter. Oefen lichte vacuüm te trekken door middel van de resterende PBS in 15 ml collectie buis. </li></ol> 7. Biologische Flocculatie Secundaire Concentratie <ol style="margin-left: 40px;"><li>Breng de bekers die het geëlueerde virus naar een roerplaat. Voeg steriele magnetische roerstaaf tot 100 ml van rundvlees extract en meng tot lichte vortex creëren. </li><li> Plaats steriele pH-sonde in rundvlees extract. </li><li> Voeg 1 M HCl druppelsgewijs aan rundvlees-extract en de pH op 3,5. Meng gedurende 30 min. </li><li> Giet het eluaat in 250 ml conische centrifugebuis en centrifugeer bij 2500 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Giet supernatant maar zorg er voor dat u de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 5 ml 1x PBS, pH 9. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 4000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Giet het supernatant en de pellet weggooien. </li><li> Stel de pH 7-7.5, filter gesteriliseerd door 0,22 urn spuitfilter en bevriezen bij -80 ° C. </li></ol> 8. Virale Nucleïnezuur Extraction <ol style="margin-left: 40px;"><li> Extract virale nucleïnezuren met een geschikte commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 9. AdV 40/41 qPCR <ol style="margin-left: 40px;"><li> Gebruik primers en probes, evenals reactiemengsel en thermische cycli profielen gepubliceerd 8,13. OPMERKING: Geschatte detectiegrens van de test is ongeveer 5 qPCR eenheden per reactie. </li><li> Componenten van PCR-amplificatie mengsels Voeg bij concentraties als volgt: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCI, 4,5 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 uM primers en 1 pM probe en 0,5 pl polymerase zodat eindvolume van 45 pl kunnen passende aantal putten toegevoegd in een 96-wells PCR reactieplaat. </li><li> Belasting 45 pi PCR amplificatie mengsel aan elk geschikte putje van een 96 putjes, snelle reactie PCR plaat. </li><li> Voeg 5 ul geëxtraheerd DNA monster aan geschikte putjes van de PCR-plaat. </li><li> Bedek plaat met hittebestendige deksel afdichting, draai de plaat om eventuele druppels verhuizen naar onderkant van PCR-plaat putten. </li><li> Stel PCR amplificatiecycli als follows: 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min. </li></ol> 10. Gegevens Analyses <ol style="margin-left: 40px;"><li> Analyseer drievoudige metingen van de seriële 5-voudige verdunningen van de monsters overspant 1: 5 tot 1: 625 verdunning assortiment naar de meest waarschijnlijke aantal (MPN) van de virale deeltjes te bepalen, zoals eerder beschreven 8,13. </li><li> Analyseer seriële 5-voudige verdunningen van adenovirus experimentele spikes spanning 1: 5 tot 1: 15.625 verdunning assortiment naar de meest waarschijnlijke aantal (MPN) van de virale deeltjes te bepalen. </li><li> Met behulp van de EPA MPN rekenmachine (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), passen de rekenmachine om rekening te houden met het type van verdunning (1: 5 of 1:10), het aantal verdunningen uitgevoerd, en het aantal repliceren monsters in verdunningsreeks. </li><li> Voer 10 log transformatie van de gegevens, gevolgd door het normaliseren van een volume-eenheid (bijvoorbeeld 1 ml, 100 ml, etc. </em&gt;). Bereken terugvorderingen voor gegeven experiment door te delen aantal virale deeltjes in het monster concentraten met aantal virale deeltjes in experimentele spikes. </li><li> Evalueer het effect van de verschillende experimentele variabelen (bijvoorbeeld verschillende soorten celite, pH-trajecten, verschillende filter en verschillende secundaire concentratietechnieken) op AdV terugwinning door het uitvoeren van parametrische en niet-parametrische statistische testen (bijvoorbeeld gepaarde t-test, één of twee -weg ANOVA) afhankelijk van de verdeling van de gegevens en de experimentele opzet. </li></ol>

<ol><li>Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+recreational+water-borne+disease+outbreaks%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).</li>
<li>WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).</li>
<li>Westrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+outbreaks+linked+to+oyster+consumption+in+the+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance+%3A+Bulletin+Europeen+Sur+les+Maladies+Transmissibles+%3D+European+Communicable+Disease+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom.</a> Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).</li>
<li>Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+enteric+viruses+for+fecal+pollution+source+tracking+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters.</a> Environment International. 45, 151-164 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).</li>
<li>McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+celite+secondary+concentration+procedure+and+an+alternate+elution+buffer+for+the+recovery+of+enteric+adenoviruses+40+and+41%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41.</a> Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).</li>
<li>Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+flocculation%3A+an+efficient+second-step+concentration+method+for+the+detection+of+viruses+in+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47, 2797-2810 (2013).</li>
<li>McMinn, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+adenovirus+40+and+41+recovery+from+tap+water+using+small+disk+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).</li>
<li>Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+using+celite+to+concentrate+norovirus%2C+adenovirus+and+enterovirus+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater.</a> Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).</li>
<li>Albinsson, B., Kidd, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+type+41+lacks+an+RGD+alpha%28v%29-integrin+binding+motif+on+the+penton+base+and+undergoes+delayed+uptake+in+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells.</a> Virus Research. 64, 125-136 (1999).</li>
<li>He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+structures+and+hydrogen+bond+network+of+high-density+and+very+high-density+amorphous+ices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nine-year+study+of+the+occurrence+of+culturable+viruses+in+source+water+for+two+drinking+water+treatment+plants+and+the+influent+and+effluent+of+a+Wastewater+Treatment+Plant+in+Milwaukee%2C+Wisconsin%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin.</a> 71, 1042-1050 (2005).</li>
<li>Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+poliovirus+concentration+and+recovery+from+treated+wastewater+by+two+electropositive+filter+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods.</a> Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).</li>
<li>Haramoto, E., Katayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+acidic+elution+to+virus+concentration+using+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters.</a> Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).</li>
<li>Hill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).</li>
<li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).</li>
<li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water.</a> Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).</li>
<li>Melnick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+robin+investigation+of+methods+for+the+recovery+of+poliovirus+from+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).</li>
<li>Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+purification+of+beef+extract+mock+eluates+from+water+samples+for+the+detection+of+enteroviruses%2C+hepatitis+A+virus%2C+and+Norwalk+virus+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).</li>
</ol>

Geen concurrerende financiële belangen.
De opvattingen die in dit artikel worden geuit, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen of beleidslijnen van de Amerikaanse Environmental Protection Agency. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik.

Elektropositief filters zijn nuttig bij het concentreren van virussen uit het water; maar deze filters kunnen verschillen in hun structuur en samenstelling die op hun beurt kunnen veranderen hun doeltreffendheid. Compounding dit probleem, capside structuren en kosten variëren tussen de virusstammen die concentratie vereisen technieken worden afgestemd op optimaal herstel 15 te verzekeren. Door eenvoudige aanpassingen van de bestaande concentratie technieken (bijv elektropositieve filters, vleesextrac...

Human enterale virussen zijn belangrijke verwekkers van water overgebrachte ziekten 1-3, maar zijn over het algemeen aanwezig in lage aantallen in vervuilde milieu wateren, het maken van hun detectie moeilijk zonder concentratie. Procedures gebruikt om virussen te concentreren typisch een filtratiestap, gevolgd door elutie filter en secundaire concentratie van het filter eluaat. Een gemeenschappelijke filtratie procedure berust op het gebruik van geladen membranen zoals elektropositieve filters (onlangs besproken in 4,5). Deze filters vertrouwen op het vastleggen van virussen gesuspendeerd in water met behulp van elektrostatische interacties tussen het filter oppervlak (positief geladen) en gerichte virusdeeltjes (negatief geladen). Twee elektropositieve filters die commercieel verkrijgbaar zijn vertrouwen op deze technologie, de glas / cellulose en nano-alumina / glasvezelfilters. De glas / cellulose filter kosten tot 10 keer die van de nano-alumina / glasvezel, die het gebruik van het glas / ce beperkenllulose filters voor routine-virus monitoring. Recente studies hebben gesloten verschillen zijn nominale tussen deze twee filters in het herstel van enterovirussen van omgevingstemperatuur water 6,7, rechtvaardigt het gebruik van een goedkopere filter alternatief. Andere filter opties zoals elektronegatieve en glaswol filters werden onderzocht, maar ze hetzij de voorbehandeling van bronwater (elektronegatieve filters) of niet in de handel verkrijgbaar (glaswol filters). De ontwikkeling van het virus concentratie procedures is vooral gericht op het optimaliseren van de primaire concentratie technieken (filters) om virus terugvorderingen verbeteren van water. Echter, secundaire concentratie procedures, waarbij het ​​volume van eluant verminderen meestal van 1 L tot volumes milliliters, kunnen ook een belangrijke impact op virus terugvorderingen 8. Secundaire concentratie van enterale virussen berust meestal op een uitvlokkingsmiddel zoals sommige soorten rundvlees extract (organische floccuning) of magere melk flocculatie 9-12 om virusdeeltjes uit de filter oppervlakken te verwijderen. Recentelijk andere secundaire concentratieprocedure met vleesextract combinatie met de toevoeging van celiet (fijne deeltjes) blijkt belofte voor terugwinnen adenovirus, enterovirus en norovirus 8,13,14. Celite concentratie werken onder dezelfde beginselen die van de biologische flocculatie werkwijze die virusdeeltjes hechten aan en vrijkomen uit deeltjes (vlokken of celite) Door het veranderen van de pH van de suspensie-oplossing. Vergelijkingen tussen deze twee secundaire concentratie technieken zijn geëvalueerd in het herstel van spiked adenovirus (adv) typen 40 en 41 8. Deze studie concludeerde dat de twee secundaire concentratie technieken waren statistisch vergelijkbaar in het herstel van adenovirussen. De biologische flocculatie methode vereist een 30 min. incubatie bij pH 3,5, terwijl de celite techniek vereist een kortere incubatie (10 min) bij pH 4,0. De organische flocculation vereist ook het gebruik van dure laboratoriumapparatuur (centrifuges) tot vlokken deeltjes verzamelen tijdens tertiaire concentratie, de celite techniek daarentegen worden alleen elementaire laboratoriumapparatuur (vacuümfiltratie) om celite deeltjes scheiden van suspensie. Bepaalde combinaties van filters en secundaire elutietechnieken kan ook van invloed virus terugvorderingen. Een onderzoek werd geconcludeerd dat bepaalde combinaties van primaire (elektropositief filters) en secundaire concentratie technieken (celliet of organische flocculatie) had een belangrijke impact op herstel van adenovirus 13. Deze bevindingen suggereren dat optimalisatie nodig om optimaal te herstellen doelwit virus uit een bepaalde watermatrix bij gebruik van deze technieken. Optimalisatie is een tijdrovend, lastig proces veel onderzoekers actief te vermijden, omdat tal van variabelen zal worden geëvalueerd (filter type / merk pH elutieoplossing, celliet / organische flocculatie). Hiervoor study, een procedure die is ontwikkeld om optimale omstandigheden voor virus concentratie identificeren van water met behulp van spiked menselijk adenovirusstammen 40 en 41. Vermoedelijk, omdat elk type virus toont een unieke capside morfologie en specifieke capside lading, kan het nodig zijn concentratie protocollen worden geoptimaliseerd voor elk virus richten met het oog op een optimale virale herstel te bereiken. Deze studie geeft een aanpak voor adv 40 en 41 concentratie door: 1) het evalueren virus terugvorderingen in leidingwater met behulp elektropositief filter schijven gevolgd door 2) evaluatie van een gevestigde biologische flocculatie methode versus de celliet techniek als een secundaire concentratie, en 3) de evaluatie van elutiebuffers voor tertiaire concentratie.

<table><tbody><tr><td>Adenovirus 40 stock</td><td>ATCC</td><td>VR-931</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus 41 stock</td><td>ATCC</td><td>VR-930</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>72051</td><td></td></tr><tr><td>Celites #577</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>NanoCeram 47 mm</td><td>Argonide</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1MDS 47 mm</td><td>3M</td><td>6408502</td><td></td></tr><tr><td>AP-20 Prefilter 47 mm</td><td>Millipore Corp.</td><td>AP2004700</td><td></td></tr><tr><td>Glycine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>50046-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Polyphosphate</td><td>Acros Organics</td><td>390930010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>BBL Beef Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212303</td><td></td></tr><tr><td>Difco Beef Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7900 Real-time PCR system</td><td>ABI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Filter Housing</td><td>Millipore Corp.</td><td>XX2004720</td><td></td></tr><tr><td>Blood DNA Extraction Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>51104</td><td></td></tr><tr><td>EPA MPN Calculator</td><td></td><td></td><td>http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html</td></tr></tbody></table>

een klein volume procedure voor virale concentratie van het water

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Kleinschalige concentratie van virussen (monstervolumes 1-10 L, hier gesimuleerd met aangevulde 100 ml watermonsters) is een efficiënte, kosteneffectieve manier om optimale parameters voor virusconcentratie te identificeren. Virussen kunnen uit water worden geconcentreerd door middel van filtratie (elektropositief, elektronegatief, glaswol of grootte-uitsluiting), gevolgd door secundaire concentratie met runderextract om virussen van filteroppervlakken te ontgrendelen, en tenslotte tertiaire concentratie die resulteert in een 5-30 ml volume virusconcentraat. Om optimale concentratieprocedures te identificeren, werden twee verschillende elektropositieve filters geëvalueerd (een glas/cellulose filter [1MDS] en een nano-alumina/glas filter [NanoCeram]), evenals verschillende secundaire concentratietechnieken; de celite-techniek waarbij drie verschillende celite-deelgroottes werden geëvalueerd (fijn, medium en groot), gevolgd door een vergelijking van deze techniek met die van de gevestigde organische flocculatiemethode. Verschillende elutie-additieven werden ook geëvalueerd op hun vermogen om de afgifte van adeno-virus (AdV) deeltjes van filteroppervlakken te verbeteren. Fijne celite-deeltjes herstelden vergelijkbare niveaus van AdV40 en 41 als de gevestigde organische flocculatiemethode wanneer virale spikes werden toegevoegd tijdens secundaire concentratie. Het glas/cellulose filter herstelde hogere niveaus van zowel AdV40 als 41, vergeleken met een nano-alumina/glasvezelfilter. Hoewel niet statistisch significant, herstelde de toevoeging van 0,1% natriumpolyfosfaat gewijzigd runderextract eluaat 10% meer AdV-deeltjes vergeleken met ongewijzigd runderextract.

<html> Celliet selectie Drie verschillende types van celite werden getest voor de selectie van de best presterende variant. Celites met fijne tot middelgrote deeltjes die de hoogste adenovirus terugvorderingen. Het gebruik van grotere celites resulteerde in lagere realisaties zowel AdV40 en 41 (tussen 32% -100%) (Figuur 1). Gemiddeld terugvorderingen van adenovirus 40 waren 144% ± 52% (fijn), 115% ± 28% (gemiddeld) en 82% ± 53% (groot) deeltje celites en voor AdV41, 132% ± 39...

Er werd een benadering ontwikkeld voor het identificeren van optimale virale concentratiecondities voor kleine watermonsters met behulp van spikes van humaan adenovirus. De hier beschreven technieken worden gebruikt om concentratieparameters voor andere virale doelen te identificeren en worden toegepast op grootschalige virale concentratie-experimenten.

Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het herstel van virussen uit water te optimaliseren met behulp van een kleinschalige techniek die oorspronkelijk is ontworpen om virusconcentraties te optimaliseren. Een glascellulosefilter bleek het beste elektropositieve filter te zijn om adenovirus uit water te concentreren. Voor de secundaire elutie bleek een secundaire concentratietechniek met celite het meest effectief voor het elueren van adenovirus van de filteroppervlakken. De resulterende techniek herstelt de meeste adenovirus uit kraanwater, gebaseerd op de hoogste percentages herstel die zijn waargenomen tussen alle geteste filter- en elutiecombinaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals grootschalige volumeverconcentratie, is dat er kleinere monstervolumes worden gebruikt, waardoor een groot aantal concentratievariabelen snel en eenvoudig kan worden geëvalueerd. Zorg bij de voorbereiding van dit protocol dat alle benodigde oplossingen klaarliggen, inclusief de door een 0,22 micron filter gezuiverde virale oplossing met 10 tot 100.000 MPN per milliliter.Begin met het afmeten van een liter steriel kraanwater. Breng dit over in een bekerglas van twee liter met een magnetische roerstaf. Voeg tijdens het roeren van het water 0,7 gram natriumthiosulfaat toe en laat dit volledig oplossen. Stel vervolgens de pH in op een waarde tussen 7 en 7,5 door druppelsgewijs één molaire zure of basische stamoplossingen toe te voegen. Spik daarna het water met het virus. Voeg een volle milliliter van de bereide virusoplossing toe. Dek de kolf af met een steriele folie en laat het virus 10 minuten lang mengen in het water.Bereid ondertussen het Millipore-filter voor. Haal het eerst uit de verpakking en zorg ervoor dat het stevig aansluit tussen de bovenste kom en het onderste zeefje. Controleer vervolgens of het kurkmateriaal van het filter nauw aansluit op de rand van een zijarmkolf van één liter. Verwijder nu de bovenste kom van het filter en plaats met een pincet een elektropositieve filterdisc van 47 millimeter precies op het filterzeefje. Bevestig daarna de kom opnieuw en zet deze vast met een draai tegen de klok in.Meet 100 milliliters van het gespikte kraanwater af met een steriele maatcilinder. Draag het water vervolgens over naar de voorbereide filterbehuizing op de fles van twee liter. De elektropositieve schijf in het filter kan bestaan uit geplooid glas-cellulose of nano-alumina glasvezel. Er kan een zacht vacuüm worden gebruikt om het resterende water door het filter te leiden.Plaats de filterhouder nu op een zijarmkolf van 250 milliliter. Meet 100 milliliter rundvleesextract af en giet dit langzaam op het filter. Laat het extract langzaam passeren en gebruik een zacht vacuüm om het residu door te trekken.Ga vervolgens verder met een van de twee opties voor secundaire concentratie.Om het virus te concentreren met celite, brengt u de inhoud van de 250 milliliter kolf, waarin het virus zich bevindt, over naar een roerplaat. Creëer met een roerstaf een kleine vortex. Voeg vervolgens 0,1 gram celite-poeder toe aan 100 milliliters rundextract. Laat de celite dispergeren en bereid u voor om de pH van de oplossingen aan te passen. Verlaag de pH tot 4,0 door druppelgewijs 0,1 molar zoutzuur toe te voegen.Laat de oplossing vervolgens 10 minuten mengen. Bevestig tijdens het mengen uw prefilter van 47 milliliter op een kolf van twee liter. Giet nu 100 milliliters van het mengsel van rundvleesextract-celite door het prefilter. Er kan een licht vacuüm worden gebruikt om het proces te voltooien.Plaats vervolgens een metalen buisklem op het uiteinde van de tuit van de filterbehuizing. Bevestig een steriele polypropylene opvangbuis van 15 milliliter aan de klem en monteer vervolgens het filter opnieuw op de kolf.Elueer nu het virus uit de Celite-deeltjes in vijf milliliter 1X PBS bij pH 9. Laat het grootste deel van de PBS door zwaartekracht in de 15 milliliter buis druppelen en trek het resterende deel door met een licht vacuüm. Om het virus te concentreren middels organische flocculatie, brengt u de inhoud van de 250 milliliter kolf met het virus over naar een roerplaat. Creëer met een roerstaf een kleine vortex. Stel de pH van de oplossing in op 3,5 door druppelsgewijze toevoegingen van één molaire zoutzuur. Laat het mengsel vervolgens een half uur roeren. Breng de oplossing daarna over naar een steriele 250 milliliter conische centrifugebuis. Centrifugeer de oplossing bij 2.500 g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Let na het centrifugeren op dat u het pellet niet verstoort bij het hanteren van de buizen. Decanteer voorzichtig het supernatant en resuspendeer het pellet in vijf milliliter PBS pH 9. Zorg ervoor dat het pellet volledig is opgelost. Centrifugeer de resuspensie vervolgens bij 4.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel nu het supernatant dat het geconcentreerde virus bevat. Het pellet kan worden weggegooid. Bij het optimaliseren van dit protocol werden drie typen celiet vergeleken. Grovere celiet leidde tot lagere herstelpercentages voor zowel ADV 40 als ADV 41.De elutie van het filter werd getest bij een pH tussen 7,5 en 12 om te bepalen welke waarde het meest effectief zou zijn voor het verzamelen van ADV-deeltjes uit de filters. De hoogste terugwinning werd behaald met een glas-cellulosefilter in combinatie met rundvleesextract bij pH 10 en met celite. Het resultaat was hetzelfde voor ADV 40 en ADV 41.Het rundvleesextract bij pH 10 bleek superieur aan organische flocculatie.De geoptimaliseerde methode werd vergeleken met een toevoeging van 25% trypsine en met het aanvullen van het rundvleesextract met 0,1% natriumpolyfosfaat. Geen van beide behandelingen verbeterde het herstel van ADV significant.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 45 minuten worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd.

a-small-volume-procedure-for-viral-concentration-from-water

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Te maken lentivirussen, zijn DNA-vectoren getransfecteerd in humane 293 cellen. Na de oogst en het concentreren van de supernatant, is virustiter bepaald door fluorescentie expressie met een flowcytometer.

Lentivirus Productie

De omloopsnelheid van virussen in zee-en zoetwater-systemen kan worden geschat door een reductie en herhaling techniek. De gegevens kunnen de onderzoekers om de tarieven van de virus-gemedieerde microbiële sterfte in aquatische systemen af ​​te leiden.

Het schatten van Virus Productie tarieven in aquatische systemen

Glaswol filters zijn gebruikt om virussen te water te concentreren door een aantal onderzoeksgroepen over de hele wereld. Hier laten we een eenvoudige aanpak voor het construeren van glaswol filters en demonstreren van de filters zijn ook effectief te concentreren op waterbasis virale, bacteriële en protozoa ziekteverwekkers.

Glaswol Filters voor Concentreren op waterbasis Virussen en Landbouw zoönotische pathogenen

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een uitgebreid protocol om de beschikbaarheid van organische en anorganische voedingsstoffen en de abundantie en structuur van microbiële en virale gemeenschappen in afgelegen mariene omgevingen te beoordelen.

Het ontrafelen van de Unseen Spelers in de Oceaan - A Field Guide to Water chemie en Mariene Microbiologie

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

Hier presenteren we VirWaTest, wat een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode is voor de concentratie en detectie van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.

VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

Virusconcentratie uit milieuwater- en afvalwatermonsters is een uitdagende taak, voornamelijk uitgevoerd voor de identificatie en kwantificering van virussen. Hoewel er verschillende virusconcentratiemethoden zijn ontwikkeld en getest, tonen we hier de effectiviteit aan van ultrafiltratie en magere melkvlokking voor RNA-virussen met verschillende monstertypen.

Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie

Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.

Productie en zuivering van adeno-geassocieerd virus door centrifugatie met diodixanoldichtheidsgradiënt voor in-vivotoepassingen

Leer een geoptimaliseerde methode voor virale concentratie uit kleine watermonsters met een glascellulosefilter en secundaire concentratie voor adenovirus. Deze techniek verbetert de terugwinningssnelheid voor milieumonitoring.

Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

Meer video's verkennen