Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

Het algemene doel van het volgende experiment is om virusrecuperatie uit water te optimaliseren met behulp van een kleinschalige techniek die oorspronkelijk is ontworpen om virusconcentraties te optimaliseren. Een glazen cellulosefilter bleek de beste elektropositieve filter te zijn om adenovirus uit water te concentreren. Voor de secundaire elutie bleek een celite secundaire concentratietechniek het beste te zijn voor het elueren van adenovirus van de filteroppervlakken. De resulterende techniek herstelt het meeste adenovirus uit kraanwater op basis van de hoogste percentage herstel dat werd waargenomen tussen alle geteste filter- en elutiecombinaties.

De belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals grootschalige volumeconcentratie, is dat het kleinere monstervolumes gebruikt, waardoor een veelvoud van concentratievariabelen snel en gemakkelijk kan worden geëvalueerd.

Wanneer u zich voorbereidt op dit protocol, moet u alle benodigde oplossingen bij de hand hebben, inclusief de 0,22 micron gefilterde virale oplossing bij 10 tot 100.000 MPN per milliliter.

Begin door een liter steriele kraanwater te meten. Breng het over naar een tweede liter beker met een magnetische roerbare. Terwijl het water roert, voegt u 0,7 gram natriumthiosulfaat toe en laat het volledig oplossen. Pas vervolgens een pH aan tussen 7 en 7,5 door druppelsgewijs een 1 molaard zure of basische stockoplossing toe. Spike vervolgens het water met virus. Voeg een volle milliliter van de bereide virusoplossing toe. Bedek de kolf met een steriele wikkel en laat het virus zich 10 minuten in het water mengen.

Bereid ondertussen de Millipore-filter voor. Haal het eerst uit zijn verpakking en zorg ervoor dat het strak tussen de bovenste kom en de onderste scherm past. Controleer vervolgens of het kurkmateriaal op het filter goed past op de rand van een eenliter zijarmkolf. Verwijder nu de bovenste kom van het filter en plaats met behulp van een pincet een 47 millimeter elektropositieve filterplaat vierkant op het filterscherm. Bevestig vervolgens de kom opnieuw en zet het vast met een tegen de klok in draaiende beweging.

Meet 100 milliliter van het gespikte kraanwater uit met behulp van een steriele cilinder. Breng het water vervolgens over in de voorbereide filterbehuizing op de tweede literkolf. Het elektropositieve schijf in de filter kan geplooid glas-cellulose of nano-alumina glasvezel zijn. Zachte vacuüm kan worden gebruikt om het resterende water door de filter te laten gaan.

Verplaats nu de filterbehuizing naar een 250 milliliter zijarmkolf. Meet 100 milliliter rundvleesextract uit en giet het langzaam over het filter. Laat het extract langzaam doorlopen en gebruik een zachte vacuüm om het resterende extract door te trekken.

Ga vervolgens verder met een van de twee secundaire concentratieopties.

Om het virus te concentreren met behulp van celite, brengt u de inhoud van de 250 milliliter kolf, die het virus bevat, naar een roerplaat. Maak met behulp van een roerbare een kleine vortex. Voeg vervolgens 0,1 gram celitepoeder toe aan 100 milliliter rundvleesextract. Laat de celite zich verspreiden en bereid u voor om de pH van de oplossingen aan te passen. Gebruik druppelsgewijze toevoegingen van 0,1 molaard zoutzuur om de pH te verlagen tot 4,0.

Laat de oplossing vervolgens 10 minuten mengen. Terwijl u mixt, bevestigt u uw 47 milliliter pre-filter op een tweede literkolf. Giet nu 100 milliliter van het rundvleesextract-celitemengsel door de pre-filter. U kunt een lichte vacuüm gebruiken om te voltooien.

Plaats vervolgens een metalen buisklem op het uiteinde van de filterbehuizingsspruit. Bevestig aan de klem een steriele 15 milliliter polypropyleen verzamelbuis en zet vervolgens de filter weer op de kolf.

Eluer nu het virus van de Celite-deeltjes in vijf milliliter 1X PBS bij een pH van negen. Laat het meeste PBS door de zwaartekracht in de 15 milliliter buis druppelen en trek de resterende door met een lichte vacuüm. Om het virus te concentreren met behulp van organische flocculatie, brengt u de inhoud van de 250 milliliter kolf die het virus bevat, over naar een roerplaat. Maak met behulp van een roerbare een kleine vortex. Pas de pH van de oplossing aan op 3,5 met druppelsgewijze toevoegingen van een molaard zoutzuur. Laat de mengsel een half uur roeren. Breng vervolgens de oplossing over in een steriele 250 milliliter conische centrifugeerbuis. Centrifugeer de oplossing gedurende 15 minuten bij 2.500 g en vier graden Celsius. Zorg er na het centrifugeren voor dat u de pellet niet verstoort bij het hanteren van de buizen. Decanteer voorzichtig de supernatant en resuspendeer de pellet in vijf milliliter PBS pH negen. Zorg ervoor dat de pellet is opgelost. Centrifugeer vervolgens de resuspendering bij 4.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel nu het supernatant dat het geconcentreerde virus bevat. De pellet kan worden weggegooid.

Bij het optimaliseren van dit protocol werden drie soorten celite vergeleken. Grotere celite resulteerde in lagere herstelverhoudingen van zowel ADV 40 als ADV 41.

De filterelutie werd getest bij een pH tussen 7,5 en 12 om te bepalen welke het meest effectief zou zijn bij het verzamelen van ADV-deeltjes van de filters. De hoogste herstel werd verkregen van een glas-cellulosefilter gekoppeld met rundvleesextract bij een pH van 10 en met celite. Het resultaat was hetzelfde voor zowel ADV 40 als ADV 41.

Het rundvleesextract bij een pH van 10 bleek superieur te zijn aan organische flocculatie.

De geoptimaliseerde methode werd vergeleken met een toevoeging van 25% trypsine en vergeleken met het suppleren van het rundvleesextract met 0,1% natriumpolyfosfaat. Geen van beide behandelingen verbeterde de ADV-herstel significant.

Eenmaal onder de knie kan deze techniek in 45 minuten worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.