Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,

Het algemene doel van deze procedure is om een op impedantie gebaseerde techniek te gebruiken om de real-time cytoprotectie van een neuronale cellijn te volgen, om zo de betrokkenheid van second messenger-paden in het beschermingsproces af te bakenen. Dit wordt bereikt door eerst een neuronale cellijn onder proliferatieve omstandigheden te kweken in een op impedantie gebaseerde real-time celanalyser. In de tweede stap, potentieel relevante.

Secundaire boodschapperpaden worden farmacologisch geremd voordat de cellijn wordt blootgesteld aan neuroprotectieve behandelingen. Vervolgens wordt de status van de neuronale cellijn gevolgd met een real-time celanalyzer onder de verschillende experimentele condities. Ten slotte kan statistische analyse worden gebruikt om de real-time betrokkenheid van secundaire boodschapperpaden bij de cytoprotectie van de neuronale cellen te beoordelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals endpoint-neurotoxiciteitstesten, is dat het mogelijk maakt om Tito-bescherming en Tito-toxiciteit in real-time en onder labelvrije omstandigheden te evalueren in neuronale cellijnen. Deze methode kan helpen bij het snel beantwoorden van vragen binnen het veld van de moleculaire neurobiologie door bij te dragen aan een meer high-throughput screening van potentiële neuroprotectieve verbindingen in vitro en door inzicht te verschaffen in de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neuroprotectie. Begin met het wassen van een adherente neuronale cellijnlaag. In dit voorbeeld worden humane neuroblastoom S-K-N-S-H-cellen gewassen met PBS, waarna de cellen gedurende vijf minuten bij 37 °C worden getrypsineerd.

Verwijder de trypsine door middel van centrifugatie en resuspendeer de cellen vervolgens in 10 milliliters proliferatiemedium. Verdun na het tellen de cellen met meer proliferatiemedium tot een concentratie van drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter, en equilibreer vervolgens elke well van een EPL 96 met 100 microliters proliferatiemedium in een weefselkweekkast bij kamertemperatuur. Plaats de EPL 96 na 30 minuten in een real-time cell analyzer-station in een kooldioxide-incubator bij 37 degrees Celsius en start de software van de real-time cell analyzer.

Select vervolgens op de lay-outpagina de juiste wells voor het experiment en voer het celtype, het aantal cellen en de namen en concentraties van de betreffende chemische verbindingen in de tekstvakken op de pagina van de planningssoftware in, aangezien stap één vooraf is ingesteld. Selecteer voor de achtergrondmeting 'stap toevoegen' en stel stap twee zo in dat de celindex elke 15 minuten gedurende 96 uur wordt gemeten. Klik daarna op start om stap één te initiëren en de achtergrondimpedantie van het medium te meten.

Verwijder nu de EPL en voeg 100 µL van de neuroblastoomcel-suspensie toe. Draai de EPL 96 voorzichtig rond in elke experimentele put om de putten gelijkmatig te coaten, en incubeer de plaat vervolgens op kamertemperatuur in de weefselkweekkast om de cellen een half uur te laten bezinken. Plaats de EPL 96 daarna terug in het real-time celanalyseapparaat en start stap twee. Om de celindexwaarden gedurende het experiment te bewaken, bekijkt u de celcurven op de plotpagina en de ruwe celindexgegevens op de celindexpagina na 24 uur.

Pauzeer na het uitplaten van de cellen het experiment en verwijder de plaat uit het realtime cell analyzer station. Voeg één microliter van de vers verdunde remmers van belang toe aan elke well. Hervat na het opnieuw laden van de EPL 96 na 30 minuten de experimentele metingen van de celindex. Pauzeer het experiment opnieuw en verwijder vervolgens snel maar voorzichtig het proliferatiemedium uit elke well, waarbij de rand van de pipetpunt naar de hoek van de well wordt gericht om verstoring van de adherente cellaag te voorkomen. Voeg vervolgens onmiddellijk 200 microliter serumvrij medium toe aan elke well, één microliter van de vers verdunde neuroprotectieve verbindingen van belang en één microliter van de remmers van de second messenger-signaalroute van belang aan de betreffende wells.

Ga vervolgens verder met de celindexmetingen elke 15 minuten gedurende 96 uur, zoals eerder ingesteld voor de data-analyse. Selecteer nu op de plotpagina de functies voor genormaliseerde celindex en genormaliseerde tijd om de celindex te normaliseren ten opzichte van het laatste tijdstip vóór de wijzigingen in de celcultuur, om zo de variatie tussen de experimenten te verminderen. Markeer op de plotpagina de wells voor de experimentele condities van belang en klik op 'toevoegen' om de genormaliseerde celindexcurven te plotten.

Exporteer vervolgens de experimentele gegevens voor alle tijdspunten van de celindex vanuit de pagina van de celindexsoftware naar een spreadsheetbestand voor statistische analyse van de verschillen in de celindexwaarden onder de verschillende behandelingscondities op specifieke tijdspunten. Selecteer de celindexwaarden op hun respectievelijke tijdspunten binnen het geëxporteerde spreadsheetbestand. Analyseer tenslotte de celindexwaarden voor de geselecteerde tijdspunten met een een- of tweewegvariantieanalyse, gevolgd door een post hoc-test met behulp van statistische software. Neurotoxische stimuli voor de cellen leiden tot een afname van de celindexwaarden; hier worden in deze grafieken een toename in de celindex getoond wanneer de S-K-N-S-H-cellen worden gekweekt in proliferatiemedium en de daling van de celindex gevolgd door een stabilisatie op de nieuwe lagere niveaus na het overzetten van de cellen naar serumvrij medium.

Het neuroprotectieve effect van twee serotonin 2a-receptoragonisten, 5 µM DOI en 20 µM IDE, toegevoegd wanneer de cellen werden gevoed met serumdeprivatie-medium, kan worden waargenomen. Een belangrijke vraag bij neuroprotectiestudies is of een effect op de celproliferatie bijdraagt aan het waargenomen effect van de verbinding op de celoverleving. In deze grafiek wordt het uitblijven van een effect van behandeling met 5 µM DOI op de proliferatie van SKNS-cellen getoond, wat suggereert dat proliferatie niet bijdraagt aan het waargenomen neuroprotectieve effect.

In deze laatste grafiek kan het effect van behandeling met 10 micromolar van de fosfatidylinositol-3-kinase remmer LY 2 9 4 0 0 2 op de celoverleving en het neuroprotectieve effect van DOI op serumdepriveerde SK NSH-cellen worden waargenomen. LY 2 9 4 0 0 2 voorkwam het neuroprotectieve effect van DOI tijdens de fase van serumdeprivatie, maar vertoonde ook een eigen toxisch effect. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u CTO-protectie in een neuronale cellijn kunt volgen met behulp van een real-time celanalyser, en hoe u de betrokkenheid van second-messengerpaden bij protectie kunt afbakenen.