Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,

Het algemene doel van deze procedure is om een impedantie-gebaseerde techniek te gebruiken om de cytobescherming van een neuronale cellijn in realtime te volgen om de betrokkenheid van tweede boodschapperroutes in het beschermingsproces te omschrijven. Dit wordt bereikt door eerst een neuronale cellijn te kweken onder proliferatieve omstandigheden in een op impedantie gebaseerde realtime cell analyzer. In de tweede stap, mogelijk relevant.

Tweede boodschapperroutes worden farmacologisch geïnhibeerd voordat de cellijn wordt onderworpen aan neuroprotectieve behandelingen. Vervolgens wordt de status van de neuronale cellijn gevolgd met behulp van een real-time cell analyzer onder de verschillende experimentele omstandigheden. Uiteindelijk kan statistische analyse worden gebruikt om de realtime betrokkenheid van tweede boodschapperroutes in de cytobescherming van de neuronale cellen te beoordelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals endpoint neurotoxiciteitsassays, is dat het toestaat Tito-bescherming en titotoxiciteit te evalueren in neuronale cellijnen in realtime en onder labelvrije omstandigheden. Deze methode kan helpen snelle vragen in het moleculaire neurobiologieveld te beantwoorden door bij te dragen aan een hogere doorvoerbeoordeling van potentiële neuroprotectieve verbindingen in vitro, en door inzicht te geven in de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neurobescherming. Begin met het wassen van een adherante neuronale cellijnlaag. Bijvoorbeeld hier, worden humane neuroblastoom S-K-N-SH cellen gebruikt met PBS en vervolgens worden de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius getrypsiniseerd.

Verwijder het trypsine door centrifugatie en schud de cellen vervolgens op in 10 milliliter proliferatiemedium. Na het tellen van de cellen, verdun de cellen tot een concentratie van drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter met meer proliferatiemedium, en breng vervolgens elke put van een EPL 96 in evenwicht met 100 microliter proliferatiemedium in een weefselkweekkap bij kamertemperatuur. Na 30 minuten, plaats de EPL 96 in een real-time cell analyzer station in een kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius en start de real-time cell analyzer software.

Selecteer vervolgens op de lay-outpagina de juiste putten voor het experiment en voer het celtype, celnummer en de namen en concentraties van de chemische verbindingen van belang in de edit boxes op de planningssoftwarepagina in, zoals stap een vooraf is ingesteld. Voor de achtergrondmeting, selecteer een stap toevoegen en stel stap twee in om de celindex elke 15 minuten gedurende 96 uur te meten. Klik vervolgens op start om stap een te initiëren en de achtergrondimpedantie van het medium te meten.

Verwijder nu de EPL en voeg 100 microliter van de neuroblastoomcelsuspensie toe. Zwaai voorzichtig met de EPL 96 in elke experimentele put om de putten gelijkmatig te bedekken, en incubeer vervolgens de plaat bij kamertemperatuur in de weefselkweekkap om de cellen na een half uur te laten bezinken, laad de EPL 96 terug in de realtime cell analyzer station en start stap twee. Om de celindexwaarden gedurende het experiment te volgen, bekijk de celcurven op de plotpagina en de ruwe celindexgegevens op de celindexpagina na 24 uur.

Na het plateren van de cellen, pauzeer het experiment en verwijder de plaat uit de realtime cell analyzer station. Doe een microliter van de vers verdunde remmer van belang in elke put en na het opnieuw laden van de EPL 96, hervat u de experimentele celindexmetingen na 30 minuten, pauzeer het experiment opnieuw en verwijder snel maar voorzichtig het proliferatiemedium uit elke put, waarbij u de rand van de pipettip naar de hoek van de put richt om verstoring van de adherante cellage te voorkomen. Voeg vervolgens onmiddellijk 200 microliter serumdeprivatiemedium toe aan elke put, een microliter van de vers verdunde neuroprotectieve verbindingen van belang en een microliter van de tweede boodschapperrouteremmers van belang in de geschikte putten.

Vervolgens gaat u verder met de celindexmetingen elke 15 minuten gedurende 96 uur zoals eerder ingesteld om de gegevens te analyseren, selecteer nu de genormaliseerde celindex en genormaliseerde tijdsfuncties op de plotpagina om de celindex te normaliseren op het laatste tijdstip vóór de wijzigingen in de cellijncultuur. Om de variatie tussen de experimenten te verminderen. Markeer de putten op de plotpagina voor de experimentele omstandigheden van belang en klik op toevoegen om de genormaliseerde celindexcurven te plotten.

Exporteer vervolgens de experimentele gegevens voor alle celindex tijdstippen vanuit de celindex softwarepagina naar een spreadsheetbestand voor statistische analyse van de verschillen in de celindexwaarden onder de verschillende behandelingsomstandigheden op specifieke tijdstippen. Selecteer de celindexwaarden op hun respectieve tijdstippen binnen het geëxporteerde spreadsheetbestand. Analyseer ten slotte de celindexwaarden voor de geselecteerde tijdstippen met een of tweeweg variantieanalyse, gevolgd door een post hoc test Gebruik statistische software neurotoxische stimuli voor de cellen leiden tot een afname van de celindexwaarden hier een toename van de celindex wanneer de S-K-N-SH cellen worden gekweekt in proliferatiemedium en de daling van de celindex gevolgd door een stabilisatie op de nieuwe lagere niveaus na het overschakelen van de cellen naar serumdeprivatiemedium worden getoond in deze grafieken.

Het neuroprotectieve effect van twee serotonine twee a-receptoragonisten vijf micromolar, DOI en 20 micromolar IDE toegevoegd toen de cellen werden gevoed met serumdeprivatiemedium kan worden waargenomen. Een belangrijke vraag in neurobeschermingsstudies is of een effect op de celproliferatie bijdraagt aan het waargenomen verbindingseffect op de celoverleving. In deze grafiek wordt het gebrek aan effect van vijf micromolar DOI-behandeling op SKNS-celproliferatie getoond, wat suggereert dat de proliferatie niet bijdraagt aan het waargenomen neuroprotectieve effect.

In deze laatste grafiek kan het effect van behandeling met 10 micromolar van de fosfatidylinetitiële drie kinase remmer LY 2 9 4 0 0 2 op celoverleving en het neuroprotectieve effect van DOI op serumdepriveerde SK NSH-cellen worden waargenomen. LY 2 9 4 0 0 2 voorkwam het neuroprotectieve effect van DOI tijdens de serumdeprivatiefase, maar vertoonde ook enkele toxische effecten van zichzelf. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u CTO-bescherming