Name: Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer hoe u een impedantie-gebaseerde celanalyzer gebruikt om in realtime cytoprotectie in neuronale cellijnen te volgen. Deze methode helpt bij het in kaart brengen van tweede boodschapperroutes in neuroprotectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiële ondersteuning voor de experimenten die in het onderzoek worden gepresenteerd, werd verstrekt door het Marie Heim-Vögtlin programma van de Zwitserse Nationale Wetenschapsstichting.
We danken mevrouw Johanna Nyffeler voor het ontwikkelen van een reeks aangepaste MATLAB-programma's voor het screenen op statistisch significante verschillen in real-time cell analyzer’s gegevens en Dr. Yama Abassi voor de nuttige discussie.

Bereiding 1 <ol><li> Plaats station de real-time cell analyzer in een weefselkweek incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2. Voer alle celcultuur behandeling en farmacologische behandelingen in een weefselkweek kap onder steriele omstandigheden. </li><li> OPMERKING: neuronale cellijnen vereisen verschillende temperatuur instellingen in vergelijking met standaard voorwaarden voor cultuur, moet dienovereenkomstig worden aangepast. Voor zwak hechtende cellijnen gebruikt bekledingsmiddelen om de interactie van cellen met de gouden micro-elektroden in de bodem van de putjes van de E-plaat 96 te vergemakkelijken. </li><li> Bereid 1000x voorraadoplossingen van de farmacologische samenstelling voor celkweek behandeling (neuroprotectieve middelen of second messenger pathways remmers in het geschikte oplosmiddel - dimethylsulfoxide of steriel water) en opgeslagen bij -20 ° C. Gebruik het oplosmiddel voertuig de volgende behandelingen. </li><li> Cultuur humane neuroblastoma SK-N-SH cellen in DMEM / F12 medium aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) (proliferatie medium) in culturele flesjes met 175 cm2 oppervlak dichtheid van ongeveer 75%. Houd celpassagegetal binnen een bereik (van ongeveer 10 passages) om de consistentie tussen de experimenten vast te stellen in termen van snelheid van celproliferatie en de respons op cytotoxiciteit. Lagere passage nummers voorkeur. </li><li> Was de hechtende SK-N-SH cellaag met PBS en trypsinize met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer de cellen bij 170 xg gedurende 5 minuten tot trypsine te verwijderen. Resuspendeer de cellen in 10 ml proliferatie medium. Tel de cellen met Scepter celgetalmeter en stel het aantal cellen tot 300.000 cellen / ml door verdunning van cellen met proliferatie medium. </li></ol> 2 Plating en verspreiding van SK-N-SH cellen <ol><li> Voeg 100 ul proliferatie medium aan elk putje van de E-Plate 96 en laat het gedurende 30 minuten in de weefselkweek kap bij RT in evenwicht. Plaats de E-Plate 96 in real-time cell analyzer station in de CO2 incubator bij 37 ° C. </li><li> Start de real-time cell analyzer software. Op de pagina Opmaak selecteert de putten in het experiment en het invoeren in de invoervakken de informatie over het type cel, mobiele nummer, namen en concentraties van chemische verbindingen gebruikt voor cel behandeling. OPMERKING: Voor de toepassing van dit protocol ten minste 4 replica&#39;s worden aanbevolen voor elke behandeling. </li><li> Op het schema software pagina bepalen &quot;stappen&quot; in het experiment, door het selecteren van het aantal sweeps meetcel Index en de interval tussen de slagen voor elke stap. Sinds Stap 1 is vooraf bepaald voor de achtergrond meten, selecteert u &quot;Voeg een stap&quot; en zet stap 2 om de Cell Index meet elke 15 minuten voor 96 uur. OPMERKING: Voor behandelingen, waarbij effecten met snelle kinetiek worden verwacht, stelt veegt met kortere tussenpozen. </li><li> Klik op Start om het automatisch vooraf Stap initiëren 1en meet de achtergrond impedantie van de media. Deze waarde wordt automatisch afgetrokken door de software op elk gegevenspunt als de cellen worden toegevoegd aan de putjes. </li><li> De eerder bereid in stap 1.5) celsuspensie van 300.000 cellen / ml in proliferatie medium. 30.000 cellen / putje voor celtoxiciteit / neuroprotectie studies en 15.000 cellen / putje voor celproliferatie studies. Neem de E-Plate en voeg 100 ul celsuspensie per putje voor cel toxiciteit / neuroprotection studies en voeg 50 ul celsuspensie en 50 ul proliferatie medium per putje voor celproliferatie studies. Het aantal cellen per putje te worden geoptimaliseerd voor elke cellijn empirisch. </li><li> Zwenk de E-Plate 96, zelfs voor beplating van de cellen. Laat de E-plaat 96 voor 30 min in weefselkweek kap bij kamertemperatuur om de cellen gelijkmatig bezinken naar de bodem van de putjes. </li><li> Plaats de E-plaat 96 in de real-time mobiele analyzer station en start stap 2 op het schema pleeftijd. Monitor Cell Index waarden gedurende het experiment door het bekijken van de cel bochten op de Plot-pagina en de ruwe Cell Index gegevens over de Cel Index pagina van de software. </li></ol> 3 serumdeprivatie <ol><li> 24 uur na plating de cellen, te pauzeren het experiment, en verwijder de e-Plate 96 van de real-time mobiele analyzer station. Verdun tweede messenger remmers van 1000x aandelen met DMEM / F12 serumvrij medium - 200 x de eindconcentratie. Behandel cellen met 1 pl remmers van second messenger pathways worden getest voor hun betrokkenheid bij neurotoxiciteit / neuroprotection 30 minuten voor het begin van de cytotoxiciteit, de respectieve paden remmen. Zet de E-Plate 96 naar het station en hervatten experimentele Cell Index metingen. </li><li> Na 30 minuten te pauzeren het experiment. Verwijder voorzichtig proliferatie medium volledig uit de E-Plate 96 wells met een pipet (of multi-channel pipet), het verzorgen van het aanhangend cellaag niet te verstorendoor het richten van de rand van de pipetpunt om de hoek van de put. Voeg 200 ul / putje serumvrij DMEM / F12 medium (serum deprivatie medium). Zorgen voor snelle uitwisseling van celkweekmedium mechanische agitatie van de cellen te minimaliseren. </li><li> Verdun verbindingen worden getest op hun neuroprotectieve effecten van 1000x stock met serumvrij DMEM / F12 medium 200 x de eindconcentratie. Voeg 1 ul verbindingen worden getest op hun neuroprotectieve effecten en 1 pl remmers van second messenger pathways in de afzonderlijke putjes volgens proefopzet. </li><li> In cellen voor proliferatie studies niet medium veranderen. Verdun te testen verbindingen van 1000x stock 200 x de eindconcentratie in proliferatie medium, behandel met 1 ul per putje en blijven cultuur in proliferatie medium. </li><li> Hervat het experiment voort te zetten met de Cel Index metingen om de 15 minuten voor 96 uur zoals eerder ingesteld. </li></ol> 4 Data Abestudeert de analyse <ol><li> Voor neurotoxiciteit / neuroprotection gegevens normaliseren Cell Index om het laatste tijdstip voordat farmacologische behandeling of medium verandering om de variatie tussen de experimenten te verminderen door &quot;genormaliseerd Cell Index&quot; te selecteren en &quot;normaliseren tijd&quot; op het perceel pagina. </li><li> Markeer de putten op de Plot-pagina voor de experimentele condities van de rente en klik op &quot;Add&quot; om de genormaliseerde Cell Index curves plotten. Let op de kinetiek van de neurotoxische / neuroprotectieve effect, of van second messengers remming als genormaliseerde Cell Index curves als functie van de tijd. </li><li> Neem de cel Index curves voor de geteste geneesmiddel behandelingen proliferatie medium als functie van de tijd te beoordelen of een effect op de proliferatie is betrokken bij de neuroprotectieve / neurotoxische effect. </li><li> Exporteer de experimentele informatie voor alle Cell Index tijdstippen van de Cel Index software pagina in een Excel-bestand met statistische evaluatie van de resultaten starten <br/&gt; OPMERKING: Als een eerste stap in de statistische analyse van een reeks van gemodificeerde MATLAB programma&#39;s die de Welch t-test te gebruiken, met de p-waarde uitgezet semilogarithmically, gebruik maken van omgekeerde as tegen de tijdschaal (verstrekt als aanvullende code-bestanden). Deze programma waarmee de aanwezigheid van p-waarden over het tijdsverloop van een volledige real-time cell analyzer experiment en daarmee de selectie van tijdstippen voor gedetailleerdere statistische analyse steun. Zie het aanvullend materiaal voor gedetailleerde informatie over de programma&#39;s. </li><li> Voor statistische analyse van de verschillen in de cel Index waarden onder verschillende behandeling omstandigheden op specifieke tijdstippen, selecteer Cel Index waarden bij respectieve tijdstippen van de geëxporteerde Excel-bestand. Analyseer de Cel Index waarden voor de geselecteerde tijdstippen met one-way of twee-weg variantie-analyse (ANOVA), gevolgd door een post-hoc test met statistische software. </li></ol>

<ol><li>Cavallucci, V., D'Amelio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+of+life+and+death%3A+the+pharmacological+approaches+targeting+apoptosis+in+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases.</a> Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).</li>
<li>Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBull%2C+S+%22Focus+on+Neurological+Diseases%22">Focus on Neurological Diseases</a>. , Health Protection Agency. (2007).</li>
<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Diemert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+measurement+for+real-time+detection+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).</li>
<li>Kustermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free%2C+impedance-based+real+time+assay+to+identify+drug-induced+toxicities+and+differentiate+cytostatic+from+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects.</a> Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT2A+serotonin+receptor+agonist+DOI+alleviates+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%3A+role+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT%282A%29+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+%285-HT%29+induces+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+%28GDNF%29+mRNA+expression+via+the+transactivation+of+fibroblast+growth+factor+receptor+2+%28FGFR2%29+in+rat+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells.</a> J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).</li>
<li>Galante, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity%2C+conformation+and+morphology+of+typical+initial+aggregation+states+of+A%CE%B21-42+and+A%CE%B2py3-42+beta-amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).</li>
<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

Publicatiekosten voor de huidige video-artikel werd gesponsord door &quot;ACEA Biosciences&quot;.

Het huidige protocol presenteert het nut van een real-time mobiele analyzer om continu en onder-label-vrije omstandigheden de neuroprotectieve / neurotoxische effecten van verbindingen in neuronale cellijnen te beoordelen en om inzicht te krijgen in de tweede boodschapper die betrokken zijn bij de werking. Hoewel het nut real-time cell analyzer tot cytotoxiciteit en de effecten van geneesmiddelen op celproliferatie studie wordt algemeen erkend, slechts enkele studies in neuronale verwante ce...

Neuronale celdood speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele hersenen gerelateerde aandoeningen 1. De beschikbaarheid van betrouwbare en high-throughput in vitro de toxiciteit testen is van cruciaal belang om een beter inzicht te krijgen in de mechanismen van neurotoxiciteit en te helpen selecteren neuroprotectieve moleculen als therapeutische kandidaten in de ontwikkeling van geneesmiddelen 2. Er zijn veel beperkingen meest gebruikte in vitro neurotoxiciteit assays.They beoordelen neurotoxiciteit / neuroprotectie op een tijdpunt niet toestaan ​​kinetische resolutie; vaak gebruik etiket of probe die kan interfereren met de signaalwegen en beperken aanvullende studies in dezelfde celpopulatie en die vaak arbeidsintensief, en in veel gevallen niet voorzien mechanistisch inzicht. In de onderhavige studie tonen we het nut van een real-time impedantie gebaseerde cell analyzer neurotoxiciteit en neuroprotectie in een neuronale cellijn in real-time en onder bepalen labelvrijeomstandigheden en om inzicht te geven in downstream mechanismen door middel van analyse van de second messenger pathways betrokken bij de werking. Eerdere studies hebben de geldigheid van de real-time cell analyzer bevestigd cytotoxiciteit en effecten op celproliferatie in cellijnen vastgesteld in vergelijking met standaard technieken 3,4,5,6. Zo werd een goede correlatie waargenomen tussen uitlezingen van de standaard cellevensvatbaarheid WST-1 test en Cell Index waarden op verschillende tijdstippen onder basale omstandigheden proliferatie en na twee verschillende toxische paradigma in HeLa-cellen 3. In A549 en MDA-MB-231 cellen proliferatie en cytotoxiciteit uitgelokt met de microtubuli stabilisator paclitaxel toonde zeer vergelijkbaar waarden wanneer beoordeeld door Cell Index metingen en het standaard gebruikte sulforhodamine B (SRB) test 4. In de neuronale cellijn van geïmmortaliseerde hippocampale neuronen werden HT-22 Cell Index metingen gevalideerd op hun vermogen to detecteren celproliferatie, glutamaat cytotoxiciteit en celbescherming tegen de gebruikte 3-(4,5-dimethyl-2-yl) 2,5-difenyltetrazolium-bromide (MTT) test 5. In dezelfde studie de MTT assay resultaten en Cell Index metingen ook goed gecorreleerd meten neuronale progenitorcellen proliferatie, cytotoxiciteit na groeifactoren ontbering en redden van cytotoxiciteit door de pan-caspase inhibitor QVD 5. Cytotoxiciteit geïnduceerd in NIH 3T3 cellen door Vandetanib (vasculaire endotheliale groeifactor receptor en epidermale groeifactor receptor remmer) een vergelijkbaar resultaat gemeten Cell Indexwaarden of neutrale rode opname test 6. We hebben onlangs gebruikt de real-time cell analyzer systeem neuroprotectieve effecten van serotonine 2A beoordelen (5-HT2A) receptor agonist (±) -2,5-dimethoxy-4-joodamfetamine hydrochloride (DOI) in een neuronale cellijn ( SK-N-SH cellen) en gescreend op de betrokkenheid van second boodschapper paden door het monitoren van de effecten van hun chemische remming van de waargenomen neuroprotection 7. Interessant is dat de 5-HT2A receptor zowel hallucinogene nonhallucinogenic agonisten (zoals DOI en lisuride, respectievelijk), die zowel de gemeenschappelijke en specifieke second messenger pathways 8 kan activeren. De voordelen van de voorgestelde techniek is dat het mogelijk maakt om real-time informatie over celoverleving verzamelen gedurende de dag, af te bakenen tweede messenger pathways betrokken, de mogelijke bijdrage van proliferatie effecten neuroprotectie beoordelen en om een ​​optimale tijd selecteren extra eindpunt studies op dezelfde celpopulatie. Een schematisch diagram van de werkstroom in het huidige protocol is weergegeven in figuur 1.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&nbsp; RTCA SP system bundle</td><td>ACEA Biosciences</td><td>Nr: 00380601030</td><td>Bestaat uit RTCA Analyzer, RTCA SP Station en RTCA Control Unit</td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>ACEA Biosciences</td><td>Nr: 05232368001</td><td>Voor het kweken van de cellen, geplaatst in de RTCA SP Station</td></tr><tr><td>SK-N-SH cellen</td><td>ATCC (in samenwerking met LGC Standards)</td><td>HTB-11</td><td>Kan worden vervangen door een andere belangrijke neuronale cellijn</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>Cellenkweekmedium</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>16140-063</td><td>Aanvulling op proliferatie, maar geen serumvrij medium</td></tr><tr><td>Weefselkweekflacon T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>Voor het kweken van cellen, die later op de E-Plate 96 worden geplaatst</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Voor het trypsiniseren van cellen gekweekt in weefselkweekflessen</td></tr><tr><td>Scepter 2.0 celteller</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Automatische celteller</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Voor het wassen van de cellen</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-DOI hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>5-HT2A agonist voor celkweekbehandeling</td></tr><tr><td>LY-294002 hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td><td>PI3-K remmer voor celkweekbehandeling</td></tr><tr><td>Lisuride maleaat</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4052</td><td>Verbinding met 5-HT2A agonistische activiteit voor celkweekbehandeling</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>Voor het oplossen van LY-294002 en lisuride maleaat</td></tr></tbody></table>

real-time impedantie-gebaseerde cell analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en neuroprotectie in een neuronale cellijn,

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Veel hersenen gerelateerde aandoeningen hebben neuronale celdood betrokken bij hun pathofysiologie. Verbeterde in vitro modellen voor neuro-of neurotoxische effecten van drugs en ​​downstream pathways die betrokken zou helpen inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen van neuroprotection / neurotoxiciteit en kan mogelijk de ontwikkeling van geneesmiddelen te vergemakkelijken bestuderen. Echter, veel van de bestaande in-vitro-toxiciteit testen hebben grote beperkingen - de meeste beoordelen neurotoxiciteit en neuroprotection op een enkel tijdstip, niet toe te staan ​​om het tijdsverloop en de kinetiek van het effect waarnemen. Bovendien zou de mogelijkheid om informatie over de downstream signaling pathways betrokken bij zenuwbescherming in real-time verzamelen van groot belang zijn. In het huidige protocol beschrijven we het gebruik van een real-time impedantie gebaseerde cell analyzer neuroprotectieve effecten van serotonine 2A (5-HT2A) receptor agonisten in een neuronale cellijn onder-label vrij en real-time condit bepalenionen met impedantiemetingen. Verder tonen we aan dat remmers van second messenger pathways kan worden om downstream moleculen betrokken bij de neuroprotectieve effect bakenen. We beschrijven ook de bruikbaarheid van deze techniek te bepalen of een effect op celproliferatie bij tot een waargenomen neuroprotectieve effect. Het systeem maakt gebruik van speciale micro platen aangeduid als E-platen die bevatten afwisselend gouden micro-elektrode arrays aan de onderkant van de putjes, die als mobiele sensoren. De impedantie uitlezing wordt gemodificeerd door het aantal hechtende cellen, cellevensvatbaarheid, morfologie en hechting. Een dimensieloze parameter genaamd Cell Index is afgeleid van de elektrische impedantiemetingen en wordt gebruikt om de status cel bevindt. Over het algemeen, de real-time-impedantie gebaseerde cel analyser zorgt voor real-time, label-free beoordeling van neuroprotectie en neurotoxiciteit, en de evaluatie van de second messenger pathways betrokkenheid, bij te dragen aan meergedetailleerd en high-throughput worden mogelijke neuroprotectieve verbindingen in vitro, voor het selecteren therapeutische kandidaten.

<html> Serumdeprivatie leidt tot afname Cell Index waarden, die continu kan worden bewaakt met de real-time cell analyzer Neurotoxische stimuli om de cellen leidt tot een afname in Mobiele Index waarden die kunnen worden gemonitord in real-time de gepresenteerde techniek en de dynamiek van die afhankelijk van de specifieke neurotoxische stimulus en de celtype onderzocht. Figuur 2 toont de stijging cel Index toen SK-N-SH cellen worden gekweekt in medium prolif...

Verbeterde in vitro neurotoxiciteitstesten zouden helpen bij het identificeren van nieuwe neuroprotectieve verbindingen. De bruikbaarheid van een real-time impedantie-gebaseerde celanalysator om cytotoxiciteit en cytoprotectie in neuronale cellijnen te bepalen en om de betrokkenheid van tweede boodschapperroutes te bepalen, waardoor inzicht wordt verkregen in het mechanisme van neuroprotectie, wordt gepresenteerd.

Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

Het algemene doel van deze procedure is om een op impedantie gebaseerde techniek te gebruiken om de real-time cytoprotectie van een neuronale cellijn te volgen, om zo de betrokkenheid van second messenger-paden in het beschermingsproces af te bakenen. Dit wordt bereikt door eerst een neuronale cellijn onder proliferatieve omstandigheden te kweken in een op impedantie gebaseerde real-time celanalyser. In de tweede stap, potentieel relevante.Secundaire boodschapperpaden worden farmacologisch geremd voordat de cellijn wordt blootgesteld aan neuroprotectieve behandelingen. Vervolgens wordt de status van de neuronale cellijn gevolgd met een real-time celanalyzer onder de verschillende experimentele condities. Ten slotte kan statistische analyse worden gebruikt om de real-time betrokkenheid van secundaire boodschapperpaden bij de cytoprotectie van de neuronale cellen te beoordelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals endpoint-neurotoxiciteitstesten, is dat het mogelijk maakt om Tito-bescherming en Tito-toxiciteit in real-time en onder labelvrije omstandigheden te evalueren in neuronale cellijnen. Deze methode kan helpen bij het snel beantwoorden van vragen binnen het veld van de moleculaire neurobiologie door bij te dragen aan een meer high-throughput screening van potentiële neuroprotectieve verbindingen in vitro en door inzicht te verschaffen in de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij neuroprotectie. Begin met het wassen van een adherente neuronale cellijnlaag. In dit voorbeeld worden humane neuroblastoom S-K-N-S-H-cellen gewassen met PBS, waarna de cellen gedurende vijf minuten bij 37 °C worden getrypsineerd.Verwijder de trypsine door middel van centrifugatie en resuspendeer de cellen vervolgens in 10 milliliters proliferatiemedium. Verdun na het tellen de cellen met meer proliferatiemedium tot een concentratie van drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter, en equilibreer vervolgens elke well van een EPL 96 met 100 microliters proliferatiemedium in een weefselkweekkast bij kamertemperatuur. Plaats de EPL 96 na 30 minuten in een real-time cell analyzer-station in een kooldioxide-incubator bij 37 degrees Celsius en start de software van de real-time cell analyzer.Select vervolgens op de lay-outpagina de juiste wells voor het experiment en voer het celtype, het aantal cellen en de namen en concentraties van de betreffende chemische verbindingen in de tekstvakken op de pagina van de planningssoftware in, aangezien stap één vooraf is ingesteld. Selecteer voor de achtergrondmeting 'stap toevoegen' en stel stap twee zo in dat de celindex elke 15 minuten gedurende 96 uur wordt gemeten. Klik daarna op start om stap één te initiëren en de achtergrondimpedantie van het medium te meten.Verwijder nu de EPL en voeg 100 µL van de neuroblastoomcel-suspensie toe. Draai de EPL 96 voorzichtig rond in elke experimentele put om de putten gelijkmatig te coaten, en incubeer de plaat vervolgens op kamertemperatuur in de weefselkweekkast om de cellen een half uur te laten bezinken. Plaats de EPL 96 daarna terug in het real-time celanalyseapparaat en start stap twee. Om de celindexwaarden gedurende het experiment te bewaken, bekijkt u de celcurven op de plotpagina en de ruwe celindexgegevens op de celindexpagina na 24 uur.Pauzeer na het uitplaten van de cellen het experiment en verwijder de plaat uit het realtime cell analyzer station. Voeg één microliter van de vers verdunde remmers van belang toe aan elke well. Hervat na het opnieuw laden van de EPL 96 na 30 minuten de experimentele metingen van de celindex. Pauzeer het experiment opnieuw en verwijder vervolgens snel maar voorzichtig het proliferatiemedium uit elke well, waarbij de rand van de pipetpunt naar de hoek van de well wordt gericht om verstoring van de adherente cellaag te voorkomen. Voeg vervolgens onmiddellijk 200 microliter serumvrij medium toe aan elke well, één microliter van de vers verdunde neuroprotectieve verbindingen van belang en één microliter van de remmers van de second messenger-signaalroute van belang aan de betreffende wells.Ga vervolgens verder met de celindexmetingen elke 15 minuten gedurende 96 uur, zoals eerder ingesteld voor de data-analyse. Selecteer nu op de plotpagina de functies voor genormaliseerde celindex en genormaliseerde tijd om de celindex te normaliseren ten opzichte van het laatste tijdstip vóór de wijzigingen in de celcultuur, om zo de variatie tussen de experimenten te verminderen. Markeer op de plotpagina de wells voor de experimentele condities van belang en klik op 'toevoegen' om de genormaliseerde celindexcurven te plotten.Exporteer vervolgens de experimentele gegevens voor alle tijdspunten van de celindex vanuit de pagina van de celindexsoftware naar een spreadsheetbestand voor statistische analyse van de verschillen in de celindexwaarden onder de verschillende behandelingscondities op specifieke tijdspunten. Selecteer de celindexwaarden op hun respectievelijke tijdspunten binnen het geëxporteerde spreadsheetbestand. Analyseer tenslotte de celindexwaarden voor de geselecteerde tijdspunten met een een- of tweewegvariantieanalyse, gevolgd door een post hoc-test met behulp van statistische software. Neurotoxische stimuli voor de cellen leiden tot een afname van de celindexwaarden; hier worden in deze grafieken een toename in de celindex getoond wanneer de S-K-N-S-H-cellen worden gekweekt in proliferatiemedium en de daling van de celindex gevolgd door een stabilisatie op de nieuwe lagere niveaus na het overzetten van de cellen naar serumvrij medium.Het neuroprotectieve effect van twee serotonin 2a-receptoragonisten, 5 µM DOI en 20 µM IDE, toegevoegd wanneer de cellen werden gevoed met serumdeprivatie-medium, kan worden waargenomen. Een belangrijke vraag bij neuroprotectiestudies is of een effect op de celproliferatie bijdraagt aan het waargenomen effect van de verbinding op de celoverleving. In deze grafiek wordt het uitblijven van een effect van behandeling met 5 µM DOI op de proliferatie van SKNS-cellen getoond, wat suggereert dat proliferatie niet bijdraagt aan het waargenomen neuroprotectieve effect.In deze laatste grafiek kan het effect van behandeling met 10 micromolar van de fosfatidylinositol-3-kinase remmer LY 2 9 4 0 0 2 op de celoverleving en het neuroprotectieve effect van DOI op serumdepriveerde SK NSH-cellen worden waargenomen. LY 2 9 4 0 0 2 voorkwam het neuroprotectieve effect van DOI tijdens de fase van serumdeprivatie, maar vertoonde ook een eigen toxisch effect. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u CTO-protectie in een neuronale cellijn kunt volgen met behulp van een real-time celanalyser, en hoe u de betrokkenheid van second-messengerpaden bij protectie kunt afbakenen.

real-time-impedance-based-cell-analyzer-as-tool-to-delineate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, we demonstrate the process of real-time monitoring of cellular events, including the proliferation of adherent cells, via a cellular impedance assay. Here, the adherent cells act as insulators, restricting the current flow between the electrodes and increasing the impedance.

Cellular Impedance-Based Analysis for Monitoring of Cellular Processes in Real-Time

Source: Mudduluru, G., et. al. Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates an impedance-based assay to measure glioblastoma cell invasion and migration. Cells degrade the extracellular matrix, move through microporous membranes, and adhere to electrodes, generating impedance. This real-time analysis reflects their invasive potential for cancer research applications.

Impedance-Based Measurements of Brain Cancer Cell Invasion

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Dit manuscript beschrijft hoe je vloeistofbionchips bereidt met epitheelcellen van de kieuwen van regenbooforen voor gebruik in een draagbare elektrische cel-substraat impedantiesensor in het veld. Het protocol voor het uitvoeren van een snelle drinkwatertoxiciteitstest met de sensor wordt ook beschreven.

Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van het vermogen van kankercellen om te migreren en binnen te vallen onder verschillende behandelingsvoorwaarden is cruciaal voor het beoordelen van therapeutische strategieën. Dit protocol presenteert een methode om de real-time gemetastaseerde vermogens van een glioblastoom kanker cellijn te beoordelen.

Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Hier demonstreren we het gebruik van celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) als een zeer eenvoudige en eenvoudige methode om Zika-virusinfectie en -replicatie in menselijke cellen in realtime te bestuderen. Bovendien is de CEI-test nuttig voor de evaluatie van antivirale verbindingen.

Celgebaseerd elektrisch impedantieplatform om Zika-virusremmers in realtime te evalueren

Hier demonstreren we de techniek van het gebruik van op impedantie gebaseerde biosensoren: ECIS en cellZscope, voor het meten van de sterkte van de endotheliale barrière van de hersenen. We beschrijven de voorbereiding en techniek van het toevoegen van verschillende stimuli aan een in vitro model van het hersenendotheel. We meten, registreren en geven een representatieve analyse van de bevindingen.

Het meten van veranderingen in de integriteit van de endotheliale barrière van de hersenen met twee op impedantie gebaseerde biosensoren als reactie op kankercellen en cytokines

We hebben een computerprogramma ontwikkeld om neuronale morfologie te analyseren. In combinatie met de twee bestaande open source analyse-instrumenten, ons programma voert Sholl analyse en bepaalt het aantal neurieten, branche punten en neurieten tips. De analyses zijn zo uitgevoerd dat de lokale veranderingen in de morfologie van neurieten kan worden waargenomen.

Geautomatiseerde Sholl Analyse van Gedigitaliseerde Neuronale morfologie op meerdere schalen

Leer hoe u een impedantie-gebaseerde celanalyzer gebruikt om in realtime cytoprotectie in neuronale cellijnen te volgen. Deze methode helpt bij het in kaart brengen van tweede boodschapperroutes in neuroprotectie.

Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn, (Video) | JoVE Journal

Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,

Meer video's verkennen