Gelijktijdige Langdurige Recordings op Twee Neuronale Processing Fasen in Behaving Honingbijen
21 juli 2014
Gelijktijdige extracellulaire langdurige opnames van twee verschillende hersengebieden neuropiles of twee verschillende anatomische traktaten werden opgericht in honingbijen. Deze opnamen kan de onderzoek temporele aspecten van neuronale verwerking in verschillende hersengebieden in het neuron en op het ensemble niveau in een dier gedragen.
Het algemene doel van deze procedure is om reukbekleding en geheugenvorming te bestuderen met behulp van langdurige toegang tot twee onafhankelijke neuronale verwerkingsstadia binnen gedragende honingbijen. Dit wordt bereikt door eerst goedkope multi-kanaals elektroden samen te stellen uit geïsoleerde kopermicrodraden en op maat gemaakte houders. De volgende stap is om een levende honingbij voor te bereiden door een deel van zijn hoofdkap te verwijderen om twee met een fluorescerende kleurstof behandelde elektroden in de blootgestelde hersenen te plaatsen.
De derde stap is om op te nemen van de twee onafhankelijke neuro pillen of tractus in de reukroute, terwijl geprikkeld met bloemengeuren en feromonen. Later, na het dissecteren van de hersenen, wordt een andere fluorescerende tracer in de antennelob geïnjecteerd om de doelneuronen terug te vullen. De terug gevulde sporen en de elektrode-sporen worden vervolgens gevisualiseerd om een driedimensionale reconstructie van de neuronale architectuur te produceren.
Uiteindelijk kunnen relaties in reukbekleding tussen de twee neuronpopulaties op verschillende verwerkingsniveaus zoals de antennelob en de paddenstoel worden beter begrepen met behulp van deze technieken. Dus de belangrijkste voordelen van deze techniek van bestaande methoden is dat onze multikanaals elektroden erg klein zijn en in combinatie kunnen worden gebruikt, wat betekent dat we tegelijkertijd op verschillende gebieden van de hersenen kunnen opnemen nadat ze zijn verankerd. De flexibele draden maken een stabiel herinneren gedurende meerdere uren mogelijk bij gedragende dieren.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van neuropathologie, zoals het begrijpen hoe dieren reuken ontvangen, waarnemen en uiteindelijk berekenen in het leven uit hun omgeving. Deze dubbele opnametechniek kan inzicht geven in de onderliggende mechanismen van reukcodering en neuronale netwerken in het algemeen. Het kan ook worden toegepast op andere modelorganismen in de ongewervelde of affectieve en neurobiologie.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat er veel training nodig is om honingbijneuronen te identificeren met behulp van alleen morfologische kenmerken zoals de interne lob of de verticale lob van de paddenstoel. Voor dit protocol, bouw een elektrode-adapter om past op een standaard elektrode-interfacebord. Soldeer eerst drie korte stukken geïsoleerde draden op een 18-pins connector.
Snij vervolgens een stuk plexiglasplaat en steek een ondiepe groef langs de langste kant. Schroef vervolgens soldeermoffen in de plexiglasplaat en lijm de plaat op de bovenkant van de connector. Verbind vervolgens de basis met de moffen met behulp van de drie korte draden.
Plaats vervolgens een glazen capillair in de groef van de plexiglasplaat. Het capillair moet kunnen glijden en worden vastgezet door een schroef. Gebruik een minutian-pin om het glazen capillair ongeveer vijf millimeter naar buiten te strekken. Het capillair en de pin worden gebruikt om de elektrode microdraden te ondersteunen en te stabiliseren.
Plaats vervolgens drie microdraden. Met behulp van plakband voor betere toegang kan het glazen capillair worden verwijderd met behulp van een 12 volt soldeer naald lijm. De draden samen met LMP tandheelkundig wasplak niet de laatste derde van de draden.
Verbind nu deze multikanaals microdraadassemblage met de elektrode-adapter. Plaats de verlengde glazen capillair parallel aan de microdraden. Beveilig deze bevestiging met tandheelkundig wasplak langs de overlappende glazen capillair en de minutian-pin.
Knip vervolgens de elektrodedraden af en laat twee tot drie centimeter uitsteken vanaf de minutian-pin en twee tot drie centimeter uitsteken vanaf het elektrode-uiteinde. Bevestig vervolgens de capillair in de elektrode-adapter en gebruik een schroef om alles op zijn plaats te stabiliseren. Bij 360 graden Celsius.
Soldeer de uiteinden van de draden loodrecht op de moffen. Controleer vervolgens of er een voldoende sterke elektrische verbinding is door te controleren of hun impedantie ongeveer 300 kilo ohm is bij één kilohertz. Verbind nu de kanalen van de tweede elektrode-adapter met de master-elektrode en soldeer de referentie- en spierelektroden aan de basis van de master-elektroden.
Monteer tenslotte de master-elektrode op de interfacekaart van de hoofdfase. Bevestig de tweede elektrode op een afzonderlijke adapter nadat de honingbij is afgekoeld tot het is geïmmobiliseerd. Bevestig vervolgens de bij in een standaard plexiglashouder met de kop blootgesteld.
Breng verwarmde tandheelkundig wasplak aan op de basis van de ogen en de verbinding tussen het hoofd en de thorax, waardoor het hoofd wordt bevestigd. Ga door met het gebruik van de was om de scape-oog van de antennes op de hoofdkap te immobiliseren. Vermijd het aanbrengen van was op de fagel, die naar voren moet wijzen.
De Pro Bois moet vrij zijn van aantasting. Controleer of het kan bewegen. Scheer nu de hoofdkap om de toegankelijkheid te verbeteren.
Voer vervolgens de bij alle 30% sucrose die het zal consumeren. Dit zorgt voor een goede voorbereiding, levensvatbaarheid en weefselvochtigheid. Gebruik nu een micro-scalpel om verticaal langs de oogrand en horizontaal boven de antennebases te snijden.
Ga door met snijden onder het O-cellig oog en verwijder losse cuticula. De hypo faryngeale klieren moeten worden opzij gezet, net als de trachea. Dit zal de weg vrijmaken voor het inbrengen van de elektrode.
Begin met het inbrengen van de referentie-elektrode, een 35 micron zilverdraad. Maak eerst een kleine snede in het ipsilaterale samengestelde oog. Steek vervolgens de elektrode erdoorheen.
Plaats vervolgens de tweede draad in het spierprojectiegebied onder het laterale O-cellig oog. Om de posities van de elektroden later te visualiseren, dompelt u de elektroden drie minuten in een oplossing van 0,5 molair kaliumchloride en 5% Alexa Hydrocyte 4 88. Gebruik vervolgens micromanipulatoren om de twee elektroden in de hersenen te plaatsen.
Orienteer uzelf door de antennelob en de verticale lob van de paddenstoel te identificeren. Hier is één elektrode in de laterale antenne
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor simultane extracellulaire langetermijnregistraties uit twee verschillende hersenneuropielen bij honingbijen. De techniek maakt het mogelijk om neuronale verwerking in verschillende hersengebieden te onderzoeken, zowel op het niveau van individuele neuronen als op ensemble-niveau, in dieren met natuurlijk gedrag.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Gedragsbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de olfactorische verwerking bij honingbijen is cruciaal voor inzichten in geheugenvorming.
- Eerdere methoden boden onvoldoende mogelijkheden voor gelijktijdige registraties uit meerdere hersengebieden.
- Honingbijen dienen als modelorganisme voor het bestuderen van complexe neurale netwerken.
- Het onderzoeken van geurcoderingsmechanismen kan ons begrip van sensorische verwerking verbeteren.
Doel van de studie
- Het bestuderen van geurcodering en geheugenvorming bij honingbijen.
- Het ontwikkelen van een techniek voor gelijktijdige registraties van verschillende neuronale verwerkingsfasen.
- Het begrijpen van de relaties in geurcodering tussen neuronpopulaties.
Gebruikte methoden
- Assemblage van goedkope multikanaalelektroden uit geïsoleerde koperen microdraden.
- Voorbereiding van honingbijen voor de insertie van elektroden door het verwijderen van een sectie van de kopcapsule.
- Registratie van neuronale activiteit tijdens stimulatie met bloemengeuren en feromonen.
- Visualisatie van de neuronale architectuur via fluorescente tracers en 3D-reconstructie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle gelijktijdige opnames van de antennelobus en het paddenstoellichaam.
- Verbeterd inzicht in de mechanismen van geurcodering bij honingbijen.
- Aangetoonde stabiliteit van multichannel-elektroden voor langdurige opnames.
- Inzichten verschaft in de neuronale netwerken die betrokken zijn bij olfactorische verwerking.
Conclusies
- Deze techniek maakt een dieper inzicht mogelijk in hoe honingbijen olfactorische informatie verwerken.
- Het kan worden aangepast voor gebruik in andere modelorganismen binnen de neurobiologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen belangrijke vragen over neuropathologie en sensorische verwerking beantwoorden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt gelijktijdige langetermijn extracellular opnames mogelijk van twee verschillende neuronale verwerkingsstadia in actieve honingbijen, wat een unieke mogelijkheid biedt om de temporele dynamiek in olfactorische verwerkingspaden te onderzoeken. Door multi-unit activiteit vast te leggen uit zowel de antennale lob als het paddenstoelenlichaam—of de parallelle banen die deze verbinden—kunnen onderzoekers mechanistische hypothesen over sensorische integratie en geheugenvorming toetsen. De aanpak ondersteunt het voorspellend vertrouwen in target-validatie door te onthullen hoe geur-geïnduceerde signalen in de loop van de tijd over hersengebieden propageren, wat bijdraagt aan translationele modellen van de functie van neurale circuits.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door geur-evoqueerde activiteit over opeenvolgende neuropillen te volgen, om zo de padspecifieke bijdragen aan het gedrag te verduidelijken.
- Operationele waarde: Maakt stabiele, multi-channel opnames over vele uren mogelijk, waardoor de variabiliteit in longitudinale studies naar target-engagement wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door onderscheid te maken tussen aanhoudende en transiënte neuronale responsen, wat inzicht geeft in target-selectiviteit en functionele relevantie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare, tijdopgeloste neurofysiologische output die kan dienen als biomarker voor de effecten van verbindingen op de olfactorische verwerking.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van differentieel versterkte microdraadelektroden om ruis te minimaliseren en de signaalbron te verifiëren, wat de reproduceerbaarheid van de assay verbetert.
- Schaalbaarheid: De assemblage van elektroden uit geïsoleerde koperdraden maakt een kosteneffectieve, reproduceerbare voorbereiding mogelijk voor screening onder meerdere condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt vroege sensorische verwerking in de antennale lob met integratie van hogere orde in het mushroom body, wat de transformatie van perceptie naar geheugen modelleert.
- Predictieve betrouwbaarheid: Onthult temporele dissociatie in geurreacties tussen neuronpopulaties, wat de uitlijning van biomarkers voor cognitieve of sensorisch-modulerende verbindingen ondersteunt.
- Ziekterellevant systeem: Biedt een genetisch hanteerbaar ongewervelde model om geconserveerde principes van sensorische gating en adaptieve filtering te bestuderen.
Pipeline- & workflowintegratie
De techniek past binnen het ontdekkingscontinuüm door hypothese-gestuurde ondervraging van de dynamiek van neurale circuits mogelijk te maken, lead-identificatie te ondersteunen via functionele read-outs van target-engagement, en preklinische beslissingen te informeren via mechanische risicoreductie van sensorische verwerkingspaden.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door de activiteit in de antennallobus (vroege verwerking) en het mushroom body (integratiecentrum) tijdens geurstimulatie te vergelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, multi-unit extracellulaire opnames die vergelijking van de effecten van verbindingen over onafhankelijke neurale banen mogelijk maken.
- Analytics: Maakt gebruik van spike sorting, template matching en principale componentenanalyse om single-spike events en dynamiek op populatieniveau te ontrafelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt directe geurresponsen met langetermijn neurale plasticiteit, wat relevant is voor het modelleren van leer- en geheugenprocessen.
- Enterprise Reuse: Het elektrodeontwerp is aanpasbaar voor verschillende modelorganismen en hersengebieden, wat standaardisatie op platformniveau bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door te onthullen hoe geuridentiteit en timing worden gerepresenteerd over opeenvolgende verwerkingsfasen.
- Operationele waarde: De flexibiliteit van de elektroden maakt stabiele opnames in actieve dieren gedurende uren tot dagen mogelijk, wat de dataopbrengst verhoogt en uitval vermindert.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door direct bewijs te leveren van target-modulatie in vivo, waardoor de afhankelijkheid van surrogaat-eindpunten afneemt.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van hun effecten op de getrouwheid van de temporele codering in sensorische paden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de anatomie van het honingbijenbrein en microsurgische technieken voor de preparatie van de hoofdkapsule en het targeten van elektroden.
- Is afhankelijk van micromanipulatie-instrumenten, fluorescerende tracers en spike-sorting software voor signaalvalidatie en 3D-reconstructie.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor het testen van de elektrode-impedantie (~300 kΩ bij 1 kHz) en de plaatsing van de referentie-elektrode.
- Aanpassing aan andere modelsystemen vereist wijzigingen in de grootte van de elektrode, de insertiediepte en de methoden voor hersenstabilisatie.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van uitgebreide training om neurale banen te identificeren via anatomische oriëntatiepunten en de invasiviteit van chronische implantatie.
