Gelijktijdige Langdurige Recordings op Twee Neuronale Processing Fasen in Behaving Honingbijen
July 21st, 2014
Gelijktijdige extracellulaire langdurige opnames van twee verschillende hersengebieden neuropiles of twee verschillende anatomische traktaten werden opgericht in honingbijen. Deze opnamen kan de onderzoek temporele aspecten van neuronale verwerking in verschillende hersengebieden in het neuron en op het ensemble niveau in een dier gedragen.
Het algemene doel van deze procedure is om reukbekleding en geheugenvorming te bestuderen met behulp van langdurige toegang tot twee onafhankelijke neuronale verwerkingsstadia binnen gedragende honingbijen. Dit wordt bereikt door eerst goedkope multi-kanaals elektroden samen te stellen uit geïsoleerde kopermicrodraden en op maat gemaakte houders. De volgende stap is om een levende honingbij voor te bereiden door een deel van zijn hoofdkap te verwijderen om twee met een fluorescerende kleurstof behandelde elektroden in de blootgestelde hersenen te plaatsen.
De derde stap is om op te nemen van de twee onafhankelijke neuro pillen of tractus in de reukroute, terwijl geprikkeld met bloemengeuren en feromonen. Later, na het dissecteren van de hersenen, wordt een andere fluorescerende tracer in de antennelob geïnjecteerd om de doelneuronen terug te vullen. De terug gevulde sporen en de elektrode-sporen worden vervolgens gevisualiseerd om een driedimensionale reconstructie van de neuronale architectuur te produceren.
Uiteindelijk kunnen relaties in reukbekleding tussen de twee neuronpopulaties op verschillende verwerkingsniveaus zoals de antennelob en de paddenstoel worden beter begrepen met behulp van deze technieken. Dus de belangrijkste voordelen van deze techniek van bestaande methoden is dat onze multikanaals elektroden erg klein zijn en in combinatie kunnen worden gebruikt, wat betekent dat we tegelijkertijd op verschillende gebieden van de hersenen kunnen opnemen nadat ze zijn verankerd. De flexibele draden maken een stabiel herinneren gedurende meerdere uren mogelijk bij gedragende dieren.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van neuropathologie, zoals het begrijpen hoe dieren reuken ontvangen, waarnemen en uiteindelijk berekenen in het leven uit hun omgeving. Deze dubbele opnametechniek kan inzicht geven in de onderliggende mechanismen van reukcodering en neuronale netwerken in het algemeen. Het kan ook worden toegepast op andere modelorganismen in de ongewervelde of affectieve en neurobiologie.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat er veel training nodig is om honingbijneuronen te identificeren met behulp van alleen morfologische kenmerken zoals de interne lob of de verticale lob van de paddenstoel. Voor dit protocol, bouw een elektrode-adapter om past op een standaard elektrode-interfacebord. Soldeer eerst drie korte stukken geïsoleerde draden op een 18-pins connector.
Snij vervolgens een stuk plexiglasplaat en steek een ondiepe groef langs de langste kant. Schroef vervolgens soldeermoffen in de plexiglasplaat en lijm de plaat op de bovenkant van de connector. Verbind vervolgens de basis met de moffen met behulp van de drie korte draden.
Plaats vervolgens een glazen capillair in de groef van de plexiglasplaat. Het capillair moet kunnen glijden en worden vastgezet door een schroef. Gebruik een minutian-pin om het glazen capillair ongeveer vijf millimeter naar buiten te strekken. Het capillair en de pin worden gebruikt om de elektrode microdraden te ondersteunen en te stabiliseren.
Plaats vervolgens drie microdraden. Met behulp van plakband voor betere toegang kan het glazen capillair worden verwijderd met behulp van een 12 volt soldeer naald lijm. De draden samen met LMP tandheelkundig wasplak niet de laatste derde van de draden.
Verbind nu deze multikanaals microdraadassemblage met de elektrode-adapter. Plaats de verlengde glazen capillair parallel aan de microdraden. Beveilig deze bevestiging met tandheelkundig wasplak langs de overlappende glazen capillair en de minutian-pin.
Knip vervolgens de elektrodedraden af en laat twee tot drie centimeter uitsteken vanaf de minutian-pin en twee tot drie centimeter uitsteken vanaf het elektrode-uiteinde. Bevestig vervolgens de capillair in de elektrode-adapter en gebruik een schroef om alles op zijn plaats te stabiliseren. Bij 360 graden Celsius.
Soldeer de uiteinden van de draden loodrecht op de moffen. Controleer vervolgens of er een voldoende sterke elektrische verbinding is door te controleren of hun impedantie ongeveer 300 kilo ohm is bij één kilohertz. Verbind nu de kanalen van de tweede elektrode-adapter met de master-elektrode en soldeer de referentie- en spierelektroden aan de basis van de master-elektroden.
Monteer tenslotte de master-elektrode op de interfacekaart van de hoofdfase. Bevestig de tweede elektrode op een afzonderlijke adapter nadat de honingbij is afgekoeld tot het is geïmmobiliseerd. Bevestig vervolgens de bij in een standaard plexiglashouder met de kop blootgesteld.
Breng verwarmde tandheelkundig wasplak aan op de basis van de ogen en de verbinding tussen het hoofd en de thorax, waardoor het hoofd wordt bevestigd. Ga door met het gebruik van de was om de scape-oog van de antennes op de hoofdkap te immobiliseren. Vermijd het aanbrengen van was op de fagel, die naar voren moet wijzen.
De Pro Bois moet vrij zijn van aantasting. Controleer of het kan bewegen. Scheer nu de hoofdkap om de toegankelijkheid te verbeteren.
Voer vervolgens de bij alle 30% sucrose die het zal consumeren. Dit zorgt voor een goede voorbereiding, levensvatbaarheid en weefselvochtigheid. Gebruik nu een micro-scalpel om verticaal langs de oogrand en horizontaal boven de antennebases te snijden.
Ga door met snijden onder het O-cellig oog en verwijder losse cuticula. De hypo faryngeale klieren moeten worden opzij gezet, net als de trachea. Dit zal de weg vrijmaken voor het inbrengen van de elektrode.
Begin met het inbrengen van de referentie-elektrode, een 35 micron zilverdraad. Maak eerst een kleine snede in het ipsilaterale samengestelde oog. Steek vervolgens de elektrode erdoorheen.
Plaats vervolgens de tweede draad in het spierprojectiegebied onder het laterale O-cellig oog. Om de posities van de elektroden later te visualiseren, dompelt u de elektroden drie minuten in een oplossing van 0,5 molair kaliumchloride en 5% Alexa Hydrocyte 4 88. Gebruik vervolgens micromanipulatoren om de twee elektroden in de hersenen te plaatsen.
Orienteer uzelf door de antennelob en de verticale lob van de paddenstoel te identificeren. Hier is één elektrode in de laterale antenne
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor gelijktijdige extracellulaire lange-termijn opnames van twee verschillende hersenneuropiles in honingbijen. De techniek maakt de onderzoeking van neuronale verwerking mogelijk over verschillende hersengebieden op zowel enkele neuron- als ensembleniveaus bij zich gedragen dieren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Gedragsbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van reukverwerking in honingbijen is cruciaal voor inzichten in geheugenvorming.
- Vorige methoden misten de mogelijkheid voor gelijktijdige opnames uit meerdere hersengebieden.
- Honingbijen dienen als modelorganisme voor het bestuderen van complexe neuronale netwerken.
- Het onderzoeken van reukcoderingsmechanismen kan ons begrip van sensorische verwerking verbeteren.
Doel van de studie
- Om reukcoating en geheugenvorming in honingbijen te bestuderen.
- Om een techniek te ontwikkelen voor gelijktijdige opnames uit verschillende neuronale verwerkingsstadia.
- Om relaties in reukcodering tussen neuronpopulaties te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Assemblage van goedkope multi-kanaals elektroden uit geïsoleerde koper microdraden.
- Voorbereiding van honingbijen voor elektrode-invoering door het verwijderen van een sectie van de hoofdcapsule.
- Opnemen van neuronale activiteit tijdens stimulatie met bloemengeuren en feromonen.
- Visualisatie van neuronale architectuur door middel van fluorescente tracers en 3D reconstructie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle gelijktijdige opnames van de antennelob en het champignonlichaampje.
- Verbeterd begrip van reukcoderingsmechanismen in honingbijen.
- Gedemonstreerde stabiliteit van multi-kanaals elektroden voor uitgebreide opnames.
- Inzichten geboden in de neuronale netwerken betrokken bij reukverwerking.
Conclusies
- Deze techniek stelt een dieper begrip mogelijk van hoe honingbijen reukinformatie verwerken.
- Het kan worden aangepast voor gebruik in andere modelorganismen in de neurobiologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen sleutelvragen in neuropathologie en sensorische verwerking aanpakken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous long-term extracellular recordings from two distinct neuronal processing stages in behaving honeybees, providing a unique capability to investigate temporal dynamics in olfactory processing pathways. By capturing multi-unit activity from both the antennal lobe and mushroom body—or parallel tracts connecting them—researchers can de-risk mechanistic hypotheses about sensory integration and memory formation. The approach supports predictive confidence in target validation by revealing how odor-evoked signals propagate across brain regions over time, informing translational models of neural circuit function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking odor-evoked activity across sequential neuropils to clarify pathway-specific contributions to behavior.
- Operational Value: Provides stable, multi-channel recordings over many hours, reducing variability in longitudinal target engagement studies.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing sustained versus transient neuronal responses, informing target selectivity and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, time-resolved neurophysiological outputs that can serve as biomarkers for compound effects on olfactory processing.
- Operational Value: Uses differentially amplified micro-wire electrodes to minimize noise and verify signal origin, enhancing assay reproducibility.
- Scalability: Electrode assembly from insulated copper wires allows low-cost, replicable preparation for multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early sensory processing in the antennal lobe to higher-order integration in the mushroom body, modeling perceptual-to-memory transformation.
- Predictive Confidence: Reveals temporal dissociation in odor responses between neuron populations, supporting biomarker alignment for cognitive or sensory-modulating compounds.
- Disease-Relevant System: Offers a genetically tractable invertebrate model to study conserved principles of sensory gating and adaptive filtering.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of neural circuit dynamics, supporting lead identification through functional readouts of target engagement, and informing preclinical decisions via mechanistic de-risking of sensory processing pathways.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by comparing activity in antennal lobe (early processing) and mushroom body (integration center) during odor stimulation.
- Screening: Delivers reproducible, multi-unit extracellular recordings that allow comparison of compound effects across independent neuronal tracts.
- Analytics: Employs spike sorting, template matching, and principal component analysis to resolve single-spike events and population-level dynamics.
- Translational Research: Connects immediate odor responses to longer-term neuronal plasticity, relevant for modeling learning and memory processes.
- Enterprise Reuse: Electrode design is adaptable across model organisms and brain regions, promoting platform-level standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing how odor identity and timing are represented across sequential processing stages.
- Operational Value: Electrode flexibility enables stable recordings in behaving animals for hours to days, improving data yield and reducing attrition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation in vivo, decreasing reliance on surrogate endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on temporal coding fidelity in sensory pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in honeybee brain anatomy and microsurgical techniques for head capsule preparation and electrode targeting.
- Depends on micro-manipulation tools, fluorescent tracers, and spike sorting software for signal validation and 3D reconstruction.
- Necessitates standardization across teams for electrode impedance testing (~300 kΩ at 1 kHz) and reference electrode placement.
- Adaptation to other model systems requires adjustment of electrode size, insertion depth, and brain stabilization methods.
- Practical limitations include the need for extensive training to identify neuronal tracts via anatomical landmarks and the invasiveness of chronic implantation.
