Live-Imaging van Drosophila Larvale neuroblasts
July 7th, 2014
Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.
Het algemene doel van deze procedure is om de dissectie van het intacte centrale zenuwstelsel van de derde instar oph-larven te detailleren. Om asymmetrische stamceldeling, cellulaire differentiatie en morfogenese te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst het centrale zenuwstelsel uit het larvale lichaam te explanteren door grove dissectie.
De tweede stap is om het intacte brein te isoleren van de perifere weefsels door fijne microdissectie met behulp van op maat gemaakte hulpmiddelen. Vervolgens worden de gezonde hersenen ofwel gemonteerd voor live celbeeldvorming of onderworpen aan chemische fixatie en immunofluorescentie, uiteindelijk wordt spinning disc confocale microscopie gebruikt om de gebeurtenissen die de neurale stamceldeling regelen te tonen en mechanistische inzicht te geven in de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van stamcellen, kanker en neurale ontwikkeling.
Door bij te dragen aan ons begrip van hoe stamcelproliferatie wordt gereguleerd, weten we dat ABER-stamceldeling geassocieerd is met tumorgenese en microcefalie, en onze beeldvormingsstudies onthullen de mechanismen die deze stamceldelingen reguleren. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de microdissectie en montage van de hersenen moeilijk te leren zijn omdat ze vaste handen, geduld en oefening vereisen. Begin deze procedure door twee druppels warme dissectiemedia op een enkele glazen plaat te plaatsen, een voor grove dissectie en de andere voor fijne dissectie.
Breng vervolgens verschillende larven over naar een van de mediadruppels. Breng daarna de glazen plaat met larven over naar een dissectiemicroscoop. Zoom nu in op de druppel met de larven zodat de voorste en achterste uiteinden van de larven zichtbaar zijn.
Grijp het middelste gebied van een enkele larve met een paar pincetten en grijpt een ander gebied direct naast het met een tweede paar pincetten. Scheur vervolgens de larve in tweeën. Herhaal de procedures voor alle larven op de dekplaat, glijd en gooi de achterste helften weg.
Zoom in op een larve zodat de voorste mondhaken duidelijk zichtbaar zijn. Maak daarna een kleine insnijding of inkeping aan de tegenoverliggende kant van de mondhaken van de larve tussen de derde thoracale en de eerste abdominale CLE-banden. Grijp vervolgens de mondhaken met de pincetten.
Schil voorzichtig de cuticula in de richting van voor naar achter weg en ga door totdat het centrale zenuwstelsel zichtbaar is. Scheur vervolgens de weefsels om het centrale zenuwstelsel van de rest van de larve te isoleren. Zorg ervoor dat het centrale zenuwstelsel niet wordt beschadigd en gooi beschadigde monsters weg met een gescheurde ventrale zenuwstreng of vervormde optische lobben.
Herhaal de procedures voor alle larven op de dekplaat. Breng vervolgens het gezonde explantaatweefsel over naar het andere schone medium. Laat het op de dekplaat vallen voor fijne dissectie.
Gebruik de dissectiepennen om de perifere weefsels van de hersenen te verwijderen. Schuif het scalpel tussen de hersenen en het ongewenste weefsel en speld het bindweefsel vast aan de glazen plaat. Gebruik de haak om voorzichtig het ongewenste weefsel weg te trekken terwijl je tegelijkertijd het scalpel in slingerbewegingen op de dekplaat drukt.
Werk langzaam en bewust om alle schijven uit elke hersenen te verwijderen. Wees voorzichtig om de hersenmorfologie niet te verstoren. Een gezonde hersenen zullen een intacte ventrale zenuwstreng en symmetrische ronde optische lobben hebben.
Keer nu een gasdoorlatende kweekschaal van 50 millimeter met een doorzichtige film naar boven en deponeer een kleine druppel medium in het midden van de schaal. Gebruik vervolgens een haak om de hersenen onder de optische lobben op te scheppen en breng ze een voor een over naar de druppel medium op de schaal. Verzamel vijf tot tien hersenen in de druppel medium.
Duwt ze vervolgens een voor een naar de bodem, omdat er daarna veel van op het meniscus zullen worden gevangen. Orienteer de hersenen zodat de neuroblast kan worden geïmager om de voorste ventrale neuroblast te beeld. Plaats de hersenen met de ventrale zenuwstreng naar boven en align de hersenen zodat alle ventrale zenuwstrengen in dezelfde richting binnen het XY-vlak wijzen.
Gebruik een spuit of plastic overdrachtspipet om vier halo koolstofoliedruppels op de gasdoorlatende membraan te plaatsen. Het volume van elke druppel olie moet gelijk zijn aan elkaar en aan de druppel medium. Eenmaal voltooid, zullen de vijf druppels lijken op de vijf facetten op westerse stijl dobbelstenen.
Laat vervolgens een dekplaat op de assemblage zakken zodat deze alle vijf de druppels tegelijkertijd raakt. Het handhaven van een gelijkmatige druk over de monsters vermindert de kans dat ze worden verstoord. Wacht ongeveer drie minuten.
Terwijl het olie en medium zich verspreiden onder het gewicht van de dekplaat onder een dissectiemicroscoop. Laat de dekplaat verder zakken op het oppervlak van de hersenen door overtollig medium te verwijderen met een papieren doek tot de dekplaat raakt, de hersenen mogen niet te veel wikkelen omdat dit weefselvervorming of hersenexplosie zal veroorzaken om de anterial ventrale neuroblast te beeld. De dekplaat moet lichtjes worden bewogen in de richting van de uiteinden van de ventrale zenuwstreng.
Dit zorgt ervoor dat de hersenen draaien, wat de hersenlobben in direct contact met de dekplaat brengt om beeldvorming te vergemakkelijken, verzegeld vervolgens de kamer door enc. De dekplaat met een kleine hoeveelheid halo koolstofolië. Overtollig olie dat uit de dekplaat sijpelt, moet worden geminimaliseerd en weggeblus met een papieren doek.
Voorafgaand aan beeldvorming. Voeg een druppel immersie-olie toe aan de dekplaat net boven de gemonteerde hersenen om het objectief direct boven het monster te centrumeren. Plaats voorzichtig het gemonteerde monster in de 25 graden Celsius-fase-incubator en dek de kamer af met het deksel.
Loceer vervolgens de centrale hersenneuroblast met behulp van door
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een gestroomlijnde methode voor het uitvoeren van live celbeeldvorming in een intact larvenbrein, met focus op asymmetrische neurale stamceldeling en neurogene processen.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Asymmetrische stamceldelingen zijn cruciaal voor het begrijpen van neurale ontwikkeling.
- Live celbeeldvorming biedt inzichten in cellulaire differentiatie en morfogenese.
- De intacte CNS dissectie uit larven maakt gedetailleerde observatie mogelijk.
- Deze methode kan sleutelvraagstukken in stamcel- en neurale ontwikkelingsonderzoek aanpakken.
Doel van de Studie
- Om de dissectie van het intacte CNS uit derde instar larven te detailleren.
- Om asymmetrische stamceldelingen en hun implicaties in neurale ontwikkeling te bestuderen.
- Om live celbeeldvorming te gebruiken voor het observeren van het gedrag van neurale stamcellen.
Gebruikte Methoden
- Grote dissectie om het CNS uit het larvenlichaam te extraheren.
- Fijne microdissectie om de intacte hersenen te isoleren.
- Bevestiging van hersenen voor live celbeeldvorming of chemische fixatie.
- Spinning disc confocale microscopie om neurale stamceldelingen te visualiseren.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van intacte larvenhersenen voor beeldvorming.
- Identificatie van mechanismen die neurale stamceldelingen beheersen.
- Inzichten in CNS ontwikkelingsprocessen.
- Potentiële toepassingen in stamcel- en kankeronderzoek.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van neurale ontwikkeling.
- Live celbeeldvorming onthult eerder over het hoofd geziene mechanismen.
- Deze methode kan het begrip van stamcelgedrag in het CNS verbeteren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Live imaging of Drosophila larval neuroblasts enables mechanistic de-risking of asymmetric stem cell division pathways relevant to oncology and neurodevelopment. This model supports target validation by providing quantitative, real-time readouts of stem cell behavior in a genetically tractable system. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular phenotypes to disease-relevant mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses governing stem cell self-renewal and differentiation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of division symmetry and fate outcomes.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic insight into pathways associated with tumorigenesis and microcephaly.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by maintaining native neuroblast niche integrity.
- Operational Value: Enables assay standardization via reproducible brain explantation and mounting procedures.
- Scalability: Supports platform reuse for longitudinal imaging of multiple cell cycles under controlled conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling human stem cell dysregulation in cancer and developmental disorders.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation via live and fixed imaging modalities.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying mitotic duration and division fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing and pathway clarification in stem cell biology, supporting lead identification through phenotypic screening of neuroblast behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of asymmetric division mechanisms and functional target validation in neural stem cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized explantation and quantitative mitotic timing readouts.
- Analytics: Generates Z-stacked time-lapse data and centrosome/spindle pole measurements for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant modeling of stem cell proliferation in tumorigenesis contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal stem cell dynamics across genetic and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of asymmetric division outcomes.
- Operational Value: Standardization and reproducibility in CNS dissection and live mounting procedures.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in stem cell pathway modulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative neuroblast division fidelity and cycle timing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila neuroanatomy and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on gas-permeable culture dishes, halo carbon oil, and spinning disc confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of brain orientation and ventral nerve cord alignment for consistent imaging.
- Involves adaptation considerations when translating to fixed analysis or alternative genetic backgrounds.
- Limited by phototoxicity risks requiring controlled light exposure during longitudinal imaging sessions.
