Name: Live-Imaging van Drosophila Larvale neuroblasts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Leer live-imaging van Drosophila larvale neuroblasten voor het bestuderen van asymmetrische stamceldelingen en neurale ontwikkeling. Deze methode biedt inzicht in CNS-morfogenese en stamcelgedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de verdeling van de intramurale onderzoek aan de National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) en een Lenfant Biomedische Postdoctoraal Fellowship toegekend aan DAL.

1. Voorbereiding van de Benodigde aan derde Instar Larvale Brains Explanteer <ol><li> Bereid je gereedschap nodig voor microdissection. <ol><li> Smeden twee ontleden gereedschap (een scalpel en een haak) door eerst een dissectie pin in elke pin houder. Beveilig de pennen stevig met de hand of met een tang (figuur 1C). </li><li> Gebruik een paar oude tang om een ​​ontleden pin buigen tot een ongeveer 120 ° hoek. Doe dit onder een dissectie microscoop om ervoor te zorgen dat de bovenste helft van de pen plat wanneer de pen houder wordt gehouden in de hand. Deze tool zal gebruikt worden als een scalpel ingedrukt te houden of snijden door weefsel. </li><li> Gebruik een paar oude tang om de tweede pen te buigen in een hoek, dat zal worden gebruikt om vast te houden en weg te schrapen weefsel. </li><li> Bedek elk ontleden tool met een pipet tip om de instrumenten te beschermen tegen schade. Met zorg, kan goed gevormde gereedschappen gebruikt worden voor dissectie voor onbepaalde tijd. Vervang beschadigde of vervormde pinnen als dat nodig is. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Bereid ontleden medium. <ol><li> In een weefselkweek kap, verdunnen het antibioticum-antimycoticum supplement in de Schneider kweekmedium. Swirl de media om het supplement te nemen. </li><li> Bereid een aantal 5 ml porties van het aangevulde media. Bewaar alle media bij 4 ° C tot klaar voor gebruik. </li><li> Verwarm een ​​5 ml van medium aangevuld tot kamertemperatuur. Teken het medium in een steriele 5 ml spuit en schroef op een steriele 0,2 um spuitfilter. </li></ol></li><li> Selecteer larven voor dissectie. Gebruik een ontleden sonde naar larven kruipen derde instar selecteren als het brein makkelijkste zal zijn te ontleden. Optioneel: storting larven op een druif agar plaat. Opmerking: Gebruik geen overdreven druk flesjes of flessen met &quot;nat voer,&quot; omdat deze de neiging om larven eerste of tweede instar dwingen om voortijdig kruipen. Opmerking: Sommige genetische achtergronden zal het nodig zijn het gebruik van jongere larven. Dit heeft geen invloed op het protocol, maar maakt de dissection moeilijker. </li></ol> 2. Ontrafeling van het centrale zenuwstelsel <ol><li> Op een glasplaatje, maakt u twee 50 ml zwembaden van warm ontleden media gescheiden door ongeveer 3 cm. Een zwembad zal worden gebruikt voor grove dissectie en andere gebruikt voor fijne dissectie (figuur 1C). </li><li> Transfer verscheidene larven een van de media druppels. </li><li> Verplaats de dekglaasje met larven tot een dissectie microscoop. Zoom in op het zwembad met de larven zodanig dat de voorste en achterste uiteinden van de larven zijn waarneembaar. </li><li> Gebruik een paar tang om het midden-gebied van een enkele larve begrijpen. Neem een ​​tweede pincet in de andere hand en pak de larve in de buurt van dezelfde regio. Trek de twee paar tang uit elkaar om voorzichtig scheuren de larve in de helft. Herhaal de bovenstaande twee stappen voor alle larven op het dekglaasje. </li><li> Gooi de achterste helften van het larvale lichaam door ze op een tissue. </li><li> Zoom in op een larve zo dat ee anterior mouthhooks zijn duidelijk zichtbaar. Gebruik beide paren tang om een ​​kleine incisie, of inkeping, aan weerszijden van de larvale mouthhooks tussen de derde thoracale en eerste voorste denticle bands maken. </li><li> Pak de mouthhooks met de tang in de niet-dominante hand. Gebruik de tang in de andere hand voorzichtig afpellen cuticula per anterior naar posterior richting. Blijf langzaam afpellen cuticula totdat het centrale zenuwstelsel wordt blootgesteld. </li><li> Isoleer het centrale zenuwstelsel van de rest van de larven door scheuren weefsels met de tang. Wees voorzichtig met het centrale zenuwstelsel niet te verstoren. Kritische stap: Trek niet op het centrale zenuwstelsel! Gooi beschadigde monsters met een gescheurde buikzenuwkoord (Figuur 2A) of vervormde optische kwabben (figuren 2B en 2B). </li><li> Herhaal de bovenstaande twee stappen voor alle larven op het dekglaasje. Breng de gezonde geëxplanteerde weefsel detweede (schoon) zwembad van medium op het dekglaasje voor de fijne dissectie podium. </li><li> Gebruik het ontleden pin gereedschap op te ruimen de perifere weefsels (bijv. oog, vleugel, en been schijven) van de hersenen. Schuif de scalpel tussen de wilde (hersenen) en de ongewenste weefsel, pinning het bindweefsel aan de dekglaasje. Gebruik de haak om voorzichtig te plagen de ongewenste weefsel weg terwijl tegelijkertijd op de scalpel aan de dekglaasje in zaag-achtige bewegingen. </li><li> Kritische stap: werken langzaam en bewust om alle schijven uit elk hersenen te verwijderen. Wees voorzichtig de hersenen morfologie niet te verstoren. Een gezonde hersenen zullen een intacte buikzenuwkoord en symmetrische, ronde optische kwabben (figuur 2C) hebben. </li></ol> 3. Montage Geëxplanteerde Brains voor Live Imaging <ol><li> Zwenken 50 mm gasdoorlaatbare cultuur schotel met de transparante folie naar boven (figuur 2D). Druk de spuit een kleine daling (ongeveer 30 pl) van medium op t stortenhij midden van de schaal. </li><li> Breng de geïsoleerde hersenen, een voor een, de daling drager op de schotel. Gebruik de haak hulpmiddel opscheppen een brein onder de optische lobben. Of gebruik een tang om axonen projecteren van de buikzenuwkoord begrijpen. </li><li> Verzamel 5-10 hersenen in de druppel medium. Dompel de hersenen door het ontleden pin tools waarmee individuele hersenen duwen naar de onderkant van de druppel drager veel daarvan wordt opgesloten in de meniscus (figuur 2E). </li><li> Richt de hersenen met behulp van het ontleden pin hulpmiddelen om hersenen te lijnen, afhankelijk van de AI&#39;s af te beelden (figuur 3A). Om het imago van de dorsale AI&#39;s, plaatst de buikzenuwkoord naar beneden (langs het membraan). Om het beeld Voorwandinfarct-ventrale AI&#39;s, plaats de hersenen met de buikzenuwkoord naar boven (weg van membraan). Lijn de hersenen zodanig dat alle de ventrale zenuw snoeren wijzen in dezelfde richting binnen het xy-vlak. </li><li> Gebruik een spuit of plastic overdracht pipette tot 4 halocarbon (HC) oliedruppels (ongeveer 30 pi elk) plaatsen op de gas-permeabel membraan. Het volume van elke druppel olie moet gelijk zijn aan elkaar en de drop drager zijn. Ruimte de druppels olie te corresponderen met de vier hoeken van een dekglaasje gecentreerd rond de druppel kweekmedium. Eenmaal voltooid, zal de vijf druppels (vier druppels olie en een druppel medium in het midden) lijken op de vijf facetten van de West-stijl dobbelstenen (Figuur 3B). </li><li> Laat een # 1,5 22 mm dekglaasje op het samenstel zodanig dat raakt alle 5 druppels tegelijk. Het handhaven van een gelijkmatige druk over de monsters vermindert de kans dat ze zullen worden verstoord. Wacht ongeveer 3 minuten de olie en medium te dispergeren onder het gewicht van het dekglaasje. Een cross-achtige vorm van media zal vormen (figuren 3C en 3D). </li><li> Kritische stap: Laat de dekglaasje op het oppervlak van de hersenen door het verwijderen van overtollige media met behulp van een tissue lont (Figure 3C). Doe dit tijdens het kijken naar het monster onder het ontleden scope. Zoals media wordt verwijderd, zal het dekglaasje verlagen. Stoppen zodra het dekglaasje raakt de hersenen. Niet over-lont als dit weefsel vervorming of hersenen explosies veroorzaken. </li><li> Als beeldvorming dorsale AI&#39;s (figuur 3E), ga dan naar stap 3.9. Als beeldvorming Voorwandinfarct-ventrale NBS moet het dekglaasje enigszins verplaatst (door zachtjes duwen met tang) in de richting van de buikzenuwkoord tips. Hierdoor wordt de hersenen te draaien, waardoor de hersenen lobben in direct contact met het dekglaasje brengt beeldvorming (figuur 3F) vergemakkelijken. </li><li> Dicht de kamer door rondom de dekglaasje met kleine hoeveelheden Halocarbonolie (Figuur 3D). Overtollige olie lekt uit het dekglaasje moet worden geminimaliseerd en weg gedept met een tissue. </li></ol> 4. Live-Imaging van Central Brain neuroblasts Opmerking: Voor dit werk, een Nikon Eclipse Ti spinning-diskconfocale microscoop (omgekeerde microscoop) werd gebruikt voor live beeldvorming; details van onze setup zijn eerder gepubliceerd 31. Als alternatief kan het monster worden afgebeeld met een opstaande systeem. <ol><li> Voeg een druppel immersie olie op het dekglaasje geplaatst net boven de hersenen. Dit zal helpen centreren de doelstelling direct boven het monster. </li><li> Kritische stappen: aanvullen hersenen bij een constante temperatuur van 25 ° C met een verdieping incubator. Zachtjes plaats de gemonteerde monster in het stadium incubator en bedek de kamer met het deksel. </li><li> Zoek centrale hersenen AI&#39;s met doorvallend licht door te focussen op de grote, ronde cellen die in de centrale en mediale gebieden van de optische lobben verblijven; heb epi-fluorescentie niet gebruiken. Dit wordt gemakkelijker met de praktijk. Het is zeer belangrijk om het monster bloot te stellen aan het minste licht mogelijk. Verspil geen tijd imaging hersenen die beschadigd zijn. </li><li> Eenmaal op zijn plaats, neem snel vorderingen met behulp van de confocale aanbepalen juiste locatie en diepte. Beperk diepte aan de eerste 10-15 micrometer. Passen indien nodig, en een ander beeld test. <ol><li> Optionele stap: Verzamel een test filmpje van de buikzenuwkoord te zorgen dat er geen xy drift. Als drift wordt gedetecteerd, wacht 15-30 minuten voor de steekproef om zich te vestigen. Als de drift niet vestigen in 30 min, bereiden een nieuw monster. Bekende drift kan meestal worden teruggevoerd naar de toevoeging van overmaat olie of ongelijke grootte van oliedruppels bij de montage. </li></ol></li><li> Axiale drift (z-drift) te elimineren gebruik van een continue automatische scherpstelling apparaat dat een infrarood-LED maakt gebruik. U kunt ook handmatig de focal plane corrigeren. </li><li> Zodra een NB van belang is geïdentificeerd, gaan met beeldvorming regime. Zoals bij alle live cell imaging, de hoeveelheid laserlicht, belichtingstijd, camera binning, objectiefvergroting, tijd en / of z-stap interval moeten alle empirisch worden geoptimaliseerd voor een bepaald experiment om de vraag te beantwoorden bij de hand. Het doel is om licht dam minimaliserenleeftijd, terwijl nog steeds het verzamelen van bruikbare gegevens. Zie bespreking voor extra begeleiding. <ol><li> Beeld het gehele volume van het NB door het verzamelen 12-14 images gescheiden door 1 urn in de z-as. Pas de tijd resolutie naar een of meerdere celdelingen van dezelfde NB vangen. Als een algemene richtlijn, gebruik 10-30 sec intervallen voor enkele celcyclus beeldvorming en 1-3 min. intervallen voor meerdere celcycli. </li></ol></li><li> Kritische stap: Bevestig dat de steekproef gezond door het toezicht op de duur van de mitose. Als mitose neemt meer dan 15 min, verhuizen naar een andere hersenen. Een gezonde hersenen zullen vele AI&#39;s tonen binnen hetzelfde gezichtsveld ondergaan verschillende rondes van mitose. Merk op dat elke celcyclus is iets langer dan de vorige door lichte schade. </li><li> Zodra beeldvorming is voltooid, demonteer het incubatiekamer, en gooi alles maar de gasdoorlaatbare kweken gerechten. Spoel de cultuur schotel oppervlak met 95% ethanol en veeg goed met een tissue. Herhaal dit nog twee keer. </li&gt; </ol> 5. Voorbereiding van Brains voor immunofluorescentie <ol><li> Verzamel 20 of meer geëxplanteerde hersenen in een 1,5 ml buis met ongeveer 0,2 ml aangevuld medium. </li><li> Verwijder medium uit de buis en spoel hersenen eenmaal met 0,5 ml PBSTx (fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS, 0,3% Triton X-100). Laat hersenen naar de bodem van de buis tussen alle uitwisseling van vloeistof. De Triton X-100 detergens wordt gebruikt om het weefsel permeabilize. Spoelen meestal duurt minder dan 30 seconden; verwijder de PBSTx eenmaal hersenen hebben zich naar de bodem van de buis. </li><li> Vervang de oplossing met 0,5 ml 9% elektronenmicroscopie rang paraformaldehyd verdund in PBSTx. Incubeer met nutatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Gooi fixatief volgens afvalregelgeving gevaarlijk. </li><li> Was de monsters met 0,5 ml PBSTx gedurende 15 minuten. Herhaal de wasstap met verse PBSTx twee keer. </li><li> Vervang de oplossing met 0,5 ml PBT (PBS, 1% Runderserumalbumine (BSA) en 0,1% Tween-20). Incubeer met nutatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Deze stap blokkeert de specifieke binding van antilichaam aan het weefsel. </li><li> Vervang de oplossing met 0,5 ml primair antilichaam verdund in PBT aangevuld met 4% normaal geit serum (NGS). Incubeer met nutation overnacht bij 4 ° C. </li><li> Gooi of sla de verdunde primaire antilichaam. </li><li> Was de monsters met 0,5 ml PBT gedurende 15 minuten. Herhaal de wasstap met verse PBT twee keer. </li><li> Vervang de oplossing met 0,5 ml gemodificeerde PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20 en 4% NGS). Incubeer met nutatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Vervang de oplossing met 0,5 ml secundair antilichaam verdund in gewijzigde PBT. Incubeer met nutatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Vervang de oplossing met 0,5 ml PBST (PBS met 0,1% Tween-20). Incubeer met nutatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap met verse PBST twee keer. </li></ol><ol><li> Breng zorgvuldig de monsters als een druppel op een glasplaatje, beperkt de daling naar links van het midden van de schuif. </li><li> Voeg een grote druppel (ongeveer 2 cm diameter) van fixeermiddel (bijvoorbeeld Aqua-Poly/Mount) naar het midden van de dia. Vermijd het zwembad PBST dat is naar links. </li><li> Gebruik een tang om de hersenen te brengen van het zwembad van PBST aan de pool van montage medium. Fixeermiddel direct toevoegen bovenop de hersenen kunnen hun oriëntatie verstoren en moet worden vermeden. </li><li> Onder een lichtmicroscoop, regelen de monsters in de montage medium met de kant die zal worden afgebeeld naar boven. </li><li> Met de schuif onder de lichtmicroscoop, langzaam lager een # 1,5 glazen dekglaasje bovenop de monsters. Optionele stap: Verjagen kleine luchtbellen door licht te drukken op het dekglaasje. </li><li> Laat de montage medium polymeriseren voor enkele uren, of &#39;s nachts, door te liegen dia&#39;s plat, licht-beschermd bij kamertemperatuur. </li><li> Slides kunnen worden afgebeeld de volgende dag, of opgeslagen om beeldvorming. </li></ol>

<ol><li>Truman, J. W., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).</li>
<li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+for+identified+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells+in+the+Drosophila+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system.</a> Development. 116, 855-863 (1992).</li>
<li>Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+asymmetry+for+proper+fitness%2C+function%2C+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research%22%5BJournal%5D)">Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate.</a> Chromosome research. 21, 271-286 (2013).</li>
<li>Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+neural+stem+cell+proliferation+by+intermediate+progenitor+cells+in+Drosophila+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development.</a> Neural development. 3, 5 (2008).</li>
<li>Bowman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressors+Brat+and+Numb+regulate+transit-amplifying+neuroblast+lineages+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila.</a> Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).</li>
<li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Savoian, M. S., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+primary+cultures+of+Drosophila+melanogaster+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts.</a> Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).</li>
<li>Fleming, S. L., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flattening+Drosophila+cells+for+high-resolution+light+microscopic+studies+of+mitosis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).</li>
<li>Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Mad2+to+the+kinetochore+requires+the+Rod%2FZw10+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex.</a> Current biology. 15, 856-861 (2005).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li>
<li>Lucas, E. P., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+proper+connection+between+the+centrioles+and+the+pericentriolar+matrix+requires+Drosophila+centrosomin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin.</a> J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+amplification+can+initiate+tumorigenesis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies.</a> Cell. 133, 1032-1042 (2008).</li>
<li>Conduit, P. T., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cnn+dynamics+drive+centrosome+size+asymmetry+to+ensure+daughter+centriole+retention+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome research. 6, 533-549 (1998).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).</li>
<li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat. Commun. 2, 243 (2011).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Live+Cell+Imaging+and+Automated+4D+Analysis+of+Drosophila+Neuroblast+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells+by+transgenic+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi.</a> Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Siegrist, S. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+cues+orient+the+cell+division+axis+in+Drosophila+embryonic+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts.</a> Development. 133, 529-536 (2006).</li>
<li>Broadus, J., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+cues%2C+intrinsic+cues+and+microfilaments+regulate+asymmetric+protein+localization+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lis1%2Fdynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li>
<li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+the+model+to+the+test%3A+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity%2C+axon+outgrowth%2C+and+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li>
<li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li>
<li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia%2Fflagella+function%2C+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li>
<li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole%2C+but+is+dispensable+for+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li>
<li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li>
<li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Live cell imaging is een waardevolle benadering gebruikt om de mechanismen die ACD van stamcellen, de differentiatie van cellijnen reguleren te bestuderen, en de morfogenese van complexe weefsels. Hoewel onderzoeksgroepen verleden zijn gebruikt verschillende technieken om te visualiseren NB ACD, kunnen deze benaderingen algemeen worden ingedeeld in twee categorieën die vooral verschillen met betrekking tot de vraag of het hersenweefsel intact wordt gelaten of gescheiden. Imaging los NBs heef...

Stamcellen handhaven van een balans tussen differentiatie en zelfvernieuwing om cellulaire diversiteit te genereren tijdens de vroege ontwikkeling en beschadigde cellen in volwassen weefsels. Regulering van deze homeostase voorkomt zowel verlies en over-expansie van de stamcelpopulatie, wat kan leiden tot schadelijke weefsel degeneratie of tumorvorming. Neuroblasts (NBs) zijn uitgebreid bestudeerd neurale stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel (figuur 1A) die eerste vorm tijdens embryonale stadia 1, 2. NBs ondergaan herhaalde rondes van asymmetrische celdeling (ACD) tot twee ongelijk gedoemd cellen produceren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. ACD wordt geleid door centrosomes de niet-membraneuze organellen die fungeren als microtubuli-organiserende centra van de meeste cellen 3. Tijdens de mitose, NB centrosomes organiseren en oriënteren de bipolaire mitotische spoel langs de apicale-basale polaireteit as. Na splitsing van het verdelen van NB, apicale lot determinanten die de stamcellen lot specificeren, en basale lot determinanten die differentiatie opgeeft, worden gescheiden in de ongelijke dochtercellen. In het larvale centrale hersenen, kan twee soorten AI&#39;s worden onderscheiden door hun aantal, plaats, transcriptiefactor expressie en cellijn (Figuur 1A) 4-6. Type I NBs zijn de meest voorkomende, en ongeveer 90 van hen bevolken de voorste en achterste zijden van elk optische kwab van de hersenen 7. Deze AI&#39;s drukken de transcriptiefactor Asense (Ase), en ze karakteristiek verdelen in een zelfvernieuwende NB en een kleinere ganglion moeder cel (GMC; Figuur 1B). Elke GMC ondergaat een enkele terminal divisie twee neuronen of glia (Figuur 1B) te genereren. Daarentegen acht Type II NBs dat de achterste zijde van elke optische kwab stijging gebrek Ase expressie 5. Ze ondergaan ACDeen zelfvernieuwende NB en een tussen neurale voorlopercellen (INP) produceren. De INP beurt asymmetrisch drie tot vijf keer. Elk van deze afdelingen leidt regeneratie van de INP en de productie van een GMC 4. Gezamenlijk specifieke NB identiteit en de temporele volgorde GMC baart tot de verbazingwekkende neuronale diversiteit van de volwassen centrale zenuwstelsel. Inzicht in de celbiologie dat NB ACD ten grondslag ligt is sterk verbeterd door het gebruik van live-cell imaging technieken. Gepubliceerde protocollen gebruikt door onderzoekers op de foto voor live AI&#39;s lopen sterk uiteen. Kortom, maar deze werkwijzen kunnen worden ingedeeld in twee algemene categorieën onderscheiden door of de larvale hersenen intact wordt gelaten of mechanisch gedissocieerd. Beide technieken hebben verschillende voor-en nadelen, afhankelijk van de toepassing van de onderzoeker. Vroege rapporten een onthullende live NB cel divilingen tot op zekere mate van handmatige dissociatie van de larvale hersenen. Deze protocollen detail vegen 8 of plagen elkaar 9 van de hersenen om op korte termijn primaire culturen van de AI&#39;s op dekglaasjes groeien. Om beeldvorming te verbeteren, zijn de ronde NBs meestal afgeplat op de dekglaasjes met ofwel glasplaatjes 8 of agarose pads 9. Hoewel afgeplatte cellen optiek verbeterd, deze technieken leidt vaak tot NB mitotische afwijkingen, waaronder regressie van de splitsing groef en het onvermogen om meer dan een keer te verdelen. Daarom protocollen die zowel handmatig dissociatie en fysieke verstoring van de larvale hersenweefsel te betrekken zijn over het algemeen alleen geschikt voor zeer korte termijn (dat wil zeggen., Een celcyclus of minder) toepassingen. Ook semi-kneuzingen of volledig afvlakking intacte hersenen tussen glas dia&#39;s en dekglaasjes beperkt de tijd die men kan besteden beeldvorming van een bepaald monster aan een ongeveer 30 min. periode 10. Ondanks deze beperking, thiDe aanpak is succesvol 11-14 gebruikt. Recente inspanningen om het leven los NBs limiet fysieke verstoring van de geïsoleerde cellen. Deze technieken zijn bijzonder nuttig voor toepassingen waarbij het nodig is celculturen ondersteunen voor meerdere celdeelcycli. Bijvoorbeeld kan gedispergeerde cellen van handmatig gescheiden hersenen gedeeltelijk ingebed in een stolsel gemaakt van het mengsel van fibrinogeen en thrombine 15 voor langdurige weergave 16. Alternatief kan geëxplanteerde hersenen eerst chemisch gedissocieerd met het enzym collagenase, naast handmatig verstoord door herhaalde passage door een pipetpunt en vervolgens uitgeplaat op poly-L-lysine beklede glazen bodem schotels 17, 18 zijn. Coating glazen schalen met ofwel fibrinogeen of poly-L-lysine bevordert de hechting en geringe verspreiding van ronde cellen, waardoor ze zo dicht mogelijk bij het dekglaasje mogelijk zonder grote fysieke vervorming. In additiop, deze methodes is het kweken van de AI&#39;s in medium dat gemakkelijk kunnen worden ingewisseld voor farmacologische verstoring experimenten 18. Over het algemeen, direct plating verspreid NBs verbetert beeldvorming optiek zonder in te boeten op lange termijn imaging-mogelijkheden. Onlangs heeft een protocol waarin de langdurige kweken van gedissocieerde NBs zijn uitgewerkt 19. Deze benadering is niet zonder beperkingen. Er zijn verschillende kanttekeningen om live los NBs beeldvorming. Op een gebied van gedispergeerde cellen, bijvoorbeeld, is het moeilijk specifieke NB lijnen die ruimtelijk georganiseerd in de intacte hersenen 1 identificeren. Ook onderscheiden de Type I versus type II AI&#39;s binnen gedissocieerde weefsel is ook uitdagend, zonder de uitdrukking van lineage tracers of subtype-specifieke transgenen, zoals worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Hoewel deze transgenen zijn zeer nuttig voor sommige toepassingen, ze onderzoekers beperken tot die transgenen afgedrukt onder de controle van de UAS enhancer element 21 en vereisen meer complexe genetische systemen. Studies die betrekking hebben op de ruimtelijke of temporele ontwikkeling AI&#39;s vergen dus in vivo in het kader van een intact weefsel. Daarnaast hebben studies gedissocieerde embryonale NBs blijkt dat het fysieke contact van aangrenzende cellen is cruciaal voor de interfase lokalisatie van belangrijke determinanten polariteit 22, 23. Deze studies tonen volledig geïsoleerd NBs de invariante mitotische spindel-as niet meer te handhaven. In plaats daarvan, deze cellen vertonen een gerandomiseerde spilas en brede hoeken scheiding tussen opeenvolgende GMC knoppen, misschien door het verlies van apicale centrosome positionering 22. Hoewel de relatie tussen de larvale AI&#39;s en hun naburige cellen is niet uitgebreid zijn onderzocht, is het gezien het feit dat de larvale stamcel micro-omgeving kan van invloed zijn op cel polariteit of andere waardgedrag. Om de fysiologische context van larvale NBs te behouden, we afbeelding ACD van hele hersenen. Gezien de inherente beperkingen in verband met beeldvorming gedissocieerde AI&#39;s, hebben ons lab en anderen protocollen opgesteld om de afbeelding opeenvolgende ronden van NB ACD uit hele larvale hersenen. Technieken om het intacte hersenen vaak vervangen de starre oppervlaktelaag van het glas aan een zijde van de kweekkamer met een flexibel membraan om weefsel verstoring of schade te voorkomen en zorgen voor gasuitwisseling. Sommige werkwijzen omvatten montage geëxplanteerd hersenen in een mengsel van insecten kweekmedium, serum en ascorbinezuur met het vet organen geïsoleerd uit tien larven 24. De geïsoleerde vet lichamen worden toegevoegd omdat ze scheiden een mitogeen bekend aan NB celdeling 25 stimuleren. Dit protocol blijft de integriteit van het weefsel gedurende 3 uur en is derhalve vatbaar voor langdurige weergave 24, 26-28. Onlangs heeft een protocol waarin de lonG termijn beeldvorming van intacte larvale hersenen in aanwezigheid van ascorbinezuur, serum, en vet lichamen is uitgewerkt 29. Belangrijk, omdat het weefsel niet blootgesteld of geïmmobiliseerd is deze benadering minder geschikt voor toepassingen waarbij kweekmedium wordt uitgewisseld (bijvoorbeeld drugstudies, immunodepletie enz.). Ons laboratorium heeft de ganse berg voorbereiding van levende larvale hersenen voor de lange termijn imaging 30, 31 vereenvoudigd. Het belangrijkste voordeel van ons protocol over anderen is zijn eenvoud: onze waarnemingen wijzen noch serum, ascorbinezuur, insuline, noch vet lichamen zijn nodig additieven op de foto opeenvolgende ronden van NB ACD. Hoewel toevoegsels, zoals insuline, zijn nuttig voor het aanhoudende beeldvorming van stamcellen celdelingen 32 en collectieve celmigratie in Drosophila eierstokken 33 zijn, lijken ze overbodig voor NB ACD te zijn, als onze beeldmedium bestaat uit een eenvoudig mengsel van standard insect celkweek medium aangevuld met antibiotica-antimycotische om besmetting te voorkomen. Door het gebruik van herbruikbare gas-permeabel of glazen bodem cultuur gerechten, hebben we in staat om een ​​aantal rondes van opeenvolgende NB ACD&#39;s ondersteunen geweest. Dezelfde geëxplanteerde monsters kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor immunofluorescentie en andere procedures met vaste weefsel. In dit protocol gedetailleerde weergave van de ontleding van intacte larvale hersenen, evenals de bereiding van hersenen van zowel levende en vaste analyse.

<table><tbody><tr><td>Lumox weefselkweekschaal 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>Een herbruikbare kweekschaal met een gasdoorlatende en optisch heldere filmbasis.</td></tr><tr><td>Schneider's S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Een supplement dat penicilline (10.000 U/ml), streptomycine (10.000 &#956;g/ml) en amfotericine B (25 &#956;g/ml) bevat dat wordt toegevoegd aan Schneider's S2 media om bacteriële en schimmelbesmetting te voorkomen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon olie 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Een traag vloeibare, inerte olie die helder en kleurloos is.</td></tr><tr><td>Paar nikkel-geplateerde speldhouders, 17 cm lang</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Paar Dumont #5 Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie naald/sonde met plastic handgreep</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter, 0,22 &#956;m poriegrootte</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Spuit, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof overdrachtpipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 32% EM-kwaliteit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>VOORZORG: Formaldehyde is giftig; het moet in een afzuigkap worden behandeld. Volg MSDS-richtlijnen voor veilig gebruik.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Een kleurstof die DNA labelt en wordt aangeslagen door UV-licht.</td></tr></tbody></table>

live-imaging van<em&gt; drosophila</em&gt; larvale neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stamcellen verdelen asymmetrisch twee nakomelingen cellen met ongelijke lot potentieel te genereren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. Gezien hun relevantie voor ontwikkeling en ziekte, het begrijpen van de mechanismen die bepalen asymmetrische stamcellen divisie heeft een robuust gebied van studie geweest. Omdat ze genetisch handelbaar ondergaan opeenvolgende ronden van celdeling ongeveer eenmaal per uur, de stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel of neuroblasts, onmisbaar modellen voor de studie van stamcellen celdeling. Ongeveer 100 neurale stamcellen zijn gelegen nabij het oppervlak van elk van de twee lobben larvale hersenen, waardoor dit modelsysteem bijzonder bruikbaar voor levende beeldvorming microscopie studies. In dit werk, bespreken we verschillende benaderingen op grote schaal gebruikt om stamcellen divisies visualiseren, en we pakken de relatieve voor-en nadelen van de technieken die in dienst gedistantieerd versus intacte hersenen weefsels. We hebben ook detail onze simplifIED protocol dat wordt gebruikt om hele hersenen explanteren uit derde instar larven voor live cell imaging en vaste analyse toepassingen.

Live-beeldvorming heeft een aantal mechanismen die NB ACD opgehelderd. Vóór beeldacquisitie, moet de optimale imaging omgevingsomstandigheden. Het is noodzakelijk om het frame opnamesnelheid afwegen tegen de duur van live cell imaging. Voor fijne cellulaire analyse, bijvoorbeeld, verhoogde tijdelijke en optische resolutie kan worden verlangd. Bij het ​​visualiseren van een enkele NB celcyclus (Figuur 4A), kan de snelheid waarmee beelden worden vastgelegd worden verhoogd zonder de invoering van photodama...

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dissectie van het intacte centraal zenuwstelsel (CZS) uit derde-instar oph-larven in detail te beschrijven, om zo asymmetrische stamceldeling, cellulaire differentiatie en morfogenese te kunnen bestuderen. Dit wordt bereikt door het CZS eerst via grove dissectie uit het lichaam van de larve te explanteren.De tweede stap is het isoleren van het intacte brein uit de perifere weefsels door middel van fijne microdissectie met behulp van speciaal vervaardigde instrumenten. Vervolgens worden de gezonde hersenen ofwel gemonteerd voor live-cell imaging of onderworpen aan chemische fixatie en immunofluorescentie; uiteindelijk wordt spinning disc confocale microscopie gebruikt om de gebeurtenissen weer te geven die neurale stamceldeling reguleren en om mechanistisch inzicht te verschaffen in de ontwikkeling van het CZS. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de velden van stamcelonderzoek, kanker en neurale ontwikkeling.Door bij te dragen aan ons begrip van hoe de proliferatie van stamcellen wordt gereguleerd, weten we dat de deling van ABER-stamcellen geassocieerd is met tumorgenese en microcefalie, en onze beeldvormi

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Hier presenteren wij een montage protocol voor...

Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo&#39;s

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates a live-imaging technique to study eye patterning in a Drosophila melanogaster pupa. Green fluorescent protein (GFP)-tagged markers enable visualization of cellular organization and differentiation during the formation of the developing eye structure.

Live Imaging of the Drosophila Pupal Eye Using Fluorescence Microscopy

Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel...

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Hier bespreken we een workflow om levende explant-hersenen van Drosophila melanogaster derde instarlarven voor te bereiden, te ontleden, te monteren en in beeld te brengen om de cellulaire en subcellulaire dynamiek onder fysiologische omstandigheden te observeren.

Live-Cell Imaging van Drosophila melanogaster Derde Instar Larvale Hersenen

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Leer live-imaging van Drosophila larvale neuroblasten voor het bestuderen van asymmetrische stamceldelingen en neurale ontwikkeling. Deze methode biedt inzicht in CNS-morfogenese en stamcelgedrag.

Live-Imaging van

Meer video's verkennen