Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons
7 november 2014
Hier beschrijven we onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnamen van geïdentificeerde remmende interneuronen in de geanesthetiseerde muiscortex. Neuronen die ChR2 tot expressie brengen, worden geïdentificeerd door hun reactie op blauw licht. De methode maakt gebruik van standaard extracellulair opname-apparatuur en dient als een goedkope alternatief voor calcium-beeldvorming of visueel geleid patchen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om hoogwaardige extracellulaire single-unit opnames te verkrijgen van corticale interneuronen bij muizen die channel rootin twee tot expressie brengen. Dit wordt bereikt door een hoog-impedantie opname-elektrode door het weefsel te brengen om interneuronen te identificeren aan de hand van spiking reacties op blauw licht pulsen. Het elektrische signaal wordt gemonitord op veranderingen die de juiste snelheid van voortgang en de kans op het verkrijgen van een stabiel goed geïsoleerde opname aangeven.
Als goede single-unit isolatie niet kan worden bereikt of omgekeerd licht-responsieve neuronen zelden worden aangetroffen, vervang de opname-elektrode. De resultaten tonen de betrouwbaarheid van licht-geïnduceerde reacties van optisch geïdentificeerde interneuronen en de typische signaal-ruisverhouding die met deze strategie wordt verkregen. De foto-stimulatie benadering is een toegankelijke en goedkope manier om genetisch geïdentificeerde celtypen te targeten met behulp van een standaard extracellulaire versterker en blauw licht.
Dit is onze strategie voor het pimpen van specifieke inner neuronen in het anesthetiseerde auditieve cortex, maar de meer algemene punten zijn van toepassing op andere corticale gebieden dan schaarse celtypen Om dit proces te starten. Nadat het dier is geanesthetiseerd met ketamine mijn cocktail via intraperitoneale injectie, plaats het in een stereotactische of andere hoofdhoudende apparatuur, zorg ervoor dat de schedel goed vastzit. Dit is essentieel voor het handhaven van stabiele single-cel opnamen.
Breng vervolgens oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen en houd de lichaamstemperatuur van het dier op 37 graden Celsius om een CI sternale drain te kunnen uitvoeren voor extra opnamestabiliteit, verwijder weefsel van de achterste schedel met een scalpelmes om het CI sternum magna bloot te leggen. Maak vervolgens een kleine insnijding in de Dora met de punt van het mes om het hersenvocht af te voeren. Gebruik nu het scalpel om een kleine craniotomie uit te voeren over het corticale gebied van belang.
Verwijder daarna de dura, bedek vervolgens de blootgestelde cortex met de laag warme aros. Houd de agros vochtig met zoutoplossing. Bereid een tongstand elektrode voor.
Lijm de elektrode op een glazen capillaire buis met superlijm en versneller. Voeg vervolgens heatshrink buis toe voor grip. Monteer daarna de elektrode op een gemotoriseerde of hydraulische microm manipulator en stel deze in om orthogonaal ten opzichte van het corticale oppervlak te reizen.
Schuif een aarddraad onder de huid tegen de schedel. Vermijd contact met de spieren aan de zijkant van het hoofd en de achterkant van de nek, omdat deze myografische artefacten kunnen genereren. Het elektrische signaal wordt versterkt met behulp van een extracellulaire versterker geschikt voor single-unit opname, bij voorkeur uitgerust met een impedantiecontrolemodus.
De aanhoudende spiking activiteit wordt gemonitord met twee oscilloscopen en een set aangedreven luidsprekers. Breng nu de elektrode door de agros en test de impedantie om er zeker van te zijn dat deze binnen zeven tot 14 mega ohm ligt. Wanneer de punt het oppervlak van de cortex doorbreekt, noteer deze positie op de microm manipulator.
Om de diepte van de opname het beste te schatten, bevestig visueel dat de elektrodenpunt de corticale oppervlakte verlaat op een diepte van nul. Bij het terugtrekken van de elektrode aan het einde van een penetratie in de auditieve cortex om er zeker van te zijn dat deze nul ingestelde setpoint overeenkomt met het niveau van de cortex, monitoren stimulus geïnduceerde veldpotentiëlen. Terwijl de elektrode door de eerste paar honderd micrometer weefsel wordt gebracht, bevestig dat de polariteit van het lokale veldpotentiaal omgekeerd wordt rond een diepte van 100 micrometer.
Monteer vervolgens een optische vezel gekoppeld aan een blauw lichtbron op een handmatige micro manipulator. Regel de uitvoer van de lichtbron met de besturingseenheid die in staat is om een TTL pulstrein van gespecificeerde breedte en duur te leveren. Monitor vervolgens het signaal op beide oscilloscopen.
Meet het totale lichtvermogen aan de punt van de optische vezel met behulp van een vermogensmeter. Gebruik deze waarde om de belichting te berekenen door deze te delen door de doorsnede van de vezelkern. Begin met de waarde in het bereik van 10 tot 15 milliwatt per vierkante millimeter.
Gebruik de microscoop om de punt van de vezel zo dicht mogelijk bij het oppervlak van de agros te positioneren. Centreer de straal waar de elektrode het weefsel zal binnengaan. Controleer nu op lichtartefacten met de elektrode in de agros.
Geef een pulsspanning af. Elimineer eventuele voorbijgaande lichtartefacten door de optische vezel ten opzichte van de elektrode te herpositioneren om de hoek van incident licht te veranderen. Als artefacten aanhouden, probeer de lichtkracht te verminderen.
Breng vervolgens de elektrode langzaam door de hersenen met een snelheid van ongeveer één micrometer per seconde. Gebruik één oscilloscoop om de aanhoudende activiteit van de elektrode te monitoren. Gebruik de andere voor het activeren van de laserpulsen.
Luister naar het zwakke hash van de licht-geïnduceerde spikes op de audiomonitor, wat aangeeft dat de elektrode een channel opsin positieve cel nadert. Vertraag vervolgens de snelheid van voortgang zodra het licht spikes opwekt die groot genoeg zijn om afzonderlijk op de oscilloscoop te worden geactiveerd.
Begin dit te doen. Pas een schaal op de horizontale as aan om de exacte vorm van de spike-golfvorm te observeren. Op dit punt, stop met het voortschrijden van de elektrode en wacht tot deze zich in het weefsel heeft gesetteld.
Dit is cruciaal voor een stabiele opname. Na enkele minuten, als de signaal-ruisverhouding niet is verbeterd, breng vijf micrometer verder en wacht. Herhaal dit proces opnieuw totdat ofwel de piek of de trog van een actiepotentiaal betrouwbaar kan worden vastgelegd met een spanningsdrempel.
Stel deze ruim boven de ruisvloer in tijdens het opnemen. Monitor de aanhoudende activiteit op de eerste oscilloscoop. Let tegelijkertijd op de grootte en vorm van spikes met behulp van de tweede oscilloscoop en noteer de kwaliteit van hun geluid op de luidspreker.</
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit registraties van geïdentificeerde inhiberende interneuronen in de cortex van een geanestheseerde muis. De techniek maakt gebruik van neuronen die ChR2 tot expressie brengen, welke worden geïdentificeerd aan de hand van hun respons op blauw licht, en biedt een kosteneffectief alternatief voor complexere imaging-methoden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Neuronale signalering
Achtergrond
- Single-unit registraties zijn essentieel voor het begrijpen van het neuronale gedrag.
- Het identificeren van specifieke neurontypen kan de nauwkeurigheid van registraties verbeteren.
- Channelrhodopsine-2 (ChR2) maakt optogenetische controle van neuronen mogelijk.
- Standaard extracellulaire registratietechnieken worden veelvuldig gebruikt in de neurowetenschappen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het registreren van corticale interneuronen.
- Het gebruik van optogenetica voor het identificeren van lichtgevoelige neuronen.
- Het bieden van een toegankelijke aanpak voor onderzoekers in de elektrofysiologie.
Gebruikte methoden
- Het inbrengen van een registratie-elektrode met een hoge impedantie door het corticale weefsel.
- Het monitoren van elektrische signalen als reactie op pulsen van blauw licht.
- Het beoordelen van de stabiliteit en isolatie van single-unit registraties.
- Het vervangen van elektroden indien stabiele registraties niet worden bereikt.
Belangrijkste resultaten
- Aantoonbare betrouwbaarheid van door licht opgewekte responsen van geïdentificeerde interneuronen.
- Bereikte een typische signaal-ruisverhouding die duidt op succesvolle opname.
- Validatie van de effectiviteit van de methode voor het targeten van genetisch geïdentificeerde celtypen.
- Bewijs geleverd voor de toegankelijkheid van de techniek met gebruik van standaardapparatuur.
Conclusies
- De beschreven methode is een levensvatbaar alternatief voor duurdere technieken.
- Optogenetische identificatie verbetert de precisie van elektrofysiologische registraties.
- Deze benadering kan verder onderzoek naar neuronale functie en gedrag faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze methode maakt precieze targeting van inhiberende interneuronen mogelijk voor functionele karakterisering, waarmee een cruciale uitdaging in de drug discovery voor neurowetenschappen wordt aangepakt. Door een kosteneffectieve en toegankelijke benadering te bieden voor het isoleren van genetisch gedefinieerde celtypen, ondersteunt het de mechanistische risicoreductie van CNS-targets. De techniek verhoogt het voorspellend vertrouwen bij vroege targetvalidatie door neuronale activiteit te koppelen aan gedragstypen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door optogenetisch geïdentificeerde interneuroonactiviteit te koppelen aan de functie van corticale circuits.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van standaardapparatuur voor extracellulaire registratie, waardoor de afhankelijkheid van gespecialiseerde expertise in imaging of patch-clamp wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door betrouwbare isolatie van individuele units en validatie van door licht opgewekte responsen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream farmacologische screening door het vaststellen van stabiele, geïsoleerde registraties.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van de consistentie van de spike-golfvorm en de signaal-ruisverhouding mogelijk als functionele readouts.
- Schaalbaarheid: Compatibel met elektroden met een hoge impedantie en gemotoriseerde manipulatoren voor reproduceerbare controle van de penetratiediepte.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Werkt over verschillende interneurontypes (PV+, SOM+, CR+), wat afstemming met transgene ziektemodellen ondersteunt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door een consistente methode te bieden voor het monitoren van neuronale responsen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Faciliteert go/no-go-beslissingen op basis van de elektrofysiologische getrouwheid van de target engagement.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows waarin hypothesetesten en pathway-verduidelijking voorafgaan aan lead-identificatie, met name voor CNS-doelen die celtype-specifieke modulatie vereisen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door stabiele opnames mogelijk te maken van optogenetisch gedefinieerde interneuronpopulaties.
- Screening: Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door impedantiegestuurde elektrodevoortgang en stabiele isolatie van individuele eenheden.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van spike-golfvormen en latentie voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinisch werk via kruiscompatibiliteit met standaard anesthetische en chirurgische preparaties.
- Enterprise-hergebruik: Herbruikbaar over verschillende corticale gebieden en interneurontypes, waardoor de noodzaak voor hervalidatie tussen projecten wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targetvalidatie door ambiguïteit in neuronale identiteit en responseigenschappen te verminderen.
- Operationele waarde: Bevordert standaardisatie door gedefinieerde bereiken voor elektrode-impedantie (7–14 MΩ) en lichtbestralingsparameters (10–15 mW/mm²).
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door kostbare imaging-infrastructuur te vermijden terwijl de datakwaliteit behouden blijft.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functioneel gevalideerde interneuronale modulatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in extracellulaire elektrofysiologie en optogenetische stimulatie.
- Is afhankelijk van gemotoriseerde manipulatoren, impedantiemeters en blauwe lichtbronnen met TTL-aansturing.
- Maakt standaardisatie van anesthesie-, craniotomie- en durotomieprocedures tussen gebruikers noodzakelijk.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten variërende bestralingsniveaus voor verschillende expressiedieptes van opsines.
- Praktische beperkingen omvatten een lage opbrengst en elektrode-afhankelijke signaalkwaliteit, waardoor screening van meerdere penetraties noodzakelijk is.
