Name: Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer hoe je stabiele single-unit opnamen maakt van corticale remmende interneuronen in muizen met behulp van optogenetische identificatie via ChR2 en blauw licht. Deze kosteneffectieve methode biedt een betrouwbaar alternatief voor complexere beeldvormingstechnieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Whitehall Foundation en de NIH. We danken Clifford Dax (University of Oregon Technical Support Administration) voor zijn hulp en expertise bij het ontwerpen van een circuit voor lichtlevering.

OPMERKING: Het volgende protocol is in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen, zoals goedgekeurd door de Universiteit van Oregon Animal Care en gebruik Comite. 1. Acute Chirurgie <ol><li> Verdoven van het dier met een ketamine-medetomidine cocktail via intraperitoneale (ip) injectie (Tabel 1). OPMERKING: De muizen gebruikt in deze experimenten worden gegenereerd door het kruisen van een cre-afhankelijke ChR2-eYFP transgene Line10 bestuurder lijnen (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +) interneuron. Virale levering van ChR2 of aanverwante opsins moet even goed werken, in de veronderstelling soortgelijke uitdrukking niveaus worden verkregen. </li><li> Voor het begin van de operatie, ervoor te zorgen dat het dier vertoont geen reactie op een zachte teen knijpen. Opnieuw toedienen anesthetica gehele experiment noodzakelijk om deze diepte van de anesthesie te handhaven. Als injecteerbare anesthetica, eventueel implanteren ip katheter onderhoud injecties. </li><li> Houd het dier gehydrateerd met zoutoplossing of Ringer lactaat gehele experiment (ongeveer 3 ml / kg / uur), bij voorbeeld met behulp van een geschikt verdund verdoving cocktail voor onderhoud injecties (Tabel 1). </li><li> Plaats het dier in een stereotaxisch of andere head-apparaat voor het houden. Zorg ervoor dat de schedel is goed beveiligd. Dit is essentieel voor het behoud van stabiele single cell opnames. </li><li> Breng opthalamic zalf voor de ogen droog voorkomen. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 36,5-37 ° C. </li><li> Voer een cisternal drain voor extra opname stabiliteit. Met behulp van een scalpel, verwijdert weefsel uit de achterste gezicht van de schedel naar de cisterna magna bloot. Maak een kleine inkeping in de dura aan de cerebrospinale vloeistof af te tappen. Gebruik alleen het uiterste puntje van het mes, en vermijd contact opnemen met de kleine hersenen of hersenstam. </li><li> Met de scalpel Voer een kleine craniotomie (~ 2 mm 2) over de corticale interessegebied (voor auditievecortex, ruwweg -2,3 mm posterior van bregma, 4,5 mm lateraal van de middellijn). </li><li> Verwijder de dura en bedekken de blootgestelde cortex met een laag warm agarose 0,5-1 mm dik (1,5% agarose in zoutoplossing, 0,9% NaCl; toepassing bij ~ 37 ° C). Houd de agarose vochtig gedurende het experiment door het periodiek aanbrengen van enkele druppels zoutoplossing. </li></ol> 2. Opname Set-up <ol><li> Bereid een wolfraam elektrode (7-14 MQ, 127 micrometer diameter, 12 ° conische tip, epoxy-coating). Superlijm de elektrode een glazen capillaire buis en voeg krimpkous grip (figuur 1). </li><li> Monteer de elektrode op een gemotoriseerde (of hydraulische) micromanipulator, ingesteld orthogonaal te reizen naar het corticale oppervlak. Schuif een draad grond onder de huid, tegen de schedel. Contact met de spieren aan de zijkant van het hoofd en de nek ze elektromyografische artefacten kunnen genereren. </li><li> Versterken het elektrische signaal met een extracellulair versterkerli fi er geschikt voor single-unit opnemen, bij voorkeur uitgerust met een impedantie check mode. Monitor lopende stekelige activiteit (band pass 300 - 5.000 Hz) met twee oscilloscopen en een set actieve luidsprekers. Hier worden de opgenomen data continu gedigitaliseerd met een sampling rate van 10 kHz; spikes zijn offline gehaald. </li><li> Vooraf de elektrode door de agarose totdat de punt het oppervlak van de cortex bereikt. Observeer deze stap door een microscoop. &quot;Zero&quot; deze positie op de micromanipulator. </li><li> Om zo goed benaderen de diepte van opname visueel bevestigen dat de elektrode verlaat het corticale oppervlak op een diepte van nul herroeping de elektrode aan het einde van een penetratie. OPMERKING: een discrepantie tussen de manipulator lezen en de waargenomen elektrodepositie blijkt dat ten opzichte van het weefsel afgedreven. Dit kan worden veroorzaakt door instabiliteit van de hersenen of dier of manipulator drift. <ol><li> Als extra controle om te verzekeren datDeze zero set-point komt overeen met de oppervlakte van de cortex, monitor-stimulus evoked potentials veld en bevordert tegelijk door de eerste paar honderd micrometer van weefsel. Bij het bewaken van potentials veld, hoe lager de onderste band-pass filter cutoff van de extracellulaire versterker tot 10 Hz. Controleer of de polariteit van de plaatselijke veldpotentiaal keert ongeveer een diepte van ~ 100 urn, bij layer I / II grens 13. Dit is een betrouwbaar referentiepunt voor auditieve cortex, maar eventueel voor andere corticale gebieden. </li></ol></li><li> Monteer een optische vezel gekoppeld met een blauwe lichtbron (figuur 2) op een handmatige micromanipulator. Gebruik van de microscoop, plaats het uiteinde van de vezel nabij het oppervlak van de agarose mogelijk. Centreer de balk waar de elektrode het weefsel zullen betreden. </li><li> Regel de uitvoer van de lichtbron met een besturingseenheid die in staat is een TTL (transistor-transistor logica) pulstrein opgegeven breedte en DUURn- bijvoorbeeld een Arduino (figuur 3), een computer I / O-kaart (zoals getoond), of een commercieel verkrijgbaar pulsgenerator. <ol><li> Bekijk het signaal op beide oscilloscopen. </li></ol></li><li> Meet totale lichtsterkte (mW) aan het uiteinde van de optische vezel met een energiemeter. Met deze waarde bestralingssterkte (mW / mm2) berekend door deling van de dwarsdoorsnede van de vezelkern. Begin met een intensiteit waarde in het gebied van 10-15 mW / mm2 en naar beneden worden zonodig totdat artefacten geëlimineerd. </li><li> Controleer voor lichte voorwerpen met de elektrode in de agarose, klaar om het weefsel voeren. Start het zoeken pulstrein (bijvoorbeeld 30 msec lichtpulsen, 500 msec interstimulus interval (ISI)). <ol><li> Elimineer voorbijgaande lichte voorwerpen (figuur 4) door herpositionering van de optische vezel ten opzichte van de elektrode naar de hoek van invallend licht te veranderen. Als artefacten aanhouden, probeer het verminderen van het licht macht. In the zeldzame geval dat artefacten niet volledig kan worden geëlimineerd (alleen geminimaliseerd), verlenging van de duur van de zoektocht puls. Dit kan helpen bij het identificeren waar neuronale spikes. </li></ol></li></ol> 3. Straight PINP-in &#39; <ol><li> Vooraf de elektrode langzaam door de hersenen op een snelheid van ongeveer 1 um / sec. Gebruik een oscilloscoop om activiteiten te monitoren. Anderzijds leiden van de laserpulsen. </li><li> Luister voor de zwakkeren &#39;hash&#39; van licht opgewekte spikes op de audio-monitor, die aangeeft dat de elektrode nadert een ChR2 + cel en kan vaak worden waargenomen ruim voor het elektrische signaal is zichtbaar op de oscilloscoop. Vertragen het tempo van de vooruitgang. OPMERKING: Als de cel ligt direct in het pad van de elektrode, zal het licht opgewekte activiteit groter (en harder) groeien. Als de elektrode benadert één interneuron, zal de hash op te lossen in kleine, maar goed gedefinieerde pieken van uniforme grootte en vorm. </li><li> Zodra liGHT-opgewekte spikes zijn groot genoeg om triggeren individueel op de oscilloscoop, beginnen doen. Stel de schaal op de horizontale as om de exacte vorm van de piek golfvorm observeren. </li><li> Stoppen en wachten tot het weefsel om zich te vestigen. Weersta de verleiding om de elektrode dichter bij de cel te verplaatsen. Deze stap is essentieel voor een stabiele opname. Wanneer na enkele minuten de signaal-ruisverhouding te wensen overlaat - dat het weefsel geregeld, maar het is gebracht de cel dichter bij het uiteinde van de electrode - voorschot 5 urn verder en wacht opnieuw. <ol><li> Herhaal dit proces totdat de piek of het dieptepunt van de actiepotentiaal op betrouwbare wijze kan worden vastgelegd met een voltage drempel goed gezet boven het ruisniveau (bijvoorbeeld +/- 300 mV of hoger). OPMERKING: Er is weinig kans op vals-positieven of dubbelzinnigheid wanneer PINPing remmende interneuronen. De meeste cellen kunnen gemakkelijk volgen een reeks pulsen met een duur van 30 msec en inter-pulse interval 500 msec, of sneller, met een betrouwbare eerste piek latentie van 2,5 msec (Figuur 5). De meeste PV + cellen, in het bijzonder kunnen houden afvuren voor een volledige 1 sec (Figuur 6). Omdat dit remmende neuronen, disynaptic (indirect) de activering geen groot probleem. </li></ol></li><li> Tijdens het opnemen, monitoren continue activiteit op de eerste oscilloscoop. Houd in de gaten op de grootte en de vorm van spikes met behulp van de tweede oscilloscoop. Let op de kwaliteit van het geluid van de luidspreker. <ol><li> Aandachtig luisteren naar abrupte, die aangeven dat de cel ofwel tekening te dicht bij de elektrode (waar het risico loopt doorboord of beschadigd), of wegdrijven. Als de spikes worden groot en vervormd, terug uit; als ze kleiner worden, vooraf de elektrode. Beweeg langzaam in 2 micrometer stappen. </li><li> Controleer de kwaliteit van de opname post-hoc door superpositie van alle spike golfvormen, afgestemd op het piekvermogen of trog. Varieer de spanning Thresvast te houden. Over een breed scala van drempelwaarden, moet er altijd maar één consistente spike vorm van uniforme hoogte (figuur 5a) zijn. </li></ol></li><li> Als op enig moment het signaal vervuild raakt met spikes van een naburig neuron, gaan we verder. Advance langzaam aan de off-kans dat de elektrode passeert buiten het bereik van de naburige cel, maar blijven afstand van het doel neuron. (Meestal is mislukt.) </li><li> Beweeg de elektrode door de gehele diepte van cortex (900+ pm) in elke verdieping. Als er geen licht-responsieve neuronen worden aangetroffen na vele penetraties of, omgekeerd, worden opnames routinematig besmet met spikes uit naburige ChR2- cellen, probeer een nieuwe elektrode. OPMERKING: Zelfs binnen één partij, kan de impedantie en tip geometrie van de afzonderlijke elektroden aanzienlijk variëren. Beide factoren dragen bij aan het effectief &quot;luisteren radius&quot; van de elektrode, die groot genoeg is om het licht opgewekte spikes detecteren wh moet zijnile zoeken, maar voldoende beperkt tot opname één interneuron afzonderlijk schakelen. </li><li> Test de impedantie van de elektroden naar wens. Om beschadiging van het weefsel te voorkomen, moet deze met de punt van de elektrode in het bovenste gedeelte van de agarose laag, ver buiten de hersenen. Binnen het bereik van 7-14 MQ, de exacte impedantie is niet zeker voorspeller van prestaties of opbrengst voor deze toepassing. Dat gezegd hebbende, het is een redelijke proxy voor het luisteren radius: lagere impedantie elektroden pick-up meer eenheden; hogere impedantie minder. </li><li> Aan het einde van het experiment, inslapen de dierlijke institutioneel goedgekeurd middelen zoals anesthetische overdosis of cervicale dislocatie onder een diep niveau van verdoving. </li></ol>

<ol><li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Moore, A. K., Wehr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+inhibitory+interneurons+in+auditory+cortex+are+well-tuned+for+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency.</a> J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).</li>
<li>Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+interneuronal+inhibition+in+the+cerebral+cortex+of+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals.</a> Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).</li>
<li>Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+interneurons+linearly+transform+cortical+responses+to+visual+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli.</a> Neuron. 73, 159-170 (2012).</li>
<li>Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+subtraction+by+distinct+cortical+inhibitory+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo.</a> Nature. 488, 343-348 (2012).</li>
<li>Letzkus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+microcircuit+for+associative+fear+learning+in+the+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex.</a> Nature. 480, 331-335 (2011).</li>
<li>Pi, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneurons+that+specialize+in+disinhibitory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control.</a> Nature. 503, 521-524 (2013).</li>
<li>Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+circuit+for+spatial+summation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neural circuit for spatial summation in visual cortex.</a> Nature. 490, 226-231 (2012).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3, 159(2005).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-dependent+temporal+response+properties+in+core+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex.</a> J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).</li>
<li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons%3A+chandelier+versus+basket+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8, 70553(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Hoewel PINP is conceptueel eenvoudig, kan het een uitdaging in de praktijk zijn. Een belangrijke determinant van het succes is de keuze van de elektrode. De elektrische luisteren radius is de kritische parameter. Het moet voldoende groot zijn om licht opgewekte spikes detecteren wanneer de tip nog op enige afstand van een ChR2 + cel, zodat men de snelheid van vooraf dienovereenkomstig kan passen. Tegelijkertijd moet voldoende beperkt om goede isolatie enkele eenheid inschakelen. Dat wil zeggen dat de elektrode mag niet ...

Het karakteriseren van de talloze celtypen die het zoogdierbrein vormen, is een centraal, maar lang ongrijpbaar doel van de neurofysiologie geweest. De eigenschappen en functie van verschillende remmende celtypen in de hersenschors zijn bijvoorbeeld onderwerpen van groot belang, maar zijn nog relatief onbekend. Dit komt deels omdat conventionele blinde in vivo opnametechnieken beperkt zijn in hun vermogen om verschillende celtypen te onderscheiden. Extracellulaire spikebreedte kan worden gebruikt om veronderstelde parvalbumine-positieve remmende neuronen te scheiden van excitatoire piramidecellen, maar deze methode is onderhevig aan zowel type I als type II fouten2,3. Als alternatief kunnen opgenomen neuronen worden gevuld, hersteld en gekleurd om later hun morfologische en moleculaire identiteit te bevestigen, maar dit is een pijnlijk en tijdrovend proces. Onlangs zijn genetisch geïdentificeerde populaties van remmende interneuronen toegankelijk geworden door middel van calciumbeeldvorming of visueel geleide patch-opnames. In deze benaderingen maakt virale of transgene expressie van een calcium reporter (zoals GCaMP) of fluorescente proteïne (zoals GFP) identificatie en karakterisering mogelijk van celtypen die worden gedefinieerd door promotorexpressie. Deze benaderingen gebruiken 2-foton microscopie, die dure apparatuur vereist, en zijn ook beperkt tot oppervlakkige corticale lagen vanwege de lichtverstrooiende eigenschappen van hersenweefsel. 
Onlangs ontwikkelden Lima en collega's1 een nieuwe toepassing van optogenetica om elektrofysiologische opnames te richten op genetisch geïdentificeerde neuronale typen in vivo, genaamd “PINP” – of Fotostimulatie-geassisteerde Identificatie van Neuronale Populaties. Opnames worden uitgevoerd bij muizen die Channelrhodopsin-2 (ChR2) tot expressie brengen in specifieke neuronale subpopulaties. Leden van de populatie worden geïdentificeerd door hun reactie op een korte flits blauw licht. In tegenstelling tot veel andere optogenetische toepassingen, is het doel niet om de circuitfunctie te manipuleren, maar simpelweg neuronen te identificeren die behoren tot een genetisch gedefinieerde klasse, die vervolgens kunnen worden gekarakteriseerd tijdens normale hersenfunctie. De techniek kan worden geïmplementeerd met standaard extracellulaire opnameapparatuur en kan daarom dienen als een toegankelijke en goedkope alternatief voor calciumbeeldvorming of visueel geleide patchen. Hier beschrijven we een benadering voor PINPing van specifieke celtypen in de verdoofde auditieve cortex, met de verwachting dat de meer algemene punten bruikbaar kunnen worden toegepast in andere preparaten en hersengebieden.
In de cortex biedt PINP bijzondere belofte voor het onderzoeken van de in vivo responseigenschappen van remmende interneuronen. GABAerge interneuronen omvatten een kleine, heterogene subset van corticale neuronen4. Verschillende subtypen, gemarkeerd door de expressie van specifieke moleculaire markers, zijn recentelijk getoond om verschillende computationele rollen in corticale circuits uit te voeren5-9. Naarmate genetische tools verbeteren, kan het uiteindelijk mogelijk zijn om morfologisch en fysiologisch scheidbare typen te onderscheiden die binnen deze brede klassen vallen. We delen hier onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnames van geïdentificeerde remmende interneuronen in de verdoofde muiscortex. Deze strategie werd specifiek ontwikkeld voor het targeten van parvalbumine-positieve (PV+) cellen, maar we hebben gevonden dat het ook werkt voor andere interneurontypen, zoals somatostatine-expresserende (SOM+) en calretinine-expresserende (CR+) interneuronen. Hoewel PINPing conceptueel eenvoudig is, kan het in de praktijk verrassend onbuigzaam zijn. We hebben een aantal tips en trucs geleerd door middel van trial-and-error die nuttig kunnen zijn voor anderen die de methode proberen.

<table><tbody><tr><td>ChR2-EYFP Line</td><td>Jackson Colonies</td><td>12569</td><td></td></tr><tr><td>Pvalb-iCre (PV) Line</td><td>Jackson Colonies</td><td>8069</td><td></td></tr><tr><td>Sst-iCre (SOM) Line</td><td>Jackson Colonies</td><td>13044</td><td></td></tr><tr><td>Cr-iCre (CR) Line</td><td>Jackson Colonies</td><td>10774</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>Type III-A, High EEO</td></tr><tr><td>Micro Point (dural hook)</td><td>FST</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>FST</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>FST</td><td>10003-12 (handle), 10011-00 (blades)</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Ophthalmic Ointment</td><td>Foster &amp; Smith</td><td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic Blanket</td><td>Harvard Apparatus</td><td><a name="RANGE!C11">507220F</a></td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Microelectrodes</td><td>A-M Systems</td><td>577200</td><td>12 M&Omega; AC resistance, 127 &mu;m diameter, 12&deg; tapered tip, epoxy-coated</td></tr><tr><td>Capillary Glass Tubing</td><td>Warner Instruments</td><td>G150TF-3</td><td></td></tr><tr><td>Heat Shrink Tubing</td><td>DigiKey</td><td>A332B-4-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zapit Accelerator</td><td>DVA</td><td>SKU ZA/ZAA</td><td>Gebruik met standaard Superlijm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode AC Amplifier 1800</td><td>AM Systems</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>MP-285 Motorized Micromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>4-channel Digital Oscilloscopes</td><td>Tektronix</td><td>TDS2000C</td><td></td></tr><tr><td>Powered Speakers</td><td>Harman</td><td>Model JBL&nbsp;Duet</td><td></td></tr><tr><td>Manual Manipulator</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7</td><td></td></tr><tr><td>800 &micro;m Fiber Optic Patch Cable</td><td>ThorLabs</td><td>FC/PC BFL37-800</td><td></td></tr><tr><td>Power Meter</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)</td><td></td></tr><tr><td>475 nm Cree XLamp XP-E</td><td>DigiKey</td><td>XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND</td><td>LED-vermogen en -efficiëntie nemen voortdurend toe, dus we raden aan om de nieuwste producten te controleren (www.cree.com).</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>DigiKey</td><td>1050-1024-ND</td><td></td></tr></tbody></table>

een gids voor in vivo single-unit opnemen van optogenetically identified cortical remmende interneurons

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Een grote uitdaging neurofysiologie is de responseigenschappen en functie van vele celtypen remmende kenmerken in de cerebrale cortex. We delen hier onze strategie voor het verkrijgen van een stabiele, goed geïsoleerde single-unit registraties van geïdentificeerde remmende interneuronen in de verdoofde muis cortex met behulp van een methode die is ontwikkeld door Lima en collega&#39;s 1. Opnames worden uitgevoerd in muizen die Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifieke neuronale subpopulaties. De leden van de bevolking worden geïdentificeerd door hun reactie op een korte flits van blauw licht. Deze techniek - aangeduid als &quot;PINP&quot;, of fotostimulatie ondersteunde Identificatie van Neuronal Populaties - kan worden uitgevoerd met standaard extracellulaire opnameapparatuur. Het kan dienen als een goedkoop en toegankelijk alternatief calcium imaging of visueel geleide patches, voor de targeting extracellulaire registraties genetisch geïdentificeerde cellen. Here bieden wij een set van richtlijnen voor het optimaliseren van de methode in de dagelijkse praktijk. We verfijnd onze strategie specifiek voor het richten parvalbumine-positieve (PV +) cellen, maar hebben ontdekt dat het werkt voor andere soorten interneuron als goed, zoals somatostatine uiten (SOM +) en-calretinin uiten (CR +) interneuronen.

We delen hier onze strategie voor het verkrijgen van single-unit onderzoek van genetisch-geclassificeerde remmende interneuronen in de verdoofde muis cortex, met behulp van een optogenetic methode ontwikkeld door Lima et al. 1. Tabel 1 details de voorgestelde verdoving cocktail, Ketamine-Medetomidine-Acepromazine (&quot; KMA &quot;). Figuur 1 toont een micro-elektrode wolfraam, klaar voor opname. Figuur 2 is een schema voor een eenvoudige LED besturi...

Hier beschrijven we onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnamen van geïdentificeerde remmende interneuronen in de geanesthetiseerde muiscortex. Neuronen die ChR2 tot expressie brengen, worden geïdentificeerd door hun reactie op blauw licht. De methode maakt gebruik van standaard extracellulair opname-apparatuur en dient als een goedkope alternatief voor calcium-beeldvorming of visueel geleid patchen.

Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om hoogwaardige extracellulaire single-unit opnames te verkrijgen van corticale interneuronen bij muizen die channel rootin twee tot expressie brengen. Dit wordt bereikt door een hoog-impedantie opname-elektrode door het weefsel te brengen om interneuronen te identificeren aan de hand van spiking reacties op blauw licht pulsen. Het elektrische signaal wordt gemonitord op veranderingen die de juiste snelheid van voortgang en de kans op het verkrijgen van een stabiel goed geïsoleerde opname aangeven.Als goede single-unit isolatie niet kan worden bereikt of omgekeerd licht-responsieve neuronen zelden worden aangetroffen, vervang de opname-elektrode. De resultaten tonen de betrouwbaarheid van licht-geïnduceerde reacties van optisch geïdentificeerde interneuronen en de typische signaal-ruisverhouding die met deze strategie wordt verkregen. De foto-stimulatie benadering is een toegankelijke en goedkope manier om genetisch geïdentificeerde celtypen te targeten met behulp van een standaard extracellulaire versterker en blauw licht.Dit is onze strategie voor het pimpen van specifieke inner neuronen in het anesthetiseerde auditieve cortex, maar de meer algemene punten zijn van toepassing op andere corticale gebieden dan schaarse celtypen Om dit proces te starten. Nadat het dier is geanesthetiseerd met ketamine mijn cocktail via intraperitoneale injectie, plaats het in een stereotactische of andere hoofdhoudende apparatuur, zorg ervoor dat de schedel goed vastzit. Dit is essentieel voor het handhaven van stabiele single-cel opnamen.Breng vervolgens oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen en houd de lichaamstemperatuur van het dier op 37 graden Celsius om een CI sternale drain te kunnen uitvoeren voor extra opnamestabiliteit, verwijder weefsel van de achterste schedel met een scalpelmes om het CI sternum magna bloot te leggen. Maak vervolgens een kleine insnijding in de Dora met de punt van het mes om het hersenvocht af te voeren. Gebruik nu het scalpel om een kleine craniotomie uit te voeren over het corticale gebied van belang.Verwijder daarna de dura, bedek vervolgens de blootgestelde cortex met de laag warme aros. Houd de agros vochtig met zoutoplossing. Bereid een tongstand elektrode voor.Lijm de elektrode op een glazen capillaire buis met superlijm en versneller. Voeg vervolgens heatshrink buis toe voor grip. Monteer daarna de elektrode op een gemotoriseerde of hydraulische microm manipulator en stel deze in om orthogonaal ten opzichte van het corticale oppervlak te reizen.Schuif een aarddraad onder de huid tegen de schedel. Vermijd contact met de spieren aan de zijkant van het hoofd en de achterkant van de nek, omdat deze myografische artefacten kunnen genereren. Het elektrische signaal wordt versterkt met behulp van een extracellulaire versterker geschikt voor single-unit opname, bij voorkeur uitgerust met een impedantiecontrolemodus.De aanhoudende spiking activiteit wordt gemonitord met twee oscilloscopen en een set aangedreven luidsprekers. Breng nu de elektrode door de agros en test de impedantie om er zeker van te zijn dat deze binnen zeven tot 14 mega ohm ligt. Wanneer de punt het oppervlak van de cortex doorbreekt, noteer deze positie op de microm manipulator.Om de diepte van de opname het beste te schatten, bevestig visueel dat de elektrodenpunt de corticale oppervlakte verlaat op een diepte van nul. Bij het terugtrekken van de elektrode aan het einde van een penetratie in de auditieve cortex om er zeker van te zijn dat deze nul ingestelde setpoint overeenkomt met het niveau van de cortex, monitoren stimulus geïnduceerde veldpotentiëlen. Terwijl de elektrode door de eerste paar honderd micrometer weefsel wordt gebracht, bevestig dat de polariteit van het lokale veldpotentiaal omgekeerd wordt rond een diepte van 100 micrometer.Monteer vervolgens een optische vezel gekoppeld aan een blauw lichtbron op een handmatige micro manipulator. Regel de uitvoer van de lichtbron met de besturingseenheid die in staat is om een TTL pulstrein van gespecificeerde breedte en duur te leveren. Monitor vervolgens het signaal op beide oscilloscopen.Meet het totale lichtvermogen aan de punt van de optische vezel met behulp van een vermogensmeter. Gebruik deze waarde om de belichting te berekenen door deze te delen door de doorsnede van de vezelkern. Begin met de waarde in het bereik van 10 tot 15 milliwatt per vierkante millimeter.Gebruik de microscoop om de punt van de vezel zo dicht mogelijk bij het oppervlak van de agros te positioneren. Centreer de straal waar de elektrode het weefsel zal binnengaan. Controleer nu op lichtartefacten met de elektrode in de agros.Geef een pulsspanning af. Elimineer eventuele voorbijgaande lichtartefacten door de optische vezel ten opzichte van de elektrode te herpositioneren om de hoek van incident licht te veranderen. Als artefacten aanhouden, probeer de lichtkracht te verminderen.Breng vervolgens de elektrode langzaam door de hersenen met een snelheid van ongeveer één micrometer per seconde. Gebruik één oscilloscoop om de aanhoudende activiteit van de elektrode te monitoren. Gebruik de andere voor het activeren van de laserpulsen.Luister naar het zwakke hash van de licht-geïnduceerde spikes op de audiomonitor, wat aangeeft dat de elektrode een channel opsin positieve cel nadert. Vertraag vervolgens de snelheid van voortgang zodra het licht spikes opwekt die groot genoeg zijn om afzonderlijk op de oscilloscoop te worden geactiveerd.Begin dit te doen. Pas een schaal op de horizontale as aan om de exacte vorm van de spike-golfvorm te observeren. Op dit punt, stop met het voortschrijden van de elektrode en wacht tot deze zich in het weefsel heeft gesetteld.Dit is cruciaal voor een stabiele opname. Na enkele minuten, als de signaal-ruisverhouding niet is verbeterd, breng vijf micrometer verder en wacht. Herhaal dit proces opnieuw totdat ofwel de piek of de trog van een actiepotentiaal betrouwbaar kan worden vastgelegd met een spanningsdrempel.Stel deze ruim boven de ruisvloer in tijdens het opnemen. Monitor de aanhoudende activiteit op de eerste oscilloscoop. Let tegelijkertijd op de grootte en vorm van spikes met behulp van de tweede oscilloscoop en noteer de kwaliteit van hun geluid op de luidspreker.</

a-guide-to-vivo-single-unit-recording-from-optogenetically-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the recording of electrical signals from single brain neurons using a fine-tipped glass micropipette and a specialized setup. The micropipette is carefully inserted into the rat's brain and is buzzed to penetrate the neuron to record internal neuronal electrical signals.

In Vivo Recording of Intracellular Signals from a Single Neuron

This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering...

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Lai, J., et al. Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a microinjection-based technique for simultaneous neuronal recording and inhibition in the rat superior colliculus. The procedure involves stereotaxic targeting, skull drilling, and the insertion of an injectrode, which delivers an inhibitory neurotransmitter while recording neuronal activity. Light stimulation evokes...

Inhibition of Neuronal Activity and Its Detection Using Electrophysiology in a Rat

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Optogenetische benaderingen worden wijd gebruikt om neurale activiteit te manipuleren en de gevolgen voor hersenfunctie beoordelen. Hier, wordt een techniek beschreven die bij in vivo expressie van het optische activator Channelrhodopsin, maakt de ex vivo analyse van synaptische eigenschappen specifieke lange afstand en lokale neurale verbindingen in angst gerelateerde circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

Ex vivo hersenplakken kunnen worden gebruikt om de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties op afferente inputs te bestuderen. Optogenetica wordt gebruikt om zelfstandig thalamocorticale en corticocorticale afferente stoffen te activeren voor niet-primaire neocortex, en synaptische en netwerkresponsen worden gemoduleerd met isofluraan.

Optogenetische activering van afferente paden in hersenplakken en modulatie van reacties door vluchtige anesthetica

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Hier presenteren we twee protocollen voor de registratie van micro-elektrocorticografie met hoge dichtheid (μEcoG) bij ratten en muizen, inclusief chirurgische, implantatie- en registratiemethoden. μECoG-opnames worden uitgevoerd in combinatie met laminaire polytrode-opname in de auditieve cortex van de rat of met optogenetische manipulatie van neurale activiteit in de somatosensorische cortex van de muis.

Multischaalonderzoek van corticale verwerking door integratie van laminaire polytrodes en optogenetica met micro-elektrocorticografie bij knaagdieren

Leer hoe je stabiele single-unit opnamen maakt van corticale remmende interneuronen in muizen met behulp van optogenetische identificatie via ChR2 en blauw licht. Deze kosteneffectieve methode biedt een betrouwbaar alternatief voor complexere beeldvormingstechnieken.

Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons

Meer video's verkennen