Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen
12 augustus 2014
Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om genetisch gemanipuleerde astrocytoommodellen te genereren uit gedefinieerde celtypen voor fenotypische karakterisering in vitro en in vivo. Dit wordt bereikt door wild type primaire cellen te verzamelen van niet-Cree-expresserende neonatale conditioneel genetisch gemanipuleerde muizen voor in vitro-kweek. In de tweede stap worden de primaire cellen geïnfecteerd met een adenoviraal vector dat Cree-recombinatie codeert om genetische recombinatie van de F-flox-allelen in vitro te induceren.
Vervolgens worden de gecombineerde cellen serieel gekweekt voor hun fenotypische karakterisering. Uiteindelijk wordt bepaald of de gedefinieerde mutaties glio-agenes in specifieke neurale celtypen bevorderen door karakterisering van tumorogene relevante fenotypes in vitro en in vivo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke neuro-oncologievragen, zoals Wat zijn de fenotypische gevolgen van astrocytoomgeassocieerde mutaties?
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot preklinische geneesmiddelontwikkeling voor astrocytomen, omdat deze genetisch gedefinieerde cellen in vitro en in vivo kunnen worden gebruikt in immuuncompetente syngenetische muizen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stap van celoogst en orthotopische injectie technisch moeilijk is en nauwkeurige identificatie van anatomische structuren vereist. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Ryan Bash, een technicus uit mijn laboratorium Om hersenweefsel te verzamelen.
Begin met het gebruik van met ethanol gesteriliseerde dissectiescharen om een sagittale snede te maken in de huid over het schedeldak van een een tot drie dagen oude geëuthaniseerde neonatale, genetisch gemanipuleerde muis van het ruggenmerg tot de neus. Maak vervolgens een snede in het schedeldak langs de sagittale sutuur, beginnend bij het ruggenmerg en zich uitstrekkend voorbij de reuklobben. Gebruik vervolgens gebogen forceps om voorzichtig elke hemisfeer van het schedeldak lateraal van de hersenen te pellen met behulp van rechte microforceps.
Vervolgens knijp je voorzichtig de dorsale porties van elke corticale hemisfeer weg en zorg ervoor dat je de hersenen en reuklob vermijdt en plaats het hersenweefsel in een weefselkweekschaaltje met H-B-S-S-N. Gebruik onder een dissecterend microscoop twee paar microforceps om voorzichtig de meninges van elke corticale hemisfeer te verwijderen en plaats de weefselkweekschaaltje terug op het ijs om het hersenweefsel te homogeniseren. Gebruik eerst een schone scheermes om de corticale hemisferen uiteindelijk in blokjes te snijden.
Vervolgens verplaats je de plaat naar een weefselkweekkap en breng je de weefselstukken over in een steriele 15 milliliter conische buis. Spoel de plaat met één milliliter ijskoud HBSS en breng ook de was over naar de buis. Na het verwijderen van het overtollige HBSS op twee milliliter kamertemperatuur tripsine met EDTA in de buis en associeer de weefselfragmenten verder door ongeveer 10 keer op en neer te pipetteren met een ene milliliter pipet.
Incubeer de celsuspensie gedurende 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius. Meng de celsuspensie voorzichtig door omkering om de 5 minuten na de incubatie, meng drie milliliter compleet medium in de celsuspensie om het trypsine te remmen door 10 keer op en neer te pipetteren zoals zojuist is gedemonstreerd. Draai vervolgens de gedissocieerde astrocyten neer.
Verwijder voorzichtig de snat met een ene milliliter pipet en suspendeer het pellet in vier milliliter van 37 graden Celsius. Compleet medium. Breng vervolgens de astrocytsuspensie over naar een T 75 schroefdop weefselkweekflacon en houd de corticale astrocyten gedurende ongeveer 16 uur na de oogst bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.
Was de flacon met vier milliliter van 37 graden Celsius HBSS. Voeg vervolgens vier milliliter compleet medium toe en houd de corticale astrocyten bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Wanneer de cultuur ongeveer 95% confluentie bereikt, schud de cultuur een nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.
Verwijder vervolgens het medium dat de losgekoppelde cellen bevat en was de plaat met nog eens vier milliliter van 37 graden Celsius HBSS. Voeg vervolgens vier milliliter vers compleet medium toe en incubeer de cellen opnieuw 24 uur na het verrijken van de cultuur voor corticale astrocyten. Ververs de cultuur met twee milliliter compleet medium.
Incubeer vervolgens de cellen met een milliliter compleet medium dat één microliter van ten minste één keer de 10e van de 10e pfu per milliliter van het adenovirus van belang bevat bij 32 graden Celsius in 5% koolstofdioxide bij vijf. Gfab CRE-infectie veroorzaakt een proliferatieve voordeel in gecombineerde gfab-astrocyten waardoor de astrocytzuiverheid van 59% tot meer dan 90% toeneemt na vijf tot negen passages in cultuur. Verwijder na zes uur het virusbevattende medium en incubeer de cultuur opnieuw in vers, compleet medium.
Nadat de corticale astrocyten bij ongeveer 90% confluentie zijn geoogst en het juiste aantal cellen worden gesuspendeerd in ijskoud 5% methylcellulose. Plaats een 250 microliter glazen spuit in een herhalende antigeendispenser en bevestig vervolgens een stompe 18 gauge naald aan de spuit. Gebruik de 18 gauge naald om de corticale astrocyten in de spuit te aspireren en verwijder eventuele luchtbellen.
Gooi vervolgens de 18 gauge naald weg en plaats een 27 gauge naald op de spuit. Druk op de knop van de antigeendispenser totdat er vloeistof uit de nieuwe naald wordt gespoten om de astrocyten te implanteren. Bevestig vervolgens een drie tot zes maanden oude immunocompetente ontvangerdier binnen een stereotactische frame en maak een incisie over de sagittale sutuur van ongeveer 0,5 centimeter lang tussen de oren en ogen.
Lokaliseer de kruising van de coronale en sagittale suturen of de BRE MA, evenals de kruising van de lambdoïde sagittale suturen of de Lambda. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat BMA en lambda zich in hetzelfde horizontale vlak bevinden, bevestigt u de spuit en de herhalende antigeendispenser aan het stereotactische frame boven het hoofd van het dier en brengt
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het genereren van genetisch gemodificeerde astrocytoommodellen vanuit wild-type astrocyten en neurale stamcellen, geoogst uit conditioneel genetisch gemodificeerde muizen. De modellen worden in vitro en in vivo gekarakteriseerd om de fenotypische gevolgen van astrocytoom-geassocieerde mutaties te begrijpen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neuro-oncologie
- Celbiologie
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Astrocytoom is een type hersentumor dat voortkomt uit astrocyten.
- Inzicht in de genetische basis van astrocytoom kan bijdragen aan behandelstrategieën.
- Conditionele genetische manipulatie maakt gerichte studies naar specifieke mutaties mogelijk.
- Het modelleren van astrocytoom in vitro en in vivo is cruciaal voor fenotypische karakterisering.
Doel van het onderzoek
- Om astrocytoommodellen te genereren voor fenotypische karakterisering.
- Om de impact van specifieke mutaties op gliogenese te onderzoeken.
- Om kernvragen in de neuro-oncologie met betrekking tot astrocytoommutaties te beantwoorden.
Gebruikte Methoden
- Oogsten van wildtype primaire cellen uit genetisch gemodificeerde muizen.
- Infectie van primaire cellen met een adenovirale vector voor genetische recombinatie.
- Seriële cultuur van gerecombineerde cellen voor fenotypische analyse.
- Karakterisering van tumorigene relevante fenotypes in vitro en in vivo.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van astrocytoommodellen vanuit gedefinieerde celtypen.
- Karakterisering van fenotypische veranderingen geassocieerd met mutaties.
- Inzichten in de rol van specifieke mutaties bij de ontwikkeling van astrocytomen.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen en behandelen van astrocytomen.
Conclusies
- De studie biedt een kader voor het modelleren van de pathogenese van astrocytomen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van mutaties geassocieerd met astrocytomen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze modellen om therapeutische opties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode stelt biofarmaceutische R&D in staat om de pathogenese van astrocytomen te modelleren met behulp van genetisch gedefinieerde corticale astrocyten of neurale stamcellen uit conditionele GEM, wat een syngene systeem biedt dat immunocompetent is en menselijke histopathologische kenmerken, waaronder diffuse herseninvasie, recapituleert. Het ondersteunt mechanische risicobeperking door specifieke oncogene mutaties te koppelen aan fenotypische resultaten in vitro en in vivo, waardoor het vertrouwen in de validatie van targets wordt vergroot. Het orthotope allograft-model faciliteert preklinische drugstests in een fysiologisch relevante micro-omgeving, wat de translationele continuïteit voor neuro-oncologische pipelines verbetert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door de fenotypische gevolgen van specifieke oncogene mutaties in relevante typen hersencellen te definiëren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor functionele targetvalidatie via adenovirale Cre-gemedieerde recombinatie in primaire cellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door mutaties te koppelen aan fenotypen van transformatie, proliferatie en drugrespons.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gevalideerde biologische systemen die geschikt zijn voor downstream compound-screening na in vitro fenotypische karakterisering.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van proliferatie, transformatie en drugrespons mogelijk als gestandaardiseerde eindpunten voor assayontwikkeling.
- Schaalbaarheid: Seriële cultuur van gerecombineerde cellen ondersteunt de schaalbare preparatie van getransformeerde astrocyten voor reproduceerbare screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Orthotope allografts in immuuncompetente syngene mice reproduceren histopathologische kenmerken van menselijke astrocytomen, waaronder glioblastoom en diffuse parenchymale invasie.
- Translationele continuïteit: Bioluminescentie-imaging van luciferase-expresserende allografts maakt longitudinale in vivo monitoring van tumorgroei mogelijk voor farmacokinetische/farmacodynamische studies.
- Preklinisch nut: Faciliteert het testen van drugseffectiviteit in vitro en in vivo met gebruik van hetzelfde genetisch gedefinieerde cellsysteem, ter ondersteuning van go/no-go-beslissingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische validatie, door een genetisch gedefinieerd, immuuncompetent modelsysteem voor astrocytoom te bieden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door gecontroleerde recombinatie van gefloxte oncogene allelen in corticale astrocyten of NSC's mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare getransformeerde cellen met kwantificeerbare fenotypes (proliferatie, transformatie, medicijnrespons) voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (tumoroppervlak via histopathologie, bioluminescentiesignaal) die vergelijking tussen condities en modellering van groeikinetiek mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen met in vivo tumorigenese via orthotope allografts die de histopathologie van menselijk astrocytoom weerspiegelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van meerdere oncogene combinaties over verschillende celtypen heen, waardoor de afhankelijkheid van xenograft-modellen die immunosuppressie vereisen, wordt verminderd.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via isogene, celtype-specifieke modellering.
- Operationele waarde: Verbeterd de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gedefinieerde genetische inputs en syngene systeemhosts.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets mogelijk te maken met een model dat laatstadium-mislukkingen door slechte histopathologische getrouwheid voorkomt.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door gegevens te verschaffen over het tumorigenisch potentieel en de medicijnrespons in een klinisch relevante context.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het oogsten van primaire neurale cellen, adenovirale transductie en stereotactische orthotope injectie.
- Afhankelijk van toegang tot conditioneel genetisch gemodificeerde muizen met gefloxte oncogene allelen en weefselkweekfaciliteiten voor de expansie van primaire cellen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een consistente Cre-recombinatie-efficiëntie en coördinaten voor allograft-implantatie.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het uitbreiden van het model naar neurale stamcellen of andere oncogene combinaties buiten astrocyten.
- Praktische beperkingen omvatten de technische moeilijkheidsgraad van dissectie van de neonatale hersenen en intracraniële injectie, waarvoor gespecialiseerde training nodig is om levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid te garanderen.
