Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Het algemene doel van deze procedure is om de verdeling van endogene junctional, terin en pcam een te volgen tijdens leukocyte trans endotheliale migratie onder fysiologische stromingsomstandigheden. Dit wordt bereikt door eerst polymorfkernige leukocyten of PMN's te isoleren uit het volbloed van gezonde vrijwilligers met behulp van een proco-gradient. De tweede stap is om fluorescent gelabelde antilichamen toe te voegen aan A TNF alpha gestimuleerde humane umbilicale vene endotheelcel monolaag gekweekt in flow slides 30 minuten voor het starten van het flow experiment.

Dit maakt visualisatie mogelijk van de junctionale dynamica van endotheelcellen tijdens neutrofiele transmigratie onder fysiologische stromingsomstandigheden. Vervolgens wordt de flow slide met de fluorescent gelabelde TNF alpha gestimuleerde humane umbilicale vene endotheelcellen verbonden met het flow systeem en op de microscoop tafel geplaatst. De pomp trekt de flow buffer uit het reservoir door de flow kamer in de spuit.

De laatste stap is om de PMN's langzaam via de injectiepoort in het flow systeem te injecteren. Uiteindelijk worden de PMN's gevisualiseerd met behulp van een confocale laser scanning microscoop. Na een paar minuten verschijnen leukocyten, hechten en transmigreren.

Het experiment kan op elk gewenst moment worden gestopt. Het grote voordeel van deze techniek boven andere bestaande methoden zoals statische transmigratie assays, is dat je met deze techniek hechting en transmigratie in real life onder fysiologische stromingsomstandigheden kunt bestuderen. Dit zal ons helpen begrijpen waarom leukocyten de ene route kiezen boven de andere, dus PGA versus transcellulaire migratie.

We doen dit door de cel-celverbindingen te visualiseren met fluorescent gelabelde antilichamen. De humane umbilicale vene endotheelcellen of HU X voor dit experiment worden gekweekt volgens de instructies van de fabrikant op fibronectine gecoate schotels met behulp van media aangevuld met endotheelgroei. Medium. De celcultuur wordt gebruikt tussen vier tot acht passages wanneer de cellen 80 tot 90%Confluëntie bereiken, zorgvuldig wassen ze met kamertemperatuur PBS bij pH 7.4 en vervolgens trypsine is de cellen na trypsine en centrifugatie.

We schorsen op 800.000 cellen per milliliter met behulp van media. Het experiment gebruikt flow kamers die de dag ervoor zijn gecoat met fibronectine op de plaat. 80.000 cellen in elke enkele kanaal van de fibronectine gecodeerde flow kamers en pipetteer voorzichtig de celsuspensie op en neer, cultuur overnacht in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide de volgende dag.

Ververs het media in de flowkamer slide door de slide voorzichtig te kantelen in een hoek van 45 graden. Het wordt aanbevolen om alleen het media in de reservoirs te verwijderen en niet in het kanaal zelf. Verwijdering van het media in de kanalen kan resulteren in endotheelcelverlies en dood door de slepende kracht van het media veroorzaakt door pipetteren.

Controleer door fase contrast microscopie of de endotheelcellen een monolaag hebben gevormd. Als de cellen niet 100%cofluent zijn, ververs het media twee keer per dag totdat ze 100%confluence bereiken. Zodra de cellen 100%co fluence hebben bereikt, stimuleer de cellen met media die de inflammatoire mediator bevat.

TNF alpha stimulatie uix overnacht met TNF alpha resulteert in een inflammatoire fenotypus van het endotheel IE upregulatie van celadhesiemoleculen zoals ICAM een en VA M1. Voorafgaand aan het isoleren van polymorfkernige leukocyten of PMN's. Bereid een flow buffer voor om geïsoleerde PMN's te wassen en voor gebruik in de flow assay tot 100 milliliter van een eerder bereide stockoplossing. Bij 100 microliters verse een molare calciumchloride, 2,5 milliliter humane albumine vanuit een 200 gram per liter stock concentratie en 0,1 gram glucose.

Filter de flow buffer met behulp van een 0,45 micron filter. Een 10% trinatriumcitraat of TNC oplossing in PBS bij pH 7,4 wordt ook bereid vóór isolatie van PMN's. PMN's zullen worden geïsoleerd uit 20 milliliter volbloed dat is verzameld in een natriumheparine ette van een gezonde vrijwilliger.

Verdun eerst het volbloed een op een met 10%PBST NNC in een 15 milliliter buis. Gebruik vervolgens een pijpetteer jong op de langzaamste instelling om voorzichtig 20 milliliter verdund bloed voorzichtig op 12,5 milliliter van per co colloidale oplossing in water met een dichtheid van 1,130 gram per milliliter in een nieuwe 50 milliliter buis te pipetten. De buis met per coll moet tijdens het toevoegen van het bloed onder een hoek van 45 graden worden gekanteld.

Plaats voorzichtig de buizen in de centrifuge en draai bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten bij 800 Gs met lage acceleratie en met de remmen uitgeschakeld wanneer de centrifugatie voltooid is. Verwijder alle vloeistof en vul elke buis met ijskou erythrocyte lyse buffer om de erytrocyten te lyseren. Laat de buizen op ijs, draai ze af en toe om totdat de suspensie donkerrood wordt, centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500 GS bij vier graden Celsius met de remmen ingeschakeld.

De resulterende pelletfractie bevat de PMN's Samen met de erytrocyten, verwijder de supernatant en was de pellet twee keer in ijs. Koude lyse buffer bij 500 Gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na verwijdering van de supernatant uit de tweede was, resuspendeer de pellet met flow buffer bij kamertemperatuur en bepaal de PMN's concentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller.

Ten slotte schorsen de PMN's in flow buffer bij eenmaal 10 tot de zes cellen per milliliter en bewaar bij kamertemperatuur om endotheliale junctionale VA cadherin en pcam een te labelen. Voeg de pcam LOR 6 47 antilichaam toe bij een een op honderd verdunning en het calciumonafhankelijke FE cadherin ZI antilichaam bij een een op vijftig verdunning aan VE cultuur, medium in de flowkamer en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Om de PMN's voor te bereiden op de assay, plaats ze gedurende 15 minuten in een waterbad op 37 graden Celsius voordat ze in het flow systeem worden geïnjecteerd.

Verbind slangen naar een lege flowkamer en vul deze met warm flow buffer om vorming van luchtbellen te voor