Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe je fluorescentiebeeldvorming met een nauwkeurigheid van één nanometer of Fiona-experimenten kunt uitvoeren. Dit wordt bereikt door eerst de benodigde apparatuur in te stellen en de optica uit te lijnen voor totale interne reflectie, fluorescentie, microscopie of turf. De volgende stap is om CY 3D NA te immobiliseren op het binnenoppervlak van een monsterkamer en om CY 3D NA enkele moleculen met nanometerprecisie te lokaliseren.

Vervolgens wordt Fiona toegepast om de beweging van een enkele geamputeerde myosine vijf a-motor te bestuderen, gelabeld met een quantumdot. Uiteindelijk werd de stapgrootte van myosine gemeten terwijl het liep op, Acton met Fiona-analyse op 36 nanometer. Hoewel deze methode inzicht kan geven in moleculaire motoren, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals het volgen van receptoren op het membraan van cellen.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de experimentele details moeilijk te leren zijn. Het is belangrijk om altijd laserveiligheidsbrillen te dragen tijdens de opstelling. Voor totale interne reflectie, fluorescentie, microscopie of turf.

Om te beginnen, stelt u de hoogte van alle optische componenten in op de hoogte van het midden van de microscoop, achterpoort, monteer de laser, lasersluiter en ND-filters. Gebruik ND-filters om het laservermogen zo laag mogelijk te verlagen terwijl de straal zichtbaar blijft. Draai de schroeven vast met de juiste zeskantsleutels.

Plan een straalweg zoals geïllustreerd door de gestippelde blauwe lijnen. Markeer in dit schema de straalweg met tape of marker op de optische tafel. Plaats spiegel M1 bij de eerste rechte hoek, plaats de twee irissen langs het tweede rechte gedeelte van de geplande straalweg.

Stel zowel de positie als de kant van M1 aan zodat de laser door de irissen gaat, plaats spiegel M twee. Bij de tweede rechte hoek plaatst u de 10 x straalvergroter langs het derde rechte gedeelte van de weg. Pas de hoek aan zodat de straalvergroter parallel is aan zowel de optische tafel als de geplande straalweg.

De volgende stap is om M1 en M twee iteratief aan te passen zodat de laser recht door de centra van beide lenzen, L een en L twee van de straalvergroter gaat. Gebruik een stuk wit papier om de straal na de straalvergroter te blokkeren om het straalprofiel met het oog te controleren. Pas aan totdat het straalprofiel van de uitgebreide straal niet ED is.

Stel Gaussiaan de afstand tussen L een en L twee zodanig in dat de straal wordt gecolleerde sluiter. De laser ontkoppelt het microscoopobjectief en schroeft een fluorescerende uitlijning in. Plaats spiegels M drie en M vier om de uitgebreide straal in de microscooppoort en op de dichroische spiegel te richten.

Binnenin de toren. Stel M drie af om het helderste deel van de straal te centreren op het fluorescerende doelwit en M vier om de straal verticaal te laten kantelen, sluit de laser en schroeft het objectief terug in. Fine Tune de kantelhoeken van M drie en M vier om de laservermogen en het straalprofiel uit het objectief te optimaliseren.

Monteer een E-M-C-C-D-camera op de microscoop en sluit de camera aan op een computer. Start de software voor de camera. Monteer een fluorescerend monster op de microscoop.

Kijk naar de heldere fluorescerende vlek op de camera. Controleer of de vlek niet verschuift op het scherm als de focus is veranderd. Plaats de TIR-lens op de XY, Z-translatietrap op een afstand van de achterfocale vlak van het objectief die gelijk is aan de brandpuntsafstand, de L drie, ongeveer 30 centimeter.

Stel de positie van L drie zo in dat de laser door het centrum van de lens gaat. Vertaal L drie langs de straalweg om de straalcolatie aan te passen. Zorg ervoor dat de straal nog steeds gecentreerd is op de monitor en symmetrisch van vorm is.

Vertaal L drie loodrecht op de straalweg om de straal uit het objectief te kantelen. Blijf de TIR-lens vertalen zodat TIR wordt bereikt voordat een Fiona-experiment wordt uitgevoerd over het lokaliseren en mobiliseren van CY 3D NA.Een enkele molecuulconstructie monsterkamers zoals beschreven in de protocoltekst.

Twee stroken dubbelzijdig plakband worden op de dia langs de lange randen aangebracht, waarbij een opening van drie tot vijf millimeter in het midden wordt gelaten, en vervolgens wordt een gereinigde dekglasplaat op de dia geplaatst. Zijaanzicht van de kamer vanuit het rechtergedeelte en van voren wordt getoond. De open uiteinden van de kamer worden open gelaten en dienen als inlaat en uitlaat om SI 3D NA op de binnenoppervlakken van de monsterkamer te immobiliseren. Pipetteer 10 microliter BSA-biotine in de kamer.

Wacht vijf minuten. Was de monsterkamer door 40 microliter T 50 BSA in de kamer te pipetten. Pipetteer vervolgens 10 microliter neut travain in de kamer en incubeer gedurende vijf minuten.

Was de kamer opnieuw met 40 microliter T 50 BSA pipetten, 20 microliter SI 3D NA in de monsterkamer en incubeer gedurende vijf minuten. Was tenslotte de kamer met 80 microliter T 50 BSA. Om te beginnen met de procedure voor het beeldvormen van SI 3D NA enkele moleculen onder turf M pipetten 30 microliter beeldvormingsbuffer in de monsterkamer en wacht acht tot 10 minuten.

Monteer het monster voor beeldvorming op een turf-microscoop die is uitgerust met een groene laser, een 100 X olie-immersieobjectief en een E-M-C-C-D-camera. Stel de belichtingstijd en de EM-versterking in. Verwerf een film van het monster gedurende 1000 frames.

Compileer en voer Fiona Pro uit voor Fiona-analyse. Gebruik dit IDL-programma om de verworven afbeelding te importeren om de effectieve pixelgrootte in te voeren en de conversiefactor van intensiteit naar fotonnummer en om punten voor Fiona-analyse te kiezen. Aan het einde geeft het programma de pasresultaten uit met 2D-Gaussische functies evenals het totale aantal fotonen en lokalisatieprecisie. Compileer en voer pH count pro uit.

Om het fotontelling te karakteriseren, gebruikt u