Name: RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer RNA-isolatie van ribonuclease-rijk muizenpancreas met behoud van hoge integriteit. Deze methode levert RNA met een integriteitsgetal boven zeven, geschikt voor genexpressieanalyse en QPCR-toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo en Satyanarayana Rachagani voor hun nuttige opmerkingen, suggesties en het delen van hun protocollen. Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​U01CA111294 en an Idea Development Award van de Ohio State University Intramurale Research Program.

1. Bereiding De volgende praktijken houden aan de door de Animal Care en gebruik Comite van de Instelling (IACUC) vastgesteld beleid. <ol><li> Het wordt aanbevolen om niet meer dan 6 muis pancreases isoleren in een bepaalde dag. Zijn alle chirurgische instrumenten schoon en autoclaaf, een set per dier. </li><li> Label alle microcentrifugebuizen. Vier 2 ml buisjes per dier. </li><li> Plaats 8 ml lysis reagens in 50 ml centrifuge buizen op ijs. Opmerking: Als het zuiveringssamenstel heeft een guanidine thiocyanaat fenol reagens dat geschikt is voor alvleesklier isolering lysis reagens gebruikt vanwege de grote hoeveelheden die nodig zijn per isolatie. </li><li> Verdeel ongeveer 10 ml van de volgende oplossingen in 15 ml centrifugebuizen voor schoonmaak blades de homogenisator is. Ethanol, 70% (2 tubes), HPLC-kwaliteit water (1 tube) en HPLC-kwaliteit water met ongeveer 200 pl RNase Away of gelijkwaardig ribonuclease inactivator. </li></ol&gt; 2. Chirurgie, alvleesklier Dissection en homogenisering <ol><li> Plaats 1-2 ml van isofluraan in een pot met een gaasje of papieren handdoeken. Muizen worden op een platform dat hen verhindert het bereiken van de bron van de isofluraan geplaatst. Voeg verse isofluraan aan de pot voorafgaand aan verlamming van elke muis. </li><li> Plaats voorzichtig de muis in de pot met de isofluraan. Cap de pot en toezicht houden op de gevolgen van de anesthesie door voorzichtig draaien van de pot heen en weer. Het dier wordt verdoofd zodra het in staat in zijn &#39;eigen te staan. </li><li> Ter bevestiging van de anesthesie, verwijder het dier uit de pot en een stevige teen knijpen toepassing. Als de muis niet reageert op de teen knijpen, ga dan naar stap 2.5. </li><li> Als de muis reageert op de teen knijpen, herhaal de stappen 2,2-2,3. </li><li> Plaats de verdoofde dier op de bank top in buikligging. Ontwrichten baarmoederhals van de muis door strak plaatsen van de linkerhand op de baarmoederhals van de muis. Onsing de rechterhand grijpen de staart van de muis en snel omhoog trekken op ongeveer een hoek van 45 ° naar de baarmoederhals ontwrichten. </li><li> Beveilig het karkas aan een oppervlak (een niveau stukje piepschuim bedekt met keukenpapier) door het doorboren van elk van het dier vier poten in het platte vlak met behulp van 25 gauge injectienaalden. </li><li> Met behulp van steriele chirurgische instrumenten, snijd de buik van de muis open en snel te verwijderen van de alvleesklier van de muis. Gebruik de tang om de alvleesklier te houden en knip het uit de milt en de dunne darm met behulp van de lente schaar. Wees voorzichtig de alvleesklier niet te rekken tijdens het verwijderen van de muis. Verstoring van het weefsel kon ribonuclease vrijgeven. Opmerking: De tijd die nodig is om de pancreas van de muis verwijderd kritisch. De vakman moet kunnen de alvleesklier ontleden in ongeveer 1 min. of minder. </li><li> Plaats het gehele alvleesklier in een 50 ml buis met 8 ml ijskoude lysis reagens. Doe het buisje dicht en even schudden om de ti onderdompelenssue in het reagens en doorgaan naar de volgende stap zonder vertraging. De verhouding van lysis reagens om weefsel kritisch. Zie paragraaf resultaten voor een vergelijking van de RNA integriteit geïsoleerd met verschillende volumina lysis reagens. </li><li> Gehomogeniseerd, 5 sec. Het is belangrijk om de homogenisator messen op de bodem van de centrifugebuis zodat het weefsel wordt getrokken in de messen voor efficiënte homogenisatie. </li></ol> 3. Verwijdering van Onverteerd Tissue Opmerking: Na homogenisatie zullen kleine stukjes weefsel in de lysis reagens blijven. Het is belangrijker om snel lyseren het weefsel verlaten wat weefsel in plaats van onverteerd dan homogeniseren en risico afbraak van RNA. <ol><li> Overdracht 2 ml lysis reagens dat de gelyseerde alvleesklier een 2 ml microcentrifugebuis. Verzamel twee microcentrifugebuizen van homogenaat per isolement. Gooi de resterende homogenaat of bewaar bij -80 ° C voor toekomstige studies. </li><li> Centrifuge bij 4 ° C, 12.000 x g gedurende 5 min om de onverteerd weefsel pellet. Dit is een cruciale stap als overdracht van onverteerd weefsel in latere oplossingen van RNA zal het monster waarschijnlijk besmet met ribonuclease (stap 5.13). </li><li> Breng 1 ml van het supernatans in een 2 ml microcentrifugebuis. Ga verder met de isolatie onmiddellijk slaan repliceren buis bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Plaats alle buisjes met homogenaat op nat ijs terwijl het doorgaat met de volgende stap. </li><li> Gooi de resterende lysisreagens in een geschikte chemische afvalbak. </li></ol> 4. Reiniging van de Homogenizer Blades <ol><li> Alvorens over te gaan naar de volgende isolatie, het reinigen van de homogenisator messen door ze in 10 ml 70% ethanol. Activeer de homogenisator voor ongeveer 20 sec tot enige stukjes weefsel dat in de bladen mag worden gevangen te verwijderen. </li><li> Gebruik een 200 ul pipet tip om alle stukken die nog in de homogenisatie-bladen te verwijderen. </li&gt; <li> Herhaal stap 4.1 in water, algemeen Rnase inactivator en 70% ethanol. Droog de homogenisator as met een schone Kim vegen. </li><li> Herhaal stap 2.1 voor de pancreas isolatie van de overblijvende dieren, waarbij RNA geïsoleerd uit elk dier afzonderlijk plaats bundeling van RNA. </li></ol> 5. RNA Isolation De volgende sectie is gelijk aan de zuivering kit protocol. Het voordeel van de zuivering kit is dat het totale RNA waaronder kleine RNA isoleert. <ol><li> Als het gebruiken van bevroren homogenaat oplossing, ontdooien op nat ijs en laat het staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 200 ul van chloroform, de dop op de buis en schud krachtig met de hand gedurende 15 sec. Laat de buis staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten. </li><li> Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 xg, 4 ° C. </li><li> Breng de bovenste waterlaag in een microcentrifugebuis. Voeg 1,5 volumes isopropanol en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. </li><li> Transfer tot 700 ul van het monster in een spin kolom die is geplaatst in een 2 ml verzamelbuis. Sluit het deksel en centrifugeer bij 8000 xg gedurende 15 seconden bij KT. </li><li> Gooi de doorstroom. </li><li> Herhaal stap 5,5-5,6, met de rest van het monster. </li><li> Voeg 700 ul buffer RWT aan de spin kolom. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 8.000 x g. Gooi de doorstroom. </li><li> Pipetteer 500 ul buffer RPE in de spin kolom. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 8.000 xg om de kolom te wassen. Gooi de doorstroom. </li><li> Voeg 500 ul buffer RPE de spin kolom. Centrifugeer gedurende 2 min bij 8000 xg om de kolom te drogen. </li><li> Breng de spin kolom een ​​1,5 ml microcentrifugebuis. Pipet 80 ul-ribonuclease gratis water direct op de spin kolom membraan. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8000 xg om het RNA te elueren. </li><li> Voeg 1 ul Rnase-remmer aan het RNA-oplossing. Bewaren bij -80 ° C of overgaan tot 5.13. </li><li> Om de integriteit van het RNA valideren eerst berekenen RNA concentration en 260/280 verhouding met behulp van een spectrofotometer. </li><li> Verdun een deel van de RNA oplossing tot ongeveer 500 ng / pl met moleculaire biologie kwaliteit water. </li><li> Bepaal de RNA integriteit (dwz, RIN) met behulp van capillaire elektroforese analyse. Ongeveer 5 ui RNA oplossing is voldoende voor de analyse. </li><li> Aliquot de RNA-oplossing (zie figuur 2) en bewaar bij -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het isoleren van RNA uit weefsels die zijn Ribonuclease rijk vormt een grote uitdaging voor de moleculaire biologie experimenten. Verschillende reagentia en kits zijn commercieel beschikbaar die zijn voornamelijk gebaseerd op het fenol guanidine thiocyanaat methode RNA-extractie. Guanidinethiocyanaat denatureert eiwitten en vermindert de activiteit van ribonuclease. Echter, de enorme omvang van ribonuclease in pancreas vereist extra aanpassingen aan standaardprotocollen van RNA isolatie. Een protocol wordt hiervoor geme...

Isolatie van RNA met hoge integriteit is vereist voor routine moleculaire biologische experimenten zoals Northern blotting 9, qRT-PCR 1 of genexpressieprofielen 5. De meeste hedendaagse werkwijzen RNA-isolatie zijn gebaseerd op modificaties van de guanidine thiocyanaat protocollen 2, 3. Guanidine thiocyanaat is een sterk eiwit denaturerend en effectief verstoren de activiteit van ribonuclease onder de meeste omstandigheden. De populaire methode van Chomczynski en Sacchi 3 gecombineerd fenol de guanidine thiocyanaat lysis oplossing ontsluiting tijd ongeveer 4 uur. Vele commercieel verkrijgbare RNA-extractie reagentia zijn gebaseerd op het Chomczynski en Sacchi methode 3. Ribonuclease rijke weefsels zoals mens of muis pancreas ook een extra uitdaging voor het isoleren van RNA. Muis alvleesklier kan tot 75 mg ribonuclease 6 bevatten die zal worden uitgebracht During verstoring van de pancreas weefsel resulteert in weefsel autolyse. Modificaties van de guanidine thiocyanaat protocollen zijn met succes gebruikt om RNA te isoleren uit pancreas met hoge integriteit 2, 4, 7, 10. Infusie van RNA stabilisatie reagens in muis pancreas vergemakkelijkt isolatie van RNA met hoge integriteit 4, 7, 10, infusie evenwel van oplossingen in de alvleesklier vereist grote vaardigheid, gespecialiseerde instrumenten zoals een dissectie microscoop en verstoren weefselarchitectuur tijdens de procedure kan tot cellysis nodig. Perfunderen weefsel met RNA stabilisatie reagens kunnen interfereren met andere toepassingen, waaronder eiwitisolatie en histologische kleuring. Bovendien is deze techniek niet geschikt voor het isoleren van RNA van humane pancreas. Andere protocollen vereisen de voorbereiding van specifieke oplossingen door de onderzoeker 2. Wij rapporteren een protocol om RNA te isoleren met een hoge integriteit van de muis pancreas. The protocol gebruikt elementen van eerder gepubliceerde werkwijzen en is grotendeels gebaseerd op de standaard fenol / guanidine-thiocyanaat gebaseerde lysis reagens protocollen. Het is niet de voorbereiding van gespecialiseerde oplossingen vereisen evenmin infusie van reagentia nodig in de alvleesklier. Kritische stappen voor een succesvolle RNA-isolatie zijn voorzien van een high fenol /-guanidine gebaseerd lysisreagens om weefsel ratio, het verwijderen van onverteerd weefsel voorafgaand aan de scheiding en het opnemen van een ribonucleaseremmer fase naar de resulterende RNA oplossing. Door deze en andere modificaties, wij doorgaans isoleren RNA met RIN groter dan 7 wordt gebruikt voor normale genexpressie analyse.

<table><tbody><tr><td>Power Gen 500&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>Homogenizer</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Gekoelde microcentrifuge</td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Lyse reagens</td></tr><tr><td>Student Vannas veertangschaar</td><td>Fisher</td><td>91500-09&nbsp;</td><td>Te gebruiken voor het snijden van de pancreas uit aangehechte weefsels</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar, 6 inch</td><td>Fisher</td><td>08-951-20</td><td>Te gebruiken voor het snijden van de huid van de muis</td></tr><tr><td>Blunt end pincet</td><td>Fisher</td><td>1381239</td><td>Te gebruiken om de pancreas vast te houden tijdens het dissekeren</td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Anesthetisch middel</td></tr><tr><td>Rnase out (40 U/µl)</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhibitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>Algemene Rnase inactivator</td></tr><tr><td>HPLC-kwaliteit water</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td>Voor het wassen van homogenisatorbladen</td></tr><tr><td>Moleculaire biologie kwaliteit water</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>Elutie van RNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Purificatiekit</td></tr><tr><td>2 ml microcentrifugebuisjes, gecertificeerd Rnase Dnase vrij</td><td>USA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifugeerbuisjes</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 µl pipettenpunten</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>Voor het reinigen van homogenisatorbladen</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td><td>Spectrofotometer</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Capillaire elektroforese-analyzer voor het meten van RNA-integriteit</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td></td><td>RNA-stabilisatie reagens&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp;spin kolommen&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Spin kolommen&nbsp;als onderdeel van de miRNeasy Mini kit</td></tr><tr><td>Muizen</td><td>Chales River</td><td>Strain C57BL/6</td><td>Hun leeftijd varieerde van 4 tot 12 maanden.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Muizen&nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>strain 129</td><td>Hun leeftijd varieerde van 4 tot 12 maanden.&nbsp;&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rna isolatie van mouse pancreas: a ribonuclease-rijke tissue

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Het isoleren van hoogwaardig RNA uit ribonuclease-rijk weefsel, zoals de alvleesklier van een muis, is een uitdaging. Aangezien een van de primaire functies van de alvleesklier het helpen bij de spijsvertering is, kan de alvleesklier van een muis wel 75 mg ribonuclease bevatten. We rapporteren aanpassingen van standaard phenol/guanidinethiocyanaat lysisreagens protocollen om RNA uit de alvleesklier van een muis te isoleren. Guanidinethiocyanaat is een sterk eiwitdenaturerend middel en zal de activiteit van ribonuclease onder de meeste omstandigheden effectief verstoren. Echter, cruciale aanpassingen aan standaard protocollen zijn noodzakelijk om RNA met succes uit ribonuclease-rijk weefsel te isoleren. Sleutelstappen omvatten een hoog lysisreagens naar weefsel verhouding, verwijdering van onverteerd weefsel voorafgaand aan fasescheiding en het opnemen van een ribonuclease remmer in de RNA oplossing. Door deze en andere aanpassingen te gebruiken, isoleren we routinematig RNA met een RNA Integrity Number (RIN) groter dan 7. Het geïsoleerde RNA is van geschikte kwaliteit voor routinematige genexpressie analyse. Aanpassing van dit protocol om RNA uit ribonuclease rijk weefsel, behalve de alvleesklier, zou gemakkelijk haalbaar moeten zijn.

De totale RNA opbrengst van 1 ml lysis homogenaat 20-40 ug. OD 260/280 ratio&#39;s zijn meestal rond de 2.0 en de RIN zijn consistent hoger dan 7,0. Als de RIN is ≤ 6, wordt de isolatie moeten worden herhaald. Soms wordt een RIN die hoger is dan 8,0 bereikt. De twee meest gebruikte methoden van euthanasie muizen vóór verwijdering van de alvleesklier CO 2 stikken of inhalatie van isofluraan. Beide worden gevolgd door cervicale dislocatie. Omdat het mogelijk is dat het chemische mid...

We rapporteren een procedure om RNA met hoge integriteit te isoleren uit de ribonuclease-rijke muizenpancreas.

RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Het algemene doel van deze procedure is om RNA met hoge integriteit te isoleren van het ribonucleaserijke muizenpancreas. Dit wordt bereikt door snel het pancreas uit het karkas van een geëuthaniseerde muis te verwijderen. Vervolgens wordt het pancreas ondergedompeld in lysisreagens en wordt het weefsel gehomogeniseerd.Na centrifugatie wordt het RNA geïsoleerd uit het supernatant met behulp van standaardprotocollen en wordt RNA-remmeroplossing toegevoegd aan de uiteindelijke RNA-oplossing. De laatste stap is om de homogenisatorbladen zorgvuldig te reinigen door alle stukken weefsel die in de bladen vastzitten te verwijderen en vervolgens een reeks ethanol- en waterwassen uit te voeren. Uiteindelijk maakt deze procedure het mogelijk om RNA voor muizenpancreas met een RNA-integriteitsnummer groter dan zeven te isoleren voor gebruik in routinematige genexpressieanalyse.Mijn naam is Tom Schmid en ik werk al meer dan 20 jaar met RNA, en in al die tijd heb ik nog nooit iets zo moeilijks meegemaakt als het isoleren van RNA met hoge integriteit voor muizenpancreas. De techniek die we je gaan laten zien, is ontwikkeld voor muizenpancreas, maar er is eigenlijk geen reden waarom het niet zou

rna-isolation-from-mouse-pancreas-a-ribonuclease-rich-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Murine eilandjes van Langerhans Isolatie

Een gedetailleerde beschrijving van muis eilandje isolatie wordt beschreven door de techniek van in situ pancreas ductaal infusen en perfusie van een combinatie van gezuiverd collagenase en neutrale protease.

Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Beschrijven we een methode voor de isolatie van de endocriene cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases gevolgd door eencellige RNA sequencing. Met deze methode kunt analyses van de ontwikkeling van de alvleesklier endocriene bloedlijn, cel heterogeniteit en transcriptomic dynamiek.

Eencellige Transcriptomic Analyses van muis alvleesklier endocriene cellen

Hier beschrijven we de immunopreciatie van riosomen en bijbehorend RNA uit geselecteerde populaties volwassen mannelijke muizenkiemcellen met behulp van het RiboTag-systeem. Strategische veredeling en zorgvuldige immunoneerslag resulteren in schone, reproduceerbare resultaten die informeren over het vertalen van de kiemcel en inzicht geven in de mechanismen van gemuteerde fenotypes.

RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

De zuiverheid en integriteit van het geïsoleerde RNA is een essentiële stap in RNA-afhankelijke testen. Hier presenteren we een praktische, snelle en goedkope methode om RNA te extraheren uit een kleine hoeveelheid onbeschadigd alvleesklierweefsel.

Snelle en kosteneffectieve RNA-extractie van rattenlelfum

Dit protocol beschrijft de isolatie van endotheelcellen van muizen uit de hele alvleesklier.

Isolatie van endotheelcellen van de pancreas van muizen

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Leer RNA-isolatie van ribonuclease-rijk muizenpancreas met behoud van hoge integriteit. Deze methode levert RNA met een integriteitsgetal boven zeven, geschikt voor genexpressieanalyse en QPCR-toepassingen.

RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Meer video's verkennen