Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen
8 augustus 2014
Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.
Het algemene doel van deze procedure is om thymische epitheelcellen of tech te isoleren, identificeren en zuiveren. Dit wordt bereikt door de thymus eerst enzymatisch te verteren en mechanisch te verstoren om de tech te dissociëren in een enkele celsuspensie. Vervolgens kan de tech worden geanalyseerd door flowcytometrie of verrijkt via een panning-strategie.
Uiteindelijk kunnen thymische epitheelsubpopulaties worden gezuiverd door middel van fluorescentie geactiveerde celsortering. Deze methode kan helpen om veel belangrijke vragen op het gebied van T-celontwikkeling te beantwoorden, zoals: hoe bevorderen thymische epitheelcellen thymische selectie? Wat veroorzaakt thymische disfunctie bij oudere dieren en hoe kunnen we T-celreconstitutie in vitro bereiken?
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de hoge herstel van variabele emmische kiemcellen, de onbevooroordeelde verrijking van de emmische epitheelcellen en de hoge zuiverheid die uiteindelijk kan worden bereikt door celsortering. Om thymische stromale cellen te isoleren, identificeer eerst de thymus, die net onder de ribben ligt en eruitziet als twee dunne witte lobben boven het hart. Vervolgens ontkoppelt u het bindweefsel rond de thymus en gebruikt u gebogen gekartelde forceps om voorzichtig de thymische lobben los te trekken en te verwijderen.
Plaats de lobben in een zes-putjesplaat met vijf milliliter medium en verwijder eventueel omliggend vet en bindweefsel. Breng vervolgens de bijgesneden lobben over naar een nieuwe put met vijf milliliter vers bereide enzymoplossing en maak met fijne schaar kleine incisies in het weefsel. Plaats de plaat in een incubator van 37 graden Celsius.
Na 20 minuten pipetteert u het weefsel voorzichtig een paar keer op en neer met een vijf milliliter pipette om de slurry te dissociëren in een enkele celsuspensie. Verzamel de supernatantfractie in een 50 milliliter buis met 10 milliliter koude albuminerijke buffer op ijs om de enzymen te neutraliseren. Voeg vervolgens 2,5 milliliter enzymoplossing toe aan het resterende weefsel.
Incubeer de plaat gedurende 15 minuten. Daarna schudt u het weefsel voorzichtig met een drie milliliter spuit voorzien van een 18-gen naald om eventuele aggregaten te breken. Breng vervolgens het over naar de opvangbuis.
Voeg vervolgens 2,5 milliliter enzymoplossing toe aan het resterende weefsel. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten. Na de derde incubatie herhaalt u de mechanische agitatie met een 20 5G-naald.
Nadat u het weefsel gedurende een laatste vijf tot tien minuten heeft geïncubeerd, brengt u het supernatant over naar de opvangbuis voor centrifugatie om de herstelde tech te identificeren door flowcytometrie. Volg standaard antilichaamkleuringsprocedures, laat de monsters lopen op een multiparameter flowcytometer en analyseer de gegevens met behulp van de juiste faxanalysesoftware om de tech verder te verrijken door de panning-methode. Incubeer eerst de cellen met het juiste antilichaam voor de verrijking. Voeg vervolgens de celsuspensie toe aan een vooraf gecodeerde panningplaat en draai de plaat vervolgens rond en incubeer op kamertemperatuur.
Na 30 minuten draait u de plaat krachtig rond en brengt u het supernatant over naar een kegelbuis. Spoel de plaat twee keer af met vers medium en verzamel de wasbeurten in de opvangbuis. Na het centrifugeren van de cellen, resuspendeert u het pellet in vijf milliliter vers medium en brengt u de celsuspensie over naar een nieuwe panningplaat, waarbij u de cellen verzamelt na het ronddraaien en incuberen zoals zojuist is gedemonstreerd om de verrijkte tech verder te zuiveren in hun thymische celsubpopulaties.
Na het labelen met de juiste antilichamen, sorteert u de tech door een 100 micrometer mondstuk door middel van fluorescentie geactiveerde celsortering en verzamelt u de cellen in 30% volume per volume FBS in medium. In deze representatieve gatingstrategie voor het identificeren van tech door flowcytometrie kan de expressie van epca, maar niet CD 45 door de tech worden waargenomen. Daarom kan tech worden gesorteerd op basis van hun ep, camm en CD 45 expressie. Tech bestaat uit corticale of CEC en medullaire of mtech thymische epitheelsubpopulaties.
Deze subpopulaties kunnen worden onderscheiden door het live 51 antilichaam, dat G glutamyl aminopeptidase herkent die wordt geexpresseerd door ctec en de lectine UEA een, die bindt aan mtech. Zowel ctech als Mtech drukken MHC Klasse twee uit op hun oppervlakken. Hoewel mtech verder kan worden onderverdeeld in mtech laag en mtech hoog populaties, afhankelijk van hun niveau van MHC twee expressie, kan ongeveer acht keer meer tech worden teruggewonnen met behulp van het zojuist gedemonstreerde liase-enzymgebaseerde protocol vergeleken met een protocol met collageenase en schijfruimte met ongeveer negen keer 10 tot de vijfde, terug te winnen uit slechts een muis thymus om de sorteertijd te verkorten en de levensvatbaarheid van de teruggewonnen stromale cellen te verhogen. Panning kan worden gebruikt zoals zojuist is gedemonstreerd om de thymocytensites te verminderen in vergelijking met volledige bereide thymuscellen.
De verhouding van tech neemt toe van minder dan 0,5%tot meer dan 15%in de post-verrijkte celpopulatie. Na het panning, zijn de verhoudingen van de tech subpopulaties niet veranderd, wat suggereert dat geen van beide subpopulaties selectief verloren gaat tijdens het panning. In vergelijking met het voorbereidende verrijkingsmonster, is de herstelratio van tech ongeveer 85%. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de mic germ cellen kunt verrijken van meer dan door panic, evenals hoe u meer themic epitheelsubpopulaties kunt identificeren en zuiveren door middel van flowcytometrie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren, identificeren en zuiveren van epitheliale cellen uit de thymus van muizen (TECs). Het protocol is ontworpen om onderzoek naar thymusfunctie, T-cel ontwikkeling en thymusdisfunctie te vergemakkelijken.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Thymus Functie
Achtergrond
- Epitheliale cellen van de thymus spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van T-cellen.
- Begrip van TECs kan inzicht geven in thymische selectieprocessen.
- Thymusdisfunctie wordt geassocieerd met veroudering en verschillende ziekten.
- Reconstitutie van T-cellen is essentieel voor therapeutische strategieën.
Doel van het Onderzoek
- Om TECs te isoleren en zuiveren voor gedetailleerde analyse.
- Om de mechanismen van thymische selectie te onderzoeken.
- Om oorzaken van thymusdisfunctie bij veroudering te verkennen.
Gebruikte Methoden
- Enzymatische vertering en mechanische disrupatie van de thymus.
- Flowcytometrie voor analyse van TECs.
- Panning strategie voor verrijking van TECs.
- Fluorescentie-geactiveerde celsortering voor zuivering van TEC subsets.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie en zuivering van TECs.
- Identificatie van belangrijke TEC subsets betrokken bij T-cel ontwikkeling.
- Inzicht in thymische selectiemechanismen.
- Mogelijke implicaties voor T-cel reconstitutie therapieën.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het bestuderen van TECs.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van thymusfunctie en -disfunctie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op dit protocol om T-cel ontwikkeling te verkennen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
